流感病毒h5n1亞型和h7n9亞型的液相芯片檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及流感病毒H5N1和H7N9亞型的液相芯片檢測試劑盒。本發(fā)明提供了檢測流感病毒表面血凝素抗原H5和H7亞型的引物對和探針，用于檢測流感病毒神經(jīng)氨酸酶抗原N1和N9亞型的引物對和探針，以及包括它們的試劑盒及試劑盒的使用方法。本發(fā)明提供的試劑盒具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確性和特異性，且使用簡便快捷，能夠在4小時內(nèi)完成對待測樣品的檢測。經(jīng)試驗證實，該試劑盒檢測陰性樣品未見假陽性；對僅含H7N9亞型或H5N1亞型病毒的樣品檢測呈現(xiàn)100％的檢出率；對同時含有H5N1亞型和H7N9亞型病毒的樣品進行檢測，也能100％的檢出其中含有的H7N9和H5N1病毒。且該試劑盒對含有10個拷貝以上的待測樣品都能進行有效的檢測。
【專利說明】流感病毒H5N1亞型和H7N9亞型的液相芯片檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及流感病毒H5N1亞型和H7N9亞型的液相芯片 檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，其流行特點是傳播迅速，波 及范圍廣。迄今為止，流感病毒已引起四次世界流感大流行，給人類社會的經(jīng)濟及健康造成 了巨大損失。
[0003] 流感病毒屬于正黏病毒科，其基因組為分節(jié)段負(fù)鏈RNA，根據(jù)病毒核衣殼蛋白 (NP)和基質(zhì)蛋白（M)不同可分為甲、乙、丙三種型別，均可感染人。甲、乙型流感病毒是人群 中主要的流行病毒，甲型流感病毒根據(jù)病毒表面血凝素抗原的不同分為16個HA亞型；根據(jù) 神經(jīng)氨酸酶抗原的不同分為9個NA亞型。
[0004] 所有人類的流感病毒都可以引起禽類流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起 人類流感，現(xiàn)在已經(jīng)確認(rèn)能夠感染人的禽流感病毒共有8種，包括H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、 H7N7、H9N2、H10N7、H7N9。其中H5為高致病性。H5N1為衛(wèi)生部新傳染病防治法中規(guī)定報告 的法定傳染病，又稱人感染高致病性禽流感。H5N1病毒自1997年首次感染人類后，在全球 60多個國家肆虐，死亡率高達(dá)60%。2013年2月底H7N9在中國長三角地區(qū)首次出現(xiàn)，2014 年1月末重新來襲，席卷中國12個省市，整個流行期發(fā)現(xiàn)了 347人感染，其中128人死亡， 死亡率高達(dá)35%，而且還有隨時發(fā)生大規(guī)模流行的可能。因此，對流感病毒H7N9亞型做出 早期、快速的實驗室診斷十分迫切。
[0005] 流感病毒的實驗室診斷方法包括病毒細(xì)胞培養(yǎng)、血清學(xué)診斷以及抗原檢測。病毒 通過感染敏感的組織細(xì)胞可以被分離鑒定出來，這可以作為流感病毒感染最直接，最可靠 的依據(jù)。另外，急性期血清較恢復(fù)期血清抗體有4倍增加也是流感病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)。但是 兩者耗時較長，一般來說細(xì)胞培養(yǎng)需要3d?4d，血清學(xué)檢查需要半個月。因此，這些方法 無法實現(xiàn)流感病毒的快速診斷?？乖闹苯訖z測包括了對病毒結(jié)構(gòu)蛋白以及核酸的檢測。 病毒結(jié)構(gòu)蛋白的檢測基于抗原抗體的反應(yīng)、偶聯(lián)酶或者化學(xué)生色原或者熒光染料，包括免 疫突光（Immunofluorescence，IF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)。直接或間接免疫熒光試驗的敏感度波動在40 %?100%，特異性在86%? 99%，但是由于需要熒光顯微鏡特殊儀器而限制了其在臨床上的應(yīng)用。在對病毒核酸的檢 測和分型中，出現(xiàn)了很多快速特異的方法。特別是PCR技術(shù)的應(yīng)用，對于流感病毒鑒定和 分型發(fā)揮著越來越大的作用。這些方法如：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（multiplex reverse transcription-PCR，MRT_PCR)、酶免 PCR(PCR-enzyme immunoassay， PCR-EIA)、實時 PCR(real-time PCR，RT-PCR)等都大大的提高了檢測的速度和靈敏度。
[0006] 然而，盡管越來越多的方法用于檢測流感病毒，但尚未有一種方法能夠快速、簡 便、準(zhǔn)確的對流感病毒的各亞型進行區(qū)分。因此建立一種對流感病毒各種型別進行快速鑒 定的方法就十分重要了。
[0007] 液相芯片（Multi-Analyte Suspension Array, MASA)作為一種新型低密度基因芯 片技術(shù)通過懸浮陣列來實現(xiàn)多重檢測。分子反應(yīng)發(fā)生在經(jīng)過顏色編碼的微球體表面。針對 試驗的每一目標(biāo)檢測物都有數(shù)千的核酸（互補鏈）或蛋白（如包被抗體）共價結(jié)合在顏色 編碼的微球體表面。不同的顏色編碼代表不同的檢測物。在懸液中微球體與病人標(biāo)本特異 性地結(jié)合，并加上熒光標(biāo)記。然后，使用多功能流式點陣儀進行檢測，乳膠顆粒首先被微量 液體傳送系統(tǒng)排成單列通過兩束激光，其中紅色判定顆粒的顏色從而決定被測物的特異性 (定性）；綠色測定微粒上的熒光標(biāo)記強度從而給被測物定量。最后，系統(tǒng)軟件會搜集數(shù)據(jù) 并給出經(jīng)分析處理后的結(jié)果。由于分子雜交或免疫反應(yīng)是在懸浮溶液中進行，檢測速度極 快，而且可以在一個微量液態(tài)反應(yīng)體系中同時檢測多達(dá)100個指標(biāo)，因此具有高通量、靈敏 度高、速度快、操作簡便的特點。
[0008] 目前液相芯片技術(shù)已經(jīng)涉及到了生命科學(xué)的各個領(lǐng)域的研究中，包括臨床診斷、 基礎(chǔ)研究、新藥開發(fā)、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督和生物武器防范等。但是液相芯片技術(shù)的靈 敏度和準(zhǔn)確性高度依賴于引物和探針的質(zhì)量，必須保證引物和探針性質(zhì)穩(wěn)定、不產(chǎn)生發(fā)卡 結(jié)構(gòu)或二聚體、產(chǎn)物長度不應(yīng)超過500bp，且要保證不發(fā)生非特異性結(jié)合。盡管這些原則對 于一般引物設(shè)計而言并不復(fù)雜，但是由于流感病毒序列的過于復(fù)雜，目前尚無特異性和準(zhǔn) 確度能夠達(dá)到臨床應(yīng)用要求的液相芯片技術(shù)的引物和探針的報道。因此，設(shè)計高特異性、準(zhǔn) 確度的引物和探針，將液相芯片技術(shù)應(yīng)用于H5N1亞型和H7N9亞型流感病毒的檢測具有十 分重大的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供流感病毒H5N1亞型和H7N9亞型 的液相芯片檢測試劑盒，本發(fā)明提供的試劑盒操作簡單，特異性、準(zhǔn)確度皆較高。
[0010] 本發(fā)明提供了一種檢測流感病毒H5N1亞型和H7N9亞型的試劑盒，包括：引物對 A、引物對B、引物對C和引物對D，以及探針組A、探針組B、探針C和探針D ;
[0011] 引物對A中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:2 所示；
[0012] 引物對B中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:4 所示；
[0013] 引物對C中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:6 所示；
[0014] 引物對D中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:8 所示；
[0015] 探針組A包括如SEQ ID NO: 9?10所示核苷酸序列的2條探針；
[0016] 探針組B包括如SEQ ID NO: 11?12所示核苷酸序列的2條探針。
[0017] 探針C的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0018] 探針D的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0019] 本發(fā)明提供的引物和探針根據(jù)H7N9和H5N1病毒設(shè)計，病毒序列主要來自NCBI和 EBI的核酸數(shù)據(jù)庫，并參考WH0,美國CDC和中國CDC等的相關(guān)資料，經(jīng)實驗證實，本發(fā)明提 供的引物在58°C的退火溫度下，經(jīng)PCR擴增未產(chǎn)生非特異性條帶或引物二聚體條帶，證明 本發(fā)明提供的引物對具有良好的特異性。本發(fā)明提供的探針在43°C的雜交溫度下未產(chǎn)生非 特異性雜交，證明本發(fā)明提供的探針具有良好的特異性。
[0020] 在本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明提供的試劑盒還包括：PCR擴增試劑、探針結(jié)合試劑 或微球雜交試劑。
[0021] 在一些實施例中，PCR擴增試劑包括：PCR預(yù)混液、DNA Ploymerase和CldH2O ;探針 結(jié)合試劑包括：乳膠微球；微球雜交試劑包括：1. 5 X TMC雜交緩沖液。
[0022] 在一些實施例中，本發(fā)明提供的試劑盒還包括藻紅蛋白。
[0023] 本發(fā)明提供的試劑盒具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確性和特異性。經(jīng)試驗證實，用本發(fā)明 提供的試劑盒對不含病毒的陰性樣品檢測未見假陽性產(chǎn)生；對僅含H7N9亞型或H5N1亞型 病毒的樣品檢測呈現(xiàn)100%的檢出率；對同時含有H5N1亞型和H7N9亞型病毒的樣品進行 檢測，檢出率也能達(dá)到100%?？梢?，本發(fā)明提供的試劑盒對流感病毒H7N9亞型或H5N1亞 型的檢測具有良好的準(zhǔn)確性和特異性，且不受其他亞型流感病毒存在的影響。另外，經(jīng)試驗 證實，本發(fā)明提供的試劑盒對含有10個拷貝以上的待測樣品都能進行有效的檢測，說明該 試劑盒具有較高的靈敏度。
[0024] 本發(fā)明提供的試劑盒用于流感病毒H5N1亞型和H7N9亞型的液相芯片法檢測。具 體使用方法包括以下步驟：
[0025] 步驟1 :以待測樣品cDNA為模板，以混合引物，經(jīng)PCR獲得擴增產(chǎn)物；
[0026] 步驟2 :將核苷酸序列如SEQ ID NO: 9?14所示的6條探針分別與乳膠微球結(jié)合， 制得包被微球；
[0027] 步驟3 :將擴增產(chǎn)物與包被微球雜交，染色、檢測熒光信號；
[0028] 混合引物包括核苷酸序列如SEQ ID N0:1?4所示的4條引物，或包括核苷酸序 列如SEQ ID N0:5?8所示的4條引物。
[0029] 在本發(fā)明的實施例中，待測樣品為病毒培養(yǎng)物、動物組織或鼻咽部分泌物。
[0030] 在本發(fā)明的實施例中，PCR的反應(yīng)體系為：
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 檢測流感病毒H5N1亞型和H7N9亞型的試劑盒，其特征在于，包括：引物對A、引物對 B、引物對C和引物對D，以及探針組A、探針組B、探針C和探針D ; 所述引物對A中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:2 所示； 所述引物對B中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:4 所示； 所述引物對C中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:6 所示； 所述引物對D中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示；下游引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO:8 所示； 所述探針組A包括如SEQ ID N0:9?10所示核苷酸序列的2條探針； 所述探針組B包括如SEQ ID NO: 11?12所示核苷酸序列的2條探針； 所述探針C的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示； 所述探針D的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括：PCR擴增試劑、探針結(jié)合試劑或 微球雜交試劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR擴增試劑包括：PCR預(yù)混液、 DNA Ploymerase 和 ddH20。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述探針結(jié)合試劑包括：乳膠微球。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述微球雜交試劑包括：1. 5 X TMAC雜 交緩沖液； 所述I. 5 X TMC雜交緩沖液包括：
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括藻紅蛋白。
7. 如權(quán)利要求1?6任一項所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1 :以待測樣品cDNA為模板，以混合引物，經(jīng)PCR獲得擴增產(chǎn)物； 步驟2 :將核苷酸序列如SEQ ID N0:9?14所示的6條探針分別與乳膠微球結(jié)合，制 得包被微球； 步驟3 :將所述擴增產(chǎn)物與所述包被微球雜交，染色、檢測熒光信號； 所述混合引物包括核苷酸序列如SEQ ID N0:1?4所示的4條引物，或包括核苷酸序 列如SEQ ID N0:5?8所示的4條引物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述待測樣品為病毒培養(yǎng) 物、動物組織、或鼻咽部分泌物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述PCR的退火溫度58°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述染色的溫度為43°C， 時間為15min。
【文檔編號】C12Q1/70GK104388599SQ201410777884
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月15日
【發(fā)明者】許黎黎, 袁靜, 秦川 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所