一種灰兜巴粗多肽的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種灰兜巴粗多肽的制備方法，包括灰兜巴粗蛋白的提取、酶解和純化等步驟。本發(fā)明利用酶來水解灰兜巴粗蛋白，不僅不避免化學(xué)試劑所帶來的毒副作用，而且可以提高灰兜巴多肽的得率。本發(fā)明同時提出了制備的灰兜巴多肽在制備用于降糖的藥物上的應(yīng)用。通過優(yōu)選合適的蛋白酶和酶解條件，本發(fā)明成本低、工藝簡單、周期短、可控性強、產(chǎn)率高，可實現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種灰兜巴粗多肽的制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種灰兜巴粗多肽的制備及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是由于人的機體內(nèi)胰島素絕對或相對分泌不足而引起的人體代謝紊亂一 類終身慢性全身性的代謝性疾病。現(xiàn)在糖尿病嚴(yán)重影響人類的身體健康，全世界每年的糖 尿病患者在不斷地增加并且患病的人群的年齡也在不斷的下降，呈現(xiàn)低齡化趨勢。市場上 有很多治療糖尿病的藥物比如雙胍類藥物、糖苷酶類藥物等，但是人體長期服用這些藥物 會有一定的毒副作用。最近幾年獲得高效、安全的降糖產(chǎn)品成為各國專家研究的熱點。其 中降血糖多肽是天然降糖藥物之一，是生物活性多肽的一種。
[0003] 藏藥灰兜巴是一種洞穴紅蜘蛛用自己的絲作為原材料而建成的巢穴，這種紅蜘蛛 生活在海拔1000米以上的老茶樹林里，它建成的巢穴外形像一個灰色的布袋，穴處依附于 老茶樹的枝干上，而底端則埋藏于洞穴中，并且整個巢穴混雜泥土和枯枝敗葉，因此表面有 較多紅色或黃色的泥土和枯枝敗葉。這種藥有消除、緩解糖尿病癥狀、益氣健脾的功效；能 夠糾正代謝絮亂，防止糖尿病并發(fā)癥，主要用于治療II型糖尿病，因此被大家認(rèn)為是民間 治療糖尿病的最佳偏方?；叶蛋偷闹饕镔|(zhì)是蜘蛛絲，而蜘蛛絲含有大量的絲蛋白。有人 對灰兜巴各種活性成分對II型糖尿病的治療作用進(jìn)行了分析，得到灰兜巴治療II型糖尿 病的主要成分是蛋白質(zhì)成分，但是對具體的起到治療II型糖尿病作用的物質(zhì)沒有進(jìn)行分 析和研究。目前常用的制備多肽的方法是化學(xué)法，此方法存在著反應(yīng)時間長，水解過程不易 控制，且會有化學(xué)試劑的殘留，對人體會產(chǎn)生不良影響，同時可能破壞多肽的生物活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種灰兜巴粗多肽的制備 及其應(yīng)用，通過利用蛋白酶水解灰兜巴蛋白得到的灰兜巴多肽具有較好的降糖作用。
[0005] 技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供一種灰兜巴粗多肽的制備方法，包括 如下步驟：
[0006] (1)灰兜巴粗蛋白的提取：將粉碎灰兜巴原料加入到磷酸緩沖液中浸泡，在超聲 波條件下提取，離心，取上清液并冷凍干燥，得到灰兜巴粗蛋白粉；
[0007] (2)酶解：將步驟（1)得到的灰兜巴粗蛋白粉配制成水溶液，向其加入蛋白酶進(jìn)行 酶解反應(yīng)，得到灰兜巴粗蛋白的酶解液；
[0008] (3)純化：步驟（2)得到的酶解液經(jīng)沸水浴滅酶、離心、微濾，得到的濾液用不同分 子量的超濾離心管進(jìn)行離心處理，將得到的不同分子量的多肽液進(jìn)行濃縮和冷凍干燥，得 到灰兜巴粗多肽。
[0009] 具體地，步驟（1)中，在超聲功率700?900W、超聲時間45-60min、溫度50-60°C、 pH 6-8和液料比（45?60) :lmL/g的條件下提取灰兜巴蛋白，待反應(yīng)結(jié)束后在3000? 5000r/min離心10?20min，上清液濃縮冷凍干燥，冷凍干燥的溫度為-50°C。
[0010] 步驟⑵中，所述的蛋白酶為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù) 合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中的任意一種。
[0011] 步驟⑵中，所述的蛋白酶的用量為4000?6000U/g，灰兜巴粗蛋白濃度為5? 7wt %，酶解的溫度為30?50°C，酶解的時間為2?4h，酶解的pH為6?8。
[0012] 步驟（3)中，沸水浴滅酶的條件為：將酶解液置于沸水浴中保持15?20min,然后 勻速冷卻至室溫，以8000?10000r/min的轉(zhuǎn)速離心15?20min，取上清。
[0013] 步驟（3)中，微濾的條件為過0? 22?0? 65iim的濾膜。
[0014] 步驟（3)中，將微濾液加至15mL裝的超濾膜30KD離心管中，置于離心機內(nèi) 5000-7000rpm離心20-40min，打開超濾管蓋子，用移液槍將超濾膜濾過液與未濾過液各自 吸出，透過超濾膜的濾液再經(jīng)超濾膜為10KD和3KD的離心管分離，得到各組分子量不同的 多肽液，并測定各組份對a-葡萄糖苷酶的抑制率。
[0015] 步驟（3)中，冷凍干燥的溫度為-50°C。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了利用上述制備方法制備出的灰兜巴粗多肽在制備用于降糖 的藥物上的應(yīng)用。
[0017] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用酶來水解灰兜巴粗蛋白，不僅不避免化學(xué) 試劑所帶來的毒副作用，而且可以提高灰兜巴多肽的得率。通過優(yōu)選合適的蛋白酶和酶解 條件，本發(fā)明成本低、工藝簡單、周期短、可控性強、產(chǎn)率高，可實現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1超濾膜分離各分子量的多肽含量及抑制率。

【具體實施方式】
[0019] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0020] 實施例1灰兜巴粗蛋白的提取。
[0021] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 7. 5、超聲功率800W、時間50min、液料比 50 : l(mL/g)和溫度60°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應(yīng)結(jié)束后在3500r/min離心 20min，重復(fù)實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為48. 15%。
[0022] 實施例2灰兜巴粗蛋白的提取。
[0023] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 7、超聲功率700W、時間45min、液料比 55 : l(mL/g)和溫度50°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應(yīng)結(jié)束后在4000r/min離心 15min，重復(fù)實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為49. 61 %。
[0024] 實施例3灰兜巴粗蛋白的提取。
[0025] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 8、超聲功率900W、時間55min、液料比 60 : l(mL/g)和溫度55°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應(yīng)結(jié)束后在5000r/min離心 lOmin，重復(fù)實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為49. 75%。
[0026] 實施例4灰兜巴粗蛋白的提取。
[0027] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 6. 5、超聲功率750W、時間55min、液料比 45 : l(mL/g)和溫度55°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應(yīng)結(jié)束后在4000r/min離心 15min，重復(fù)實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為51. 69%。
[0028] 實施例5灰兜巴粗蛋白的提取。
[0029] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 7、超聲功率850W、時間60min、液料比 50 : l(mL/g)和溫度55°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應(yīng)結(jié)束后在4500r/min離心 15min，重復(fù)實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為52. 42%。
[0030] 實施例6灰兜巴粗蛋白的提取。
[0031] 用響應(yīng)面法對上述的灰兜巴蛋白提取條件進(jìn)行優(yōu)化處理，在功率800W、時間 531^11、溫度581：4117.5和液料比54:111117^的條件下，灰兜巴蛋白的提取率為52.66%。
[0032] 其中灰兜巴蛋白的提取率計算公式如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種灰兜巴粗多肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 灰兜巴粗蛋白的提?。簩⒎鬯楹蟮幕叶蛋驮霞尤氲搅姿峋彌_液中浸泡，在超聲 波條件下提取，離心，取上清液并冷凍干燥，得到灰兜巴粗蛋白粉； (2) 酶解：將步驟（1)得到的灰兜巴粗蛋白粉配制成水溶液，向其加入蛋白酶進(jìn)行酶解 反應(yīng)，得到灰兜巴粗蛋白的酶解液； (3) 純化：步驟⑵得到的酶解液經(jīng)沸水浴滅酶、離心、微濾，得到的濾液分別用不同分 子量的超濾離心管進(jìn)行離心處理，將得到的不同分子量的多肽液進(jìn)行濃縮和冷凍干燥，得 到不同分子量的灰兜巴粗多肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰兜巴粗多肽的制備方法，其特征在于，步驟⑴中，超聲波 提取的條件為：在超聲功率700-900W、超聲時間45?60min、溫度50-60°C、pH 6-8和液料 比（45?60) :lmL/g的條件下提取灰兜巴蛋白，待反應(yīng)結(jié)束后在3000-5000r/min離心10? 20min，上清液濃縮冷凍干燥，冷凍干燥的溫度為-50°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰兜巴粗多肽的制備方法，其特征在于，步驟⑵中，所述的 蛋白酶是為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中 的任意一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰兜巴粗多肽的制備方法，其特征在于，步驟⑵中，所述 的蛋白酶的用量為4000?6000U/g，灰兜巴粗蛋白濃度為5?7wt%，酶解的溫度為30? 50°C，酶解的時間為2?4h，酶解的pH為6?8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰兜巴粗多肽的制備方法，其特征在于，步驟⑶中，沸水浴 滅酶的條件為：將酶解液置于沸水浴中保持15?20min，然后勻速冷卻至室溫，以8000? 10000r/min的轉(zhuǎn)速離心15?20min，取上清。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰兜巴粗多肽的制備方法，其特征在于，步驟⑶中，微濾的 條件為過0. 22-0. 65 ii m的濾膜。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰兜巴粗多肽的制備方法，其特征在于，步驟（3)中，將微濾 液加至15mL裝的超濾膜30KD離心管中，置于離心機內(nèi)5000-7000rpm離心20-40min，打開 超濾管蓋子，用移液槍將超濾膜濾過液與未濾過液各自吸出，透過超濾膜的濾液再經(jīng)超濾 膜為101?和3KD的尚心管分尚，分別分子量不同的多肽液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰兜巴粗多肽的制備方法，其特征在于，步驟⑶中，冷凍干 燥的溫度為-50°C。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法制備出的灰兜巴粗多肽在制備用于降糖的藥物上 的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P21/06GK104450847SQ201410782005
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】許偉, 李錦 , 邵榮, 顏秀花, 陳立根 申請人:鹽城工學(xué)院