用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物及其應用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物，活性成分為甲基-β-環(huán)糊精和吐溫-80。本發(fā)明還提供制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，宿主細胞在接種豬圓環(huán)病毒2型之前，采用所述組合物處理1-6h。本發(fā)明用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物，能夠顯著提高豬圓環(huán)病毒2型對PK-15細胞的感染效率。本發(fā)明制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，僅僅經(jīng)過5代培養(yǎng)，每毫升病毒液的滴度就達到了107.5TCID50。
【專利說明】用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物 及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒（porcinecircovirus，PCV)是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的病毒，無囊膜、基因 組為單股環(huán)狀DNA。豬圓環(huán)病毒分PCVl和PCV2(豬圓環(huán)病毒2型）兩個血清型，其中，PCVl 對豬沒有致病性。上世紀90年代初，從斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（PMWS)中分離PCV2， PCV2自出現(xiàn)起即被認為是危害世界養(yǎng)豬業(yè)重要的病原?，F(xiàn)已證明PCV2還可以造成育肥豬 皮炎腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy sdrome, F1DNShPCV^相關(guān)性繁殖 障礙、豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC)和先天性震顫 (congenital tremors, CT)等疾病。現(xiàn)將PCV2所引起的各種疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)相關(guān)性疾病 (PCVAD)。
[0003] 隨著商品化PCV2疫苗的成功使用，PCVAD得到有效控制。無論在商業(yè)化的養(yǎng)殖場， 還是在實驗條件下，商品化的PCV2疫苗均能有效保護PCV2的感染。由于PCV2在PK-15細 胞系復制效率較低，因此市售疫苗抗原采用在PK-15細胞接毒后多次傳代的方法不斷提高 病毒滴度，并伴隨使用刺激劑。即便如此，大部分PCV2疫苗滅活前疫苗抗原含量也僅僅能 達到10 6_°TCID5(l/mL左右。這嚴重制約了疫苗的產(chǎn)量，并使疫苗的價格顯著上升，為研制高 效、經(jīng)濟的PCV2疫苗帶來了障礙。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物，能夠顯著提高 豬圓環(huán)病毒2型對PK-15細胞的感染效率。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，僅僅經(jīng)過5代培養(yǎng)， 每暈升病毒液的滴度就達到了 i〇7_5tcid5(i。
[0006] 本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0007] 用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物，活性成分為甲基-β -環(huán)糊精和吐 溫-80。
[0008] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述組合物中甲基-β -環(huán)糊精的濃度為I. 0-4g/L，吐溫-80 的體積濃度為〇. 5-5ml/L。
[0009] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述組合物還含有MEM培養(yǎng)基。
[0010] 一種制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，宿主細胞在接種豬圓環(huán)病毒2型之前，采 用權(quán)利要求1-3之一所述組合物處理l_6h。
[0011] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述宿主細胞為PK-15細胞。
[0012] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述宿主細胞采用所述組合物處理后，棄去所述組合物，接種 豬圓環(huán)病毒2型，進行病毒的細胞培養(yǎng)。
[0013] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述豬圓環(huán)病毒2型的傳代次數(shù)為4-6次，每代培養(yǎng)時間為 40-80小時。
[0014] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述傳代比例為1:2-4。
[0015] 本發(fā)明用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物，能夠顯著提高豬圓環(huán)病毒2 型對PK-15細胞的感染效率，價格低廉。
[0016] 本發(fā)明制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，僅僅經(jīng)過5代培養(yǎng)，每毫升病毒液的滴 度就達到了 IO7 5TCID5tl。該方法顯著降低了人力和疫苗成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1.不同刺激物刺激PK-15細胞后PCV2DBN-SX07株感染效率間接免疫熒光圖 片.其中A :陰性對照孔的間接免疫熒光圖片；B :陽性對照孔的間接免疫熒光圖片；C :刺激 物Bl處理孔的間接免疫熒光圖片；D :刺激物B2處理孔的間接免疫熒光圖片；E :刺激物B3 處理孔的間接免疫熒光圖片；F :刺激物Al處理孔的間接免疫熒光圖片；G :刺激物A2處理 孔的間接免疫熒光圖片；H :刺激物A3處理孔的間接免疫熒光圖片；I :刺激物Cl處理孔的 間接免疫熒光圖片J :刺激物C2處理孔的間接免疫熒光圖片；K :刺激物C3處理孔的間接 免疫熒光圖片。
[0018] 圖2.實施例3中各方法獲得的第3代和第5代細胞培養(yǎng)物中陽性細胞間接免疫 熒光圖片。Control為未刺激PK-15細胞后接毒第3代和第5代細胞培養(yǎng)物中陽性細胞間 接免疫熒光圖片；Al、A2或A3分別為刺激物Al、A2或A3刺激PK-15細胞后制備的第3代 和第5代細胞培養(yǎng)物中陽性細胞間接免疫熒光圖片；B1、B2或B3分別為刺激物B1、B2或B3 刺激PK-15細胞后制備的第3代和第5代細胞培養(yǎng)物中陽性細胞間接免疫熒光圖片；C1、C2 和C3分別為刺激物C1、C2、C3刺激PK-15細胞后制備的第3代和第5代細胞培養(yǎng)物中陽性 細胞間接免疫熒光圖片。

【具體實施方式】：
[0019] 本發(fā)明組合物能夠提高PCV2感染效率，本發(fā)明中以PCV2DBN-SX07株為例。 PCV2DBN-SX07株（Genbank NO. :FJ660968)公開于豬圓環(huán)病毒2型毒株分離鑒定和體外增 殖特性研究[J]，王貴華等，中國畜牧獸醫(yī)2012年第39卷第一期，17?22。
[0020] D-氣基甸萄糖、吐溫-80 (Tween-80)和甲基環(huán)糊精 (Methyl-beta-cyclodextrin，縮寫 MPCD)購自 CRODA 和 Sigma。
[0021] MEM培養(yǎng)基購自Gibco。
[0022] PBS緩沖液（磷酸鹽緩沖液）：是含有137mM氯化鈉、2. 7mM氯化鉀、IOmM磷酸二氫 鈉和2mM磷酸二氫鉀的水溶液。
[0023] PBST緩沖液：含0· 5%。（體積濃度）Tween-20的PBS緩沖液。
[0024] PK-15 細胞系（ATCC, American Type Culture Collection)，接毒前在含血清 MEM 培養(yǎng)基中逐步傳代克隆以去除PCVl污染。
[0025] MOI (multiplicity ofinfection):感染復數(shù)。
[0026] 實施例1本發(fā)明組合物提高PCV2對PK-15細胞的感染效率
[0027] 1.刺激物的篩選
[0028] 在MEM培養(yǎng)基中添加不同濃度Tween_8O、M0⑶配制刺激物，考察這兩種物質(zhì)單獨 或者共同刺激PK-15細胞，對PCV2病毒感染效率的影響，刺激物中T Ween-80、Mi3 CD的含量 如表1所示。
[0029] 表1刺激物中Tween-80、Mβ CD的含量

【權(quán)利要求】
1. 用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物，活性成分為甲基-0 -環(huán)糊精和吐 溫-80。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物，其特征在于所述 組合物中甲基-0 -環(huán)糊精的濃度為1. 〇_4g/L，吐溫-80的體積濃度為0. 5-5ml/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述用于提高豬圓環(huán)病毒2型感染效率的組合物，其特征在于 所述組合物還含有MEM培養(yǎng)基。
4. 一種制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，其特征在于宿主細胞在接種豬圓環(huán)病毒2 型之前，采用權(quán)利要求1-3之一所述組合物處理l_6h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述宿主細胞 為PK-15細胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述宿主細胞 采用權(quán)利要求1-3之一所述組合物處理后，棄去所述組合物，接種豬圓環(huán)病毒2型，進行病 毒的細胞培養(yǎng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述豬圓環(huán)病 毒2型的傳代次數(shù)為4-6次，每代培養(yǎng)時間為40-80小時。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述制備豬圓環(huán)病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述傳代比例 為 1:2-4。
【文檔編號】C12N7/00GK104404002SQ201410766884
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】華濤, 侯繼波, 張雪花, 馮磊, 陳麗, 吳培培, 張道華, 唐波 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院