一種穩(wěn)定高產(chǎn)脂肪酶的黑曲霉突變菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定、高產(chǎn)脂肪酶的黑曲霉突變菌株，其保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2014584。本發(fā)明采用紫外誘變的方法獲得一株突變菌株黑曲霉CALB7-7，該菌株能穩(wěn)定、高效重組表達(dá)脂肪酶CALB，其發(fā)酵酶活高達(dá)210U/mL，比出發(fā)菌提高了75％。此外，該突變菌株重組表達(dá)的脂肪酶CALB的最適作用溫度為45℃，最適作用pH值為7.0，與出發(fā)菌株相同，脂肪酶CALB的酶學(xué)性質(zhì)未發(fā)生改變。因此，該突變菌株可有效應(yīng)用于脂肪酶CALB的發(fā)酵生產(chǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)脂肪酶CALB在工業(yè)領(lǐng)域的廣泛使用。CCTCC NO: M 201458420141121
【專利說明】一種穩(wěn)定高產(chǎn)脂肪酶的黑曲霉突變菌株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物誘變篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種穩(wěn)定高效表達(dá)脂肪酶的黑曲 霉（Asperillus niger)突變菌株。

【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶（E.C. 3. 1. 1.3)又名甘油酯水解酶、三?；视王；饷?，是一類可以 水解甘油三酯產(chǎn)生不同鏈長游離脂肪酸和甘油的水解酶。從催化特性看，它具有高度的化 學(xué)選擇性和立體異構(gòu)性，且反應(yīng)不需輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。脂肪酶的一個(gè)顯著特 征是它不同于多數(shù)水解酶的催化特性，它是一類非水相酶，其催化反應(yīng)是在油水界面上進(jìn) 行，對(duì)于水溶性底物不起催化作用。因此脂肪酶廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成當(dāng)中，已成為市場(chǎng)上的 第三大工業(yè)用酶。
[0003] 1994 年 Uppenberg et al.公布了脂肪酶 CALB (Candida Antarctica Lipase B) 的氨基酸序列和三維（3D)結(jié)構(gòu)。所述3D結(jié)構(gòu)可以在結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（RCBS PDB) (http://www.rcsb. org/)中找到，其識(shí)別號(hào)為1TCA。該酶具有寬廣的底物譜，可催化 底物的酯化、醇解、酸解、酯交換等反應(yīng)，用于手性胺、手性醇等中間體的催化合成方面。具 有方法簡(jiǎn)單、條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物價(jià)值高的優(yōu)點(diǎn)。但目前國外酶制劑企業(yè)壟斷經(jīng)營的 脂肪酶CALB表達(dá)量普遍較低，因此價(jià)格居高不下，不適合其在催化領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。在 我國乃至世界精細(xì)化學(xué)品、中間體生產(chǎn)的工業(yè)化過程中，急需獲得酶活單位高，生產(chǎn)成本低 廉的工業(yè)化脂肪酶生產(chǎn)菌株。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定、高產(chǎn)脂肪酶的黑曲霉突變菌株，本發(fā)明將構(gòu)建得 到的重組表達(dá)脂肪酶CALB的黑曲霉工程菌株進(jìn)行紫外誘變和突變篩選，從而獲得了一株 穩(wěn)定性好、脂肪酶產(chǎn)量高的黑曲霉突變株，為脂肪酶CALB的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，從而 彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明一方面提供了一株突變菌黑曲霉CALB7-7 (Aspergillus niger CALB7-7)， 已于2014年11月21日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2014584。
[0006] 上述的突變菌黑曲霉CALB7-7,是將轉(zhuǎn)化有攜帶編碼脂肪酶基因的重組質(zhì)粒的黑 曲霉菌株進(jìn)行紫外誘變獲得的；
[0007] 所述的脂肪酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2 ;其編碼基因的序列為SEQ ID NO: 1。
[0008] 本發(fā)明的黑曲霉CALB7-7用于生產(chǎn)脂肪酶。
[0009] 本發(fā)明采用紫外誘變的方法獲得一株突變菌株黑曲霉CALB7-7,該菌株能穩(wěn)定、高 效重組表達(dá)脂肪酶CALB，其發(fā)酵酶活高達(dá)210U/mL，比出發(fā)菌提高了 75%。此外，該突變菌 株重組表達(dá)的脂肪酶CALB的最適作用溫度為45°C，最適作用pH值為7. 0,與出發(fā)菌株相 同，脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)未發(fā)生改變。因此，該突變菌株可有效應(yīng)用于脂肪酶CALB的發(fā)酵生 產(chǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)脂肪酶CALB在工業(yè)領(lǐng)域的廣泛使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖I :12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析圖譜；
[0011] 其中泳道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記；泳道1所示為對(duì)照宿主菌黑曲霉Gl發(fā)酵上 清液中蛋白表達(dá)情況；泳道2所示為出發(fā)菌黑曲霉Cll發(fā)酵上清液中蛋白表達(dá)情況；泳道 3-10所示為8株突變菌發(fā)酵上清液中蛋白表達(dá)情況，箭頭所指33kDa處的蛋白條帶即為重 組表達(dá)的脂肪酶CALB。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí) 驗(yàn)方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例 更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不僅限于所提供的具體案 例，而應(yīng)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書基礎(chǔ)上，不需經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)就能擴(kuò)展的保護(hù)范 圍。
[0013] 實(shí)施例1脂肪酶基因的合成及擴(kuò)增
[0014] 根據(jù)NCBI公布的脂肪酶CALB的基因序列（GeneBank Z30645. 1)，在其起始密碼子 ATG前增加8個(gè)堿基TCTAGAGC (下劃線所示為XbaI酶切位點(diǎn)），在其終止密碼子TGA后增 加9個(gè)堿基CCGCTCGAG(下劃線所示為XhoI酶切位點(diǎn)），然后將此序列根據(jù)黑曲霉密碼子偏 好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列為SEQ ID N0:1，并由南京金斯瑞生物科技有限公 司合成。
[0015] 用限制性內(nèi)切酶XbaI和XhoI (Fermentas)對(duì)脂肪酶基因進(jìn)行酶切；同時(shí)，用限制 性內(nèi)切酶XbaI和XhoI對(duì)質(zhì)粒TpGM進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化，并用 T4DNA連接酶（Fermentas)將上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5a大腸桿菌， 用氨芐青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確，對(duì)若干克隆進(jìn)行測(cè)序（Invitrogen)，測(cè)序結(jié)果顯示獲 得的DNA序列為SEQ ID NO: 1，其編碼的蛋白序列為SEQ ID NO: 2。
[0016] 使用質(zhì)粒小量制備試劑盒（Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì) 粒。獲得1個(gè)重組質(zhì)粒為TpGM-calb。
[0017] 實(shí)施例2黑曲霉工程菌株的構(gòu)建
[0018] 吸取黑曲霉Gl孢子懸浮液于PDA平板，待菌落長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，切1/4大小的培 養(yǎng)基于200mL CMA液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下培養(yǎng)14?16h。
[0019] 用無菌Miracloth濾布收集菌絲體，并用溶液A清洗一次，在無菌條件下將清洗過 的菌絲體轉(zhuǎn)移到40mL原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化溶液中，在30°C、200rpm的條件下溫浴2?3h，顯微鏡 觀察原生質(zhì)體以確保裂解完全。
[0020] 用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質(zhì)體溶液。將原生 質(zhì)體溶液分裝于兩個(gè)50mL -次性無菌離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45mL，在 3000rpm條件下離心IOmin以獲得沉淀并棄去上清液。用20mL溶液B再次懸浮并清洗沉淀 兩次。將沉淀重懸于IOmL溶液B中，并用血球計(jì)數(shù)板對(duì)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。將原生質(zhì)體再次離 心并棄去上清液，根據(jù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質(zhì)體數(shù)目 在 IX IO7個(gè)/mL。
[0021] 在冰上，將200 μ L上述原生質(zhì)體溶液加入預(yù)冷的無菌15mL離心管中，每個(gè)轉(zhuǎn)化 反應(yīng)用1管，再加入10 μ g突變體重組質(zhì)粒TpGM-calb，50 μ L溶液C，溫和混勻后冰上放置 20min〇
[0022] 將麗SA頂層瓊脂糖融化并保持在55°C。從冰中移出上述15mL離心管，并向管中 加入2mL溶液C，室溫靜置5min后加入4mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質(zhì) 體混合物。向頂層瓊脂培養(yǎng)基中加入上述原生質(zhì)體混合物，并立即混勻后傾倒于MMSA平板 上，室溫靜置待凝固后將平板在30°C下培養(yǎng)7?10d。
[0023] 溶液 A :2. 5mL IM Κ2ΗΡ04,2· 5mL IM ΚΗ2Ρ04,48· 156g MgSO4,加入 dlH20 至終體積 500mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0024] 溶液 B :5mL IM Tris(pH 7. 5)，2. 77g CaCl2,109. 32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積 500mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0025] 溶液 C :250g PEG 4000,2· 77g CaCl2,5mL IM Tris(pH 7. 5)，加入 dlH20 至終體積 500mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0026] CMA培養(yǎng)基：20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體 積1000mL，高壓蒸氣滅菌。
[0027] 實(shí)施例3黑曲霉工程菌株發(fā)酵驗(yàn)證及酶活測(cè)定
[0028] 質(zhì)粒TpGM-calb通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入黑曲霉宿主菌Gl中，得到23個(gè)黑曲霉 轉(zhuǎn)化子（分別命名為C1，C2，C3，……，C23)。將上述轉(zhuǎn)化子接種至PDA固體平板上進(jìn)行富 集活化，在30°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5-6d。從所述23個(gè)轉(zhuǎn)化子PDA孢子平板上割取約 4cm 2的菌塊切碎接種至50mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d ;將所得 發(fā)酵液在8500rpm條件下離心lOmin，收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠 上進(jìn)行電泳，同時(shí)以宿主菌黑曲霉Gl的發(fā)酵上清液作為對(duì)照。電泳結(jié)果顯示，本發(fā)明構(gòu)建 得到的轉(zhuǎn)化子 C7、C9、C10、Cll、C15、C16、C17、C19、C20、C21、C22、C23 在 33kD 處都有明顯 的蛋白條帶，與本發(fā)明所述脂肪酶CALB的理論分子量一致，而對(duì)照宿主菌黑曲霉Gl所在泳 道中33kD處無明顯的蛋白條帶，從而說明上述陽性轉(zhuǎn)化子均能重組表達(dá)脂肪酶CALB。
[0029] 挑選其中脂肪酶蛋白表達(dá)量較高的五個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子C10、Cll、C16、C17和C20,分 別測(cè)定其發(fā)酵上清液的脂肪酶酶活，同時(shí)以宿主菌黑曲霉Gl的發(fā)酵上清液作為對(duì)照。結(jié)果 顯示，宿主菌黑曲霉Gl的發(fā)酵上清液中未檢測(cè)出脂肪酶酶活，而陽性轉(zhuǎn)化子黑曲霉Cll的 發(fā)酵上清液中脂肪酶酶活為120U/mL，從而說明黑曲霉Cll能重組表達(dá)脂肪酶CALB。
[0030] 脂肪酶酶活力測(cè)定方法
[0031] 根據(jù)《GB/T 23535脂肪酶制劑》所述方法檢測(cè)黑曲霉發(fā)酵液酶活，酶活力定義：lg 固體酶粉（或ImL液體酶），在30°C，pH8. 0的條件下，Imin水解三丁酸甘油酯產(chǎn)生1 μ mol 的可滴定的脂肪酸，即為一個(gè)酶活力單位，以U/g(U/ml)表示。
[0032] 實(shí)施例4紫外誘變與篩選
[0033] 4. 1紫外誘變方法
[0034] (1)將上述構(gòu)建得到的黑曲霉Cll作為出發(fā)菌株，將其接種到PDA固體平板上活 化，在30°C下培養(yǎng)5d;
[0035] (2)用棉簽刮取平板上的孢子溶于20ml無菌水中制得新鮮孢子懸液，吸取IOul置 于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋孢子懸液至孢子數(shù)目約為IO 6個(gè)/ml左右；
[0036] (3)吸取15ml稀釋后的孢子懸液置于d = 9cm培養(yǎng)皿中，在紫外燈9w、照射距離 22cm進(jìn)行誘變，分別在照射時(shí)間3min、4min、5min、6min、7min、8min、IOmin時(shí)取樣lml，篩選 合適的照射條件，使致死率達(dá)到95%。
[0037] (4)紫外照射完畢后，將誘變后的孢子懸液稀釋1000倍至103,吸取稀釋后的孢子 懸液涂布PDA平板，每個(gè)PDA平板涂IOOul，每個(gè)時(shí)間梯度涂布三個(gè)平板。另外不經(jīng)紫外照 射的孢子懸液稀釋至IO 2個(gè)，吸取IOOul同樣涂布三個(gè)PDA平板作為誘變前對(duì)照，在30°C下 避光培養(yǎng)35-40h。根據(jù)平板上平均長出的菌落數(shù)計(jì)算達(dá)到95%致死率所需的紫外照射時(shí) 間，結(jié)果，選取7min作為合適的紫外照射時(shí)間。
[0038] (5)結(jié)合上述優(yōu)化后的紫外誘變條件，新鮮孢子液經(jīng)照射后稀釋1000倍，吸取 IOOul涂布PDA平板，共涂布60個(gè)平板，在30°C下避光培養(yǎng)35-40h。待菌落未長孢子之前， 挑取平板上長出的個(gè)體形態(tài)小、菌絲濃密且緊實(shí)的突變菌落，于另一 PDA平板上點(diǎn)種富集， 富集活化平板在30°C下培養(yǎng)3-4d ;
[0039] 4. 2突變菌株的篩選
[0040] 1、初篩
[0041] 根據(jù)PDA平板上誘變菌株的生長情況，挑選長勢(shì)相近的誘變菌株分批進(jìn)行發(fā)酵表 達(dá)，同時(shí)以出發(fā)菌株黑曲霉Cll作對(duì)照。發(fā)酵采用一步搖瓶發(fā)酵法：將黑曲霉誘變菌株割取 約4cm2菌絲塊切碎后分別接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株接1瓶，在30°C，200rpm的 條件下培養(yǎng)5d ;將所得發(fā)酵液在8500rpm條件下離心lOmin，收集上清液；將上清液在濃度 為12%的SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，通過觀察比較脂肪酶重組蛋白條帶的表達(dá)量，挑選出 8株脂肪酶表達(dá)量明顯高于出發(fā)菌的突變菌株。
[0042] 上述8株突變菌發(fā)酵上清液的12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析圖譜如圖1所示：泳道 1所述宿主菌黑曲霉Gl的發(fā)酵上清液在33kD處無明顯的蛋白條帶，泳道2所述出發(fā)菌黑曲 霉Cll發(fā)酵上清液和泳道3-10所述8株突變菌株的發(fā)酵上清液，在33kD處均有明顯的蛋 白條帶，且泳道3-10的蛋白條帶比泳道2的蛋白條帶更粗，顏色更深，從而說明上述得到的 8株突變菌仍能有效的重組表達(dá)脂肪酶CALB，且脂肪酶CALB的表達(dá)量顯著高于出發(fā)菌。
[0043] 2、復(fù)篩
[0044] 將挑選出的8株突變菌株再次進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，同時(shí)以出發(fā)菌株黑曲霉Cl 1作對(duì)照。 發(fā)酵采用兩步搖瓶發(fā)酵法：將黑曲霉誘變菌株的孢子懸浮液接種于50ml發(fā)酵培養(yǎng)基（檸檬 酸三鈉·2Η 20(10% )、（NH4)2S04(2. 1% )、NaH2P04 . Η20(0· 15% )、Tween 80(0. 15% )、胰蛋 白胨大豆肉湯（6.4%)、微量元素（0.15%)、無水0&(：12(0.08%)、]\%50 4.7!120(0.15%)、 40%麥芽糖（30%)。定容至1L，高壓蒸氣滅菌）中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)48h;然 后按1〇%接種量，吸取51111培養(yǎng)液菌體接種于5〇1^發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°0,200印111的條件 下培養(yǎng)5d ;將所得發(fā)酵液在8500rpm條件下離心lOmin，收集上清液。
[0045] 將上述8株突變菌株的發(fā)酵上清液分別進(jìn)行脂肪酶酶活測(cè)定，最終挑選出一株脂 肪酶CALB表達(dá)量最高的突變菌株，其發(fā)酵上清液的脂肪酶酶活為210U/mL，比出發(fā)菌提高 了 75%。
[0046] 申請(qǐng)人:將該突變菌株命名為黑曲霉CALB7-7 (Aspergillus niger CALB7-7)，并已 于2014年11月21日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCT CC NO :M2014584。
[0047] 實(shí)施例4酶學(xué)性質(zhì)分析
[0048] 1、最適作用pH值
[0049] 分別配制pH值為7. 0、8. 0、9. 0、10. 0、11. 0、12. 0、13. 0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖 液。將突變菌株黑曲霉CALB7-7和出發(fā)菌株黑曲霉Cll的發(fā)酵上清液分別用上述緩沖液稀 釋至合適的濃度，然后按照GB/T 23535所述方法測(cè)定發(fā)酵上清液中重組脂肪酶的酶活力。 以原始酶活為100%，計(jì)算不同PH條件下重組脂肪酶的相對(duì)酶活。結(jié)果顯示，突變菌株黑曲 霉CALB7-7和出發(fā)菌株黑曲霉Cll發(fā)酵上清液中重組脂肪酶相對(duì)酶活-pH變化曲線相同， 最適作用pH均為7.0。
[0050] 2、最適作用溫度
[0051] 將突變菌株黑曲霉CALB7-7和出發(fā)菌株黑曲霉Cll的發(fā)酵上清液用上述pH7.0 的緩沖液稀釋至合適的濃度，按照制造商的說明書，分別在25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、 50°C、55°C、60°C條件下，按照GB/T 23535所述方法測(cè)定發(fā)酵上清液中重組脂肪酶的酶活 力。以原始酶活為100%，計(jì)算不同溫度條件下重組脂肪酶的相對(duì)酶活。結(jié)果顯示，突變菌 株黑曲霉CALB7-7和出發(fā)菌株黑曲霉Cll發(fā)酵上清液中重組脂肪酶相對(duì)酶活-溫度變化曲 線相同，其最適作用溫度均為45°C。
[0052] 綜上所述，突變后的黑曲霉CALB7-7重組表達(dá)的脂肪酶CALB的酶學(xué)性質(zhì)與突變前 相同，最適作用pH均為7. 0,最適作用溫度均為45°C。
【權(quán)利要求】
1. 一株黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉的保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2014584。
2. 權(quán)利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉是將轉(zhuǎn)化有用于表達(dá)脂肪酶 的重組質(zhì)粒的黑曲霉菌株進(jìn)行紫外誘變獲得的。
3. 如權(quán)利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的脂肪酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0:2〇
4. 如權(quán)利要求3所述的黑曲霉，其特征在于，所述的脂肪酶，其編碼基因的序列為SEQ ID N0:l〇
5. 權(quán)利要求1所述的黑曲霉在生產(chǎn)脂肪酶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/20GK104480028SQ201410777845
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】宋清清, 徐曉東, 徐娟, 吳佳鵬, 黃亦鈞, 王華明 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司