玉米核因子基因ZmNF-YB3及其同源基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玉米核因子基因ZmNF-YB3，其中所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示；其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明還公開了所述基因及其同源基因在培育抗逆特性改變植物中的應(yīng)用，是以正義形式將該基因重組到植物表達(dá)載體中，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株，從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選出抗逆性或產(chǎn)量明顯提高的株系，創(chuàng)造出在植物育種中具有應(yīng)用價值的新種質(zhì)。
【專利說明】玉米核因子基因ZmNF-YB3及其同源基因的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬植物生物工程育種領(lǐng)域，具體說，涉及一種玉米核因子基因ZmNF-YB3及 其同源基因在培育抗逆特性改變植物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] NF-Y(nuclear factor-y)是真核生物中普遍存在的一種轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，由3個 不同的亞基（NF-YA/CBF-B/HAP2、NF-YB/CBF-A/HAP3 和 NF-YC/CBF-C/HAP5)組成，并通過作 用于其他調(diào)控因子的啟動子來調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。NF-YA是DNA序列特異性的亞基，結(jié)合 到基因啟動子區(qū)的核心五聚體核苷酸CCAAT基序（motif)上。NF-YB和NF-YC是分別在結(jié) 構(gòu)上類似組蛋白H2A和H2B的亞基。完整的NF-Y轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與靶基因啟動子中的CCAAT基 序結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。NF-Y復(fù)合體能夠作為一個轉(zhuǎn)錄激活因子或阻遏因子起作用， 其與DNA的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性也受到其它轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，后者通過與NF-Y亞基相互作用 起作用。植物NF-Y可分為NF-YA、NF-YB和NF-YC三個家族，每家族有8?39名成員，出現(xiàn) 了結(jié)構(gòu)和功能的多樣化，形成復(fù)雜的基因家族，而且每個家族不同成員參與了不同基因表 達(dá)的調(diào)控。
[0003] 植物NF-Y基因功能初步研宄揭示，三個NF-Y家族的基因均有成員參與了植株生 長發(fā)育調(diào)控或植物與微生物相互作用，以及對逆境脅迫的響應(yīng)。在進(jìn)化過程中一些亞家族 成員形成了參與不同發(fā)育途徑和代謝過程的特殊功能，如胚胎發(fā)育調(diào)控、根系發(fā)育和開花 時間控制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)、干旱脅迫響應(yīng)、微生物感染及固氮根瘤形成等，在植物生長發(fā) 育調(diào)控中起關(guān)鍵作用。日益增多的證據(jù)表明，基于功能的專一性，至少有兩類植物NF-Y蛋 白質(zhì)存在：第一類表現(xiàn)較多的非專一性功能，在幾個不同組織或不同生理條件下均出現(xiàn)表 達(dá)，參與NF-Y和其它TF伙伴的合作，可能在基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)節(jié)方面有重要作用或參與多 條代謝及發(fā)育途徑的調(diào)控，在植物對生長環(huán)境響應(yīng)和生長發(fā)育調(diào)整中扮演著不可替代的角 色；第二類蛋白表達(dá)時空及強(qiáng)度精準(zhǔn)，在特定的過程中起關(guān)鍵作用，很可能通過與特定的轉(zhuǎn) 錄因子相互作用發(fā)揮其特異的調(diào)控作用。植物NF-Y家族成員的功能在抗旱、耐鹽性狀上也 有重要作用，過表達(dá)AtNF-YBl和ZmNF-YB2能夠增強(qiáng)植物抗旱性。
[0004] 玉米NF-Y家族基因數(shù)量大，檢索玉米基因組序列，發(fā)現(xiàn)玉米NF-YB成員28個。這 些NF-Y家族基因的功能研宄尚處起步階段，只見到玉米ZmNF-YB2基因過表達(dá)提高了植株 的耐旱性的研宄報道和孟山都公司申請的專利。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對目前的研宄現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種玉米核因子基因ZmNF-YB3及其同源基 因在培育抗逆特性改變植物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的玉米核因子基因ZmNF-YB3,其特征在于：所述基因的核苷酸序列為 以下序列之一：
[0007] (1) ZmNF-YB3的CDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；其編碼的氨基酸序列如 SEQ ID No. 2 所示；
[0008] (2)與⑴中SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列至少80%同源的序列；或與⑴中 SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列至少70%同源的序列。
[0009] 上述的玉米核因子基因ZmNF-YB3的cDNA的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID No. 1所示 的序列；其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的序列。
[0010] 本發(fā)明所述玉米核因子基因ZmNF-YB3在培育抗逆特性改變植物中的應(yīng)用。本發(fā) 明ZmNF-YB3基因通過基因表達(dá)調(diào)控來參與植物抗逆過程，對于培育高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物 具有重要意義。
[0011] 本發(fā)明所述的玉米ZmNF-YB3/GRMZM2G384528基因是從玉米cDNA中克隆，其方法 是從玉米基因組中鑒別ZmNF-YB3序列并克隆，以全長部分序列與植物啟動子融合（以正 義或反義形式），產(chǎn)生融合基因或RNAi結(jié)構(gòu)，然后將融合基因或RNAi結(jié)構(gòu)插入到植物表達(dá) 載體中，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因或RNAi結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株；通過檢 測轉(zhuǎn)基因表達(dá)和對植株進(jìn)行性狀鑒定，從中篩選出目標(biāo)性狀明顯改變的轉(zhuǎn)基因植株及其后 代，創(chuàng)造出在植物育種中具有應(yīng)用前景的新種質(zhì)和新品種。具體方案如下：
[0012] ZmNF-YB3基因的表達(dá)分析
[0013] 以耐旱自交系Q319和干旱敏感自交系65232為材料，比較苗期干旱處理對它們轉(zhuǎn) 錄組的影響，選出在不同基因型中變化趨勢不同的轉(zhuǎn)錄因子。然后，采用定量RT-PCR技術(shù) 測定這些基因的在不同脅迫條件下的表達(dá)強(qiáng)度，確定目標(biāo)基因的表達(dá)變化是否與脅迫處理 有關(guān)和在不同基因型中的差異。ZmNF-YB3在玉米根中表達(dá)豐度小于葉片中，滲透脅迫處理 24h時，表達(dá)豐度在耐旱自交系Q319的葉片中大幅度上升，在根中出現(xiàn)下降；而在旱敏感自 交系65232的葉和根中均大幅度下降。耐旱自交系Q319在滲透脅迫處理48h和之后復(fù)水 24h時，葉和根中ZmNF-YB3表達(dá)豐度變化不大，而旱敏感自交系65232在根中的表達(dá)水平在 滲透脅迫處理48h時明顯上升，但仍低于Q319的，復(fù)水24h時表現(xiàn)下降，而在葉中處理48h 時無明顯變化，復(fù)水24h又顯著上升。根據(jù)這種表達(dá)特性，可確定當(dāng)植株遭受干旱脅迫處理 時，ZmNF-YB3/GRMZM2G384528的表達(dá)在兩個耐旱性不同的自交系中有差異，且在耐旱性強(qiáng) 的自交系中保持較高表達(dá)水平，是進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)基因研宄的候選基因。對ZmNF-YB3基因在擬 南芥和水稻中的同源基因進(jìn)行搜索，依賴于已有的研宄資料，未找到可提示ZmNF-YB3基因 功能的資料。
[0014] 轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生
[0015] 將ZmNF-YB3基因編碼框或RNAi結(jié)構(gòu)分別與脅迫誘導(dǎo)型的啟動子如Prd29B、 Prd29A等或組成型啟動子融合，重組到植物表達(dá)載體中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍轟擊 法將融合基因或RNAi結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入植物，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因株系。在農(nóng)桿菌為中介的玉米遺傳轉(zhuǎn)化 中，首先構(gòu)建出載體 pCambial300-Prd29B: :ZmNF-YB3-PCaMV35S: :bar 和 pFGC5941-Prd29B ::ZmNF-YB3-PCaMV35S: :bar，ZmNF-YB3由滲透脅迫誘導(dǎo)型啟動子Prd29B啟動，篩選標(biāo)記基 因bar由花椰菜花葉病毒35SRNA啟動子啟動。通過遺傳轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒的T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)入玉米 骨干自交系。轉(zhuǎn)化苗移栽成活后套袋自交，收獲種子，通過除草劑草丁膦篩選和分子生物學(xué) 檢測方法（PCR、Southern blotting、RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)化植株后代，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。通過 連續(xù)3代的自交和分子鑒定，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因純合株系。通過選擇，獲得保持受體基因型特征 的ZmNF-YB3基因表達(dá)豐度顯著高于未轉(zhuǎn)基因植株的過表達(dá)株系，和ZmNF-YB3表達(dá)豐度顯 著低于未轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)的株系。
[0016] 轉(zhuǎn)基因植株的性狀檢測及利用
[0017] 對通過連續(xù)套袋自交數(shù)代的轉(zhuǎn)基因純合植株，首先確定它們在正常栽培條件下生 長發(fā)育是否正常。采用脅迫誘導(dǎo)型啟動子啟動的ZmNF-YB3基因或其RNAi結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)基因純 合系一般形態(tài)特征和生長發(fā)育正常，在非脅迫條件下與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓隉o明顯差異。在 此基礎(chǔ)上，分析轉(zhuǎn)基因植株和對照植株在脅迫條件下的抗性差異。
[0018] 耐熱性實驗：以長在花盆的3-6葉期植株為材料，每盆4株，2株為轉(zhuǎn)基因純合植 株，2株為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，每盆?重復(fù)，設(shè)10次重復(fù)。以玉米為例，將在28°C (照光，13h/ d)/22°C (暗，llh/d)下生長的植株移入36°C (照光）下生長2h，再在39°C下連續(xù)熱處理 4天（照光13h/d，暗llh/d)，然后在28°C下恢復(fù)生長。在熱處理后，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ諑缀跞?部死亡，而轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)株系與未轉(zhuǎn)基因差異不明顯，均全部死亡；而轉(zhuǎn)基因過表達(dá)株系受 害不明顯，即耐熱性顯著優(yōu)于對照植株的。
[0019] 耐冷性實驗：以長在花盆的3-5葉期植株為材料，每盆4株，2株為轉(zhuǎn)基因純合植 株，2株為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，每盆?重復(fù)，設(shè)10次重復(fù)。以玉米為例，將在28°C (照光，13h/ d)/22°C (暗，llh/d)下生長的植株在16°C (照光13h/d)、10°C下（照光13h/d)下依次生 長1天，然后在4°C下連續(xù)冷處理3天（照光13h/d)，再在28 °C下恢復(fù)生長。在冷處理中， 未轉(zhuǎn)基因?qū)φ丈L慢，處理后明顯小于轉(zhuǎn)基因株系的；在4°C處理1天，少數(shù)轉(zhuǎn)基因過表達(dá) 植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖~片受損，葉尖往往萎蔫，而轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)植株對冷害敏感，受損較重； 4°C處理3天后恢復(fù)生長1天，轉(zhuǎn)基因過表達(dá)株系受害程度明顯低于對照的，其中部分株系 只出現(xiàn)葉尖萎蔫，而轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)植株受損重，小苗幾乎全部死亡，而未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓杲?于其間。
[0020] 耐旱性實驗：分苗期干旱處理試驗和拔節(jié)期/開花授粉期/灌漿期干旱處理試驗。 苗期以長在土盤的4葉期植株為材料，每盤20株，10株為轉(zhuǎn)基因純合植株，10株為未轉(zhuǎn)基 因?qū)φ?，每盤為1重復(fù)，一般設(shè)4-5次重復(fù)。以玉米為例，將分別轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因和它的 RNAi結(jié)構(gòu)的純合株系的成熟干燥種子，均勻播種在土盤中，置適宜條件下生長。植株4葉期 時停止?jié)菜?，干旱處理一周左右，直至植株莖基部變軟（環(huán)境濕度低，時間短；環(huán)境濕度高， 時間長），然后恢復(fù)澆水，觀測植株恢復(fù)速率和成活率，確定植株的抗旱性。結(jié)果表明，在苗 期降低ZmNF-YB3基因表達(dá)降低了植株抗旱性，而ZmNF-YB3基因過表達(dá)明顯提高了植株的 抗旱性。
[0021] 拔節(jié)期或開花授粉期或灌漿期干旱處理試驗中，將轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因和其RNAi結(jié) 構(gòu)的玉米及未轉(zhuǎn)基因的對照自交系種子播在的花盆或大田，在同樣條件下管理，將植株分 成3個不同發(fā)育時期處理組，每組設(shè)4-5次重復(fù)，分別在拔節(jié)期（雌雄穗發(fā)育期，9?13葉 期，一般持續(xù)7-10天）、開花授粉期（雄穗露出前3-4天開始，持續(xù)10天左右）和灌漿期 (授粉后10天開始，持續(xù)10-15天）進(jìn)行干旱脅迫處理，即通過控制澆水和避免雨淋，保持 土壤相對含水量在60%左右，觀察轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑男誀畈町悾瑱z測與植 株抗旱性相關(guān)的生理指標(biāo)。通常開放授粉，收獲果穗并考種，統(tǒng)計單株產(chǎn)量和/或單行產(chǎn) 量。匯總實驗結(jié)果，確定了轉(zhuǎn)ZmNF-YB3過表達(dá)株系抗旱性顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)RNAi 結(jié)構(gòu)的，經(jīng)過干旱脅迫處理后不僅植株受害癥狀輕，而且解除脅迫后植株恢復(fù)生長快，單株 籽粒產(chǎn)量等經(jīng)濟(jì)性狀顯著優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)的；而轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)的植株抗旱 性及籽粒產(chǎn)量明顯差于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑摹Ｔ诖嘶A(chǔ)上，綜合多方面的測試結(jié)果，選出優(yōu) 異的轉(zhuǎn)基因植株套袋自交純合，并進(jìn)行配合力測定，選擇配合力與供體自交系相同或有一 定提高的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)自交系用于玉米單交種選育。
[0022] 本發(fā)明通過抗逆性檢測試驗，確定了脅迫誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子啟動轉(zhuǎn) ZmNF-YB3基因過表達(dá)植株的耐旱性、耐熱性和耐冷性比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ诊@著提高，而配合力 無明顯改變，創(chuàng)制出玉米等作物的抗逆育種新材料。

【具體實施方式】
[0023] 實施例1 :轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因創(chuàng)造玉米耐旱自交系
[0024] 1) ZmNF-YB3基因轉(zhuǎn)化玉米載體的構(gòu)建
[0025] 將ZmNF-YB3基因編碼框與脅迫誘導(dǎo)型的啟動子Prd29B融合，采用常規(guī)基因重組 技術(shù)，將融合基因插入到植物表達(dá)載體pCambial300-PCaMV35S: :bar中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化載體pCa mbial300-Prd29B: : ZmNF-YB3-PCaMV35S: : bar。再采用凍融法將轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL0 或LBA4404中，用于玉米遺傳轉(zhuǎn)化。
[0026] 2)受體系統(tǒng)的建立
[0027] 以我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上所用的骨干自交系為材料，如鄭58、昌7-2、DH4866等的自交種 子。離體培養(yǎng)誘導(dǎo)莖尖產(chǎn)生叢生芽塊，以叢生芽塊為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。所用培養(yǎng)基有：
[0028] 種子萌發(fā)培養(yǎng)基：KN031900mg/l，NH4031650mg/l，CaCl 2 ? 2H20 440mg/l， MgS04 ? 7H20370mg/l，KH2P04 ? H20 170mg/l，F(xiàn)eS04 ? 7H20 27. 8mg/l，ZnS04 ? 7H20 10mg/l， MnS04 ? 4H2022. 3mg/l，H3B0310mg/l，KI 0? 83mg/l，Na2Mo04 ? 2H20 0? 5mg/l，CuS04 ? 5H20 0? 025mg/l，CoC12 ? 6H20 0? 025mg/l，鹽酸硫胺素 10. Omg/1，鹽酸吡哆醇 1. Omg/1，煙酸 1. Omg/1，甘氨酸2. Omg/1，肌醇100. Omg/1，生物素0? 05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l,鹿糖 30g/l，瓊脂粉7g/l，pH 5. 8?6.0。用于種子萌發(fā)。液體培養(yǎng)基則去掉瓊脂粉。
[0029] A培養(yǎng)基：種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 4. 5?9. 0 y mol/1和2,4一D 1. 0? 3. 0 ymol/1，用于誘導(dǎo)離體培養(yǎng)芽尖產(chǎn)生叢生芽組織塊和叢生芽組織塊繼代培養(yǎng)。
[0030] B培養(yǎng)基：種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 4.5ymol/l和IBA(卩引噪丁酸）1.8ymol/l， 用于叢生芽組織塊分化小苗。
[0031] 成苗培養(yǎng)基：種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 2.25ymol/l和IBA 3.6ymol/l，用于叢 生小芽發(fā)育成小苗。
[0032] 生根培養(yǎng)基：種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加IBA 2. 8?3. 6 ymol/1，用于無根小苗生根。
[0033] 基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過濾滅 菌，在培養(yǎng)基滅菌后加入。
[0034] 種子滅菌和萌發(fā)：玉米種子用70%乙醇浸泡10分鐘，再用0. 1 %氯化采浸泡 10-15分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少 量（30-40毫升/250毫升三角瓶）無菌水，封口后放在黑暗條件（23-30°C )下1-2天。 萌動（露白）后種子放在基本培養(yǎng)基上于黑暗條件下繼續(xù)萌發(fā)。
[0035] 莖尖培養(yǎng)和叢生芽組織塊誘導(dǎo)、繼代、分化：萌發(fā)種子的胚芽伸長到3-5厘米 時，剝離胚芽鞘及幼葉，切取長約5毫米左右的上胚軸及莖尖，接種到A培養(yǎng)基上于黑暗下 (24-27°C )培養(yǎng)，并及時切去伸長的胚軸和剝?nèi)ビ兹~。培養(yǎng)6-10天后，莖尖開始不規(guī)則 膨大生長，在膨大的分生組織上出現(xiàn)數(shù)個瘤狀或指狀突起。20天后，在瘤狀或指狀突起的表 面開始形成不定芽及胚狀體。一般每4周繼代培養(yǎng)一次。在繼代培養(yǎng)中，若叢生芽組織塊 叢生小芽偏多，2,4一D濃度取3. 0 ymol/1 ;若叢生芽組織塊愈傷組織化較重，雖有大量的 分生細(xì)胞團(tuán)，但表面很少出現(xiàn)不定芽，可將2,4一D濃度降為1.0 ymol/1，繼續(xù)培養(yǎng)則重新 產(chǎn)生大量瘤狀或指狀突起。A培養(yǎng)基上的叢生芽組織塊，少數(shù)有不定根的產(chǎn)生。與幼葉存在 一樣，不定根也影響組織塊的膨大生長及胚狀體和叢生小芽的產(chǎn)生，需要及早去掉。叢生芽 組織塊在轉(zhuǎn)移到B培養(yǎng)基上2-3天后，色澤逐漸變黃，質(zhì)地較柔韌，5-6天后表面出現(xiàn)微小 突起。掃描電鏡下觀察可見各期胚狀體及不定芽。胚狀體及不定芽迅速發(fā)育，在組織塊表 面形成叢生小芽。
[0036] 3)以叢生芽組織塊為受體的轉(zhuǎn)化和植株再生
[0037] 將帶有雙元載體的根瘤農(nóng)桿菌（如AGL0和LBA4404) (Mini-Ti質(zhì)粒為pCambial 300-Prd29B: :ZmNF-YB3-PCaMV35S: :bar)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基（每升培養(yǎng)基含：胰化 蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0,熱壓滅菌）中28°C下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為 llOrpm(轉(zhuǎn)/分），使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后在3000rpm下離心10分鐘，棄上清液。菌 體用1/2濃度的液體種子萌發(fā)培養(yǎng)基（即種子萌發(fā)培養(yǎng)基成分減半，去掉瓊脂粉）洗滌，再 離心收集。再將菌體用添加乙酰丁香酮（acetosyringone，As)100iimol/l的1/2濃度的液 體叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
[0038]取繼代后培養(yǎng)13-20天的叢生芽組織塊為轉(zhuǎn)基因受體。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn) 化，轉(zhuǎn)化后材料在暗中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。農(nóng)桿菌感染的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有頭孢 霉素（Cefotaxime) 250mg/l或羧芐青霉素（Carb)500mg/1的培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)7-12 天，抑制細(xì)菌生長。恢復(fù)培養(yǎng)后或抑菌培養(yǎng)后的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有選擇劑的 培養(yǎng)基上連續(xù)篩選3-4代，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及小芽。在篩選培養(yǎng)中絕大數(shù)叢生芽組織塊逐 漸死亡。將存活的組織塊轉(zhuǎn)移到無選擇劑的去掉2,4一D的A培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)后產(chǎn)生小 芽。
[0039] 將小芽放在成苗培養(yǎng)基上照光下生長，光強(qiáng)2000-30001x，光照14-15小時/天。 小苗長到3-4片葉時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。培養(yǎng)15天左右，約40%的小苗產(chǎn)生新根。對 于未生根苗，切傷其基部，轉(zhuǎn)移到新的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天后大多數(shù)植株產(chǎn)生根系。生 根苗洗去培養(yǎng)基后，移栽到以蛭石為栽培介質(zhì)的花盆中生長。植株在自然光照下生長，日溫 22-28°C，夜溫15--21 °C，隔天澆灌1/2濃度的種子萌發(fā)培養(yǎng)基的無機(jī)鹽成分。生長2周左 右，移植苗產(chǎn)生發(fā)達(dá)根系，然后定植于田間。
[0040] 4)轉(zhuǎn)基因植株的抗性檢測和選擇利用
[0041] 取移栽成活植株的葉片進(jìn)行分子檢測確定轉(zhuǎn)基因植株。而后將轉(zhuǎn)基因植株（T0) 套袋自交結(jié)實。將來自不同TO植株的T1種子播在塑料盤中，3葉期時噴灑使未轉(zhuǎn)基因?qū)?照植株全部死亡的除草劑草丁膦溶液（有效濃度因自交系不同而有差異），8天后拔去死亡 植株，14天后將成活的植株移栽到溫室或具有防護(hù)設(shè)施的田間，移栽苗成活后取葉片進(jìn)行 PCR檢測。T1代篩選出的轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)套袋自交，對其子代繼續(xù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和 抗逆性檢測。通過數(shù)代自交純合、抗性檢測和綜合性狀選擇及配合力測定，獲得抗逆性和產(chǎn) 量得到顯著提高的玉米自交系。后者可用于配制玉米優(yōu)良雜交種。
[0042]實施例2 :轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因產(chǎn)生玉米耐熱自交系
[0043] 遺傳轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒的構(gòu)建過程如實例1，玉米轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化植株及其后代的選擇和 利用程序及方法如下：
[0044] 1)?玉米無菌苗獲得
[0045] 玉米優(yōu)良自交系的種子，用70 %乙醇浸泡8分鐘，再用0. 1 %氯化采浸泡8-12分 鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子 放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水于黑暗條件（25-28°C )下1-2天。待種子萌 動（露白）后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚芽伸長止3-4厘米時， 剝離胚芽鞘及幼葉，露出莖尖頂端生長錐。
[0046] 2).農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化
[0047]將帶有雙元載體（Mini-Ti 質(zhì)粒 pCambial300-Phsp: :ZmNF-YB3-PCaMV35S: :bar; Phsp :熱激蛋白70基因啟動子）的根瘤農(nóng)桿菌（AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培 養(yǎng)基中28°C下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后在3000r/ min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加 100ymol/1乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋0D6QQ0.25-0. 4濃度時用于轉(zhuǎn)化。
[0048] 3)?玉米無菌苗轉(zhuǎn)化
[0049] (1)將菌液倒在4. 5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使無菌苗的莖尖生長錐浸 泡在菌液中，在〇.5X105Pa下處理8-12分鐘。
[0050] (2)浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，萌發(fā)種子放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng) 2-3天，培養(yǎng)溫度為22-24°C。然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。
[0051] (3)將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，并用蛭石覆 蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-28°C，夜溫15-21°C，隔天澆灌1/2改 良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。
[0052] 4).轉(zhuǎn)化植株篩選與定植
[0053] 轉(zhuǎn)化植株長出3片葉后，噴灑除草劑Finale? (Hoechst Schering AgrEvo GmbH, 含有除草劑 glufosinate ammonium)水溶液，濃度為 9. 6ml -10. 8ml Finale*,/L，以植株 掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化對照植株在噴灑后4天后停止生長，9天后開始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴 灑后，一些個體變化同對照植株相似，另一些個體持續(xù)生長，變化不明顯。待存活植株長到 5葉時，將其定植到田間，套袋自交結(jié)籽。
[0054] 5).轉(zhuǎn)基因植株子代分析
[0055] T1代植株長到3葉期用10. 8ml Fina] eVL水溶液處理，觀察統(tǒng)計抗性和敏感性 個體比例；采用PCR技術(shù)檢測外源基因，并統(tǒng)計外源基因在子代植株中的分離比例。存活植 株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交結(jié)籽外，采用PCR技術(shù)檢測外源基因進(jìn)行 Southern blotting驗證，并采用RT-PCR技術(shù)檢查轉(zhuǎn)基因表達(dá)強(qiáng)度。對于入選的轉(zhuǎn)基因株 系測定植株在不同光強(qiáng)和溫度下凈光合速率的變化，測定3-7葉期小苗生長速率，統(tǒng)計單 株產(chǎn)量和生物量，并以未轉(zhuǎn)基因植株為對照。選出優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因株系后在大田栽培條件下 進(jìn)行玉米產(chǎn)量性狀的觀測和比較，選擇產(chǎn)量與受體材料相近或略高的株系進(jìn)行抗逆性系統(tǒng) 測定。
[0056] 6).轉(zhuǎn)基因純合系的耐熱性測定和篩選
[0057] 苗期耐熱性實驗：將在28°C(照光，13h/d)/22°C(暗，llh/d)下生長的3-5葉期 轉(zhuǎn)基因純合的玉米植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暌迫?6°C (照光）下生長2h，再在39°C下連 續(xù)熱處理4天（照光13h/d，暗llh/d)，然后在28°C下恢復(fù)生長。在熱處理后，未轉(zhuǎn)基因?qū)?照幾乎全部死亡，而轉(zhuǎn)基因株系中只有個別株系與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹罹嗖淮?，絕大多數(shù)株系 的耐熱性顯著優(yōu)于對照的，其中部分轉(zhuǎn)基因株系受害不明顯。
[0058] 拔節(jié)期植株耐熱性實驗：轉(zhuǎn)基因純合的玉米植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子播在花盆 中，植株在適宜生長條件下（溫度不高于32°C，不低于22°C )長到13-14葉期，然后移入 到36°C (照光）下生長4h，再在40°C下持續(xù)熱處理5天（照光13h/d，暗llh/d)，移入 32°C (光）/26°C (暗）下恢復(fù)生長，照光13h/d，暗llh/d。熱處理后，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?葉片幾乎全部受損，下部葉片死亡，雄穗發(fā)育不良，無正?；ǚ?，無雌穗發(fā)生；轉(zhuǎn)基因株系中 只有個別株系與未轉(zhuǎn)基因植株差距不明顯，絕大多數(shù)株系的耐熱性顯著優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因植株 的，其中部分轉(zhuǎn)基因株系的植株葉片受害輕，僅下部葉片干死脫落，但雄穗發(fā)育仍受到嚴(yán)重 影響，花粉敗育率高達(dá)60%，雌穗發(fā)育也大幅度推遲，造成花期不育，無法自交結(jié)實。
[0059] 灌漿期植株耐熱性實驗：播在花盆中的轉(zhuǎn)基因純合的玉米植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)?照植株在適宜生長條件下（溫度不高于35°C，不低于22°C )生長到授粉后10天，移入 36°C (照光）下生長24h，再在40°C下持續(xù)熱處理5天（照光13h/d，暗llh/d)，然后移 入32°C (光）/26°C (暗）下恢復(fù)生長，照光13h/d，暗llh/d。熱處理后，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩?株部分死亡，存活植株幾乎葉片全部受損，下部葉片死亡，果穗變小，禿頂約占果穗長度的 1/3-1/2,籽粒數(shù)不到未受脅迫植株的1/2,百粒重不到未受脅迫植株的3/4,單株產(chǎn)量大幅 度下降。轉(zhuǎn)基因株系中只有少數(shù)株系與未轉(zhuǎn)基因植株的受害程度相近，絕大多數(shù)株系的耐 熱性顯著優(yōu)于對照的，其中部分轉(zhuǎn)基因株系的植株葉片受害輕，只是下部葉片干死，但果穗 發(fā)育仍受到嚴(yán)重影響，禿頂約占果穗長度的1/3,籽粒數(shù)比未受脅迫植株顯著減少，百粒重 一般下降20-30%，單株產(chǎn)量雖明顯下降，但顯著高于經(jīng)過同樣處理的未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?的。
[0060] 綜合不同生長發(fā)育期的轉(zhuǎn)基因玉米耐熱性檢測結(jié)果，從中選出耐熱性顯著高于受 體自交系的穩(wěn)定純合株系，經(jīng)過大田比較試驗，選出在正常栽培條件下產(chǎn)量和抗病性等性 狀與未轉(zhuǎn)基因自交系無明顯差異的轉(zhuǎn)基因耐熱育種材料。
[0061] 實施例3:轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因產(chǎn)生玉米耐冷自交系
[0062] 轉(zhuǎn)化載體和構(gòu)建過程同實例1，玉米無菌畝莖尖轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化植株的移栽管理和篩 選、轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定和后代篩選等程序及方法同實例2。在玉米種植區(qū)，玉米生長發(fā) 育一般處在高溫季節(jié)，但在我國北方春玉米種植區(qū)玉米播種后往往會遇到低溫天氣，造成 爛種或小苗受凍，即提高玉米的耐冷性主要是提高它在較低溫度下的種子萌發(fā)率及長勢和 小苗的耐冷性。因此玉米耐冷性檢測主要在萌發(fā)期和苗期進(jìn)行。通過轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因產(chǎn) 生玉米耐冷自交系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是獲得了遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因純合株系后，對其萌發(fā)種子 和小苗分別進(jìn)行抗冷性測定，選擇耐冷性明顯高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑闹晗挡⒂糜谂嘤?米耐冷自交系。
[0063] 玉米苗期耐冷性實驗：將在28°C (照光，13h/d)/22°C (暗，llh/d)下生長的轉(zhuǎn)基 因純合的玉米植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暌迫氲?6°C (照光13h/d)下、10°C (照光13h/d) 下依次生長1天，然后在4°C下連續(xù)冷處理8天（照光13h/d)，再在28°C下恢復(fù)生長。在 冷處理中，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晟L慢，處理后明顯小于轉(zhuǎn)基因株系的；在4°C處理1天，少數(shù) 轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏娜~片受損，葉尖往往萎蔫；4°C處理3天后恢復(fù)生長1天，而絕 大多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系受害程度明顯低于對照的，其中部分株系只出現(xiàn)葉尖萎蔫。
[0064] 玉米種子的發(fā)芽勢測定：將非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)基因株系的種子分別于25°C、15°C 和10°C下萌發(fā)，每天統(tǒng)計萌發(fā)率。在25°C下，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率均在95% 以上，發(fā)芽勢沒有明顯差異，而在15°C和10°C下萌發(fā)率和發(fā)芽勢表現(xiàn)出明顯差異。15°C下 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)基因株系最終萌發(fā)率在90%左右，但與25°C下的萌發(fā)情況相比，轉(zhuǎn)基因 株系種子萌發(fā)推遲了 3-4天，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子萌發(fā)推遲了 5-6天。在10°C下，與25°C 下相比，種子萌發(fā)被推遲10天以上，且最終萌發(fā)率明顯降低。多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系的種子最終 萌發(fā)率為25°C條件下的60-80%，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子最終萌發(fā)率減少到25%左右。即與 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾绒D(zhuǎn)基因株系發(fā)芽勢在低溫環(huán)境中下降較小，種子萌發(fā)時耐低溫的能力得 到增強(qiáng)。
[0065] 玉米幼苗的生長速率測定：在玉米種子萌發(fā)后測定不同培養(yǎng)溫度下玉米胚芽鞘及 葉片的生長速率，確定植株的耐冷性。在25°C下，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米胚芽鞘及葉片的生 長速率差異未達(dá)到顯著。15°C下，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因胚芽鞘及葉片的生長速率降低為25°C 下的55-65%左右，一般轉(zhuǎn)基因小苗生長較快，差異達(dá)到差異顯著程度。在10°C下，轉(zhuǎn)基因 株系胚芽鞘及葉片的生長速率降低為25°C下的20%左右，而非轉(zhuǎn)基因胚芽鞘及葉片的生 長速率僅為25°C下10%。這些結(jié)果表明，在常溫下，玉米幼芽生長速率受到轉(zhuǎn)基因的影響 較小；但在l〇°C低溫下，轉(zhuǎn)基因過表達(dá)高的植株生長較快，受到的抑制作用小，即對低溫脅 迫的耐受性較強(qiáng)。
[0066] 綜合轉(zhuǎn)基因玉米耐冷性檢測結(jié)果，從中選出耐冷性顯著高于受體自交系的穩(wěn)定純 合株系，經(jīng)過大田比較試驗，選出在正常栽培條件下產(chǎn)量和抗病性等性狀與未轉(zhuǎn)基因自交 系無明顯差異的轉(zhuǎn)基因耐冷育種材料。
[0067] 實施例4:轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因創(chuàng)造高羊茅耐旱新材料
[0068] 1)遺傳轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒的構(gòu)建
[0069] 同實例1所示，選擇標(biāo)記基因也可為除草劑抗性基因als (抗除草劑氯磺?。?epsps(抗除草劑草甘膦）等。
[0070] 2)高羊茅芽尖轉(zhuǎn)化受體體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化
[0071] 高羊茅無菌種子苗的獲得：高羊茅種子用70%乙醇浸洗3min，自來水洗凈殘留在 種子表面的多余乙醇，再用自來水浸泡4h，倒去自來水，種子再用70 %乙醇洗滌lmin，用 0. 2%氯化汞溶液滅菌15min，然后用無菌水沖洗3-5遍。滅菌期間不斷搖動三角瓶，以保證 種子表面滅菌徹底。消毒后種子放入鋪有3層濕濾紙的滅菌三角瓶內(nèi)，封口后放在黑暗條 件（25°C )下萌發(fā)。
[0072] 高羊茅叢生芽體系的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)：生長至2-5cm的高羊茅黃化種子苗，取其 生長點處約5mm左右切段，放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-20天。待切段基部膨大后，將上面多 余部分切去，留基部約5_部位轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，逐漸有許多小芽從基部生出 形成叢生芽。將叢生芽切成小塊于新的繼代培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每10-15天繼代一次，小芽不 斷擴(kuò)增。
[0073] 為確定不同基因型高羊茅叢生芽誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，特設(shè)計以下實 驗：待種子萌發(fā)長成2-5cm黃化苗后，于無菌條件下切取5mm左右的莖尖部位作為外植體， 接種于不同配比的2, 4-D/6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，觀察莖尖生長及叢生芽產(chǎn)生情況，確定最 佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基；將誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽塊轉(zhuǎn)移到附加不同濃度6-BA的繼代培養(yǎng)基上，統(tǒng)計叢 生芽的增殖率，確定最適繼代培養(yǎng)基。
[0074] 除草劑篩選濃度的確定：將各基因型高羊茅叢生芽切成單芽（3_5mm大小）， 分別轉(zhuǎn)入附加不同濃度除草劑草丁膦的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（附加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 2, 4-D/6-BA的MS培養(yǎng)基）中，24±2°C下培養(yǎng)，每15天繼代培養(yǎng)一次。連續(xù)培養(yǎng)3代后統(tǒng) 計存活芽數(shù)量。每個基因型每濃度100芽，設(shè)3次重復(fù)。
[0075] 高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化：取-20°C保存的攜帶質(zhì)粒pCambial300-Prd29B: :ZmNF-YB3-PCa MV35S: :bar的根癌農(nóng)桿菌，接種于含有抗生素（25mg/L利福平，50mg/L卡那霉素）的YEP 平板上，28°C培養(yǎng)5-7天，至菌斑長出。從平板上挑取單菌落，接種于含同樣濃度抗生素的 YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將對數(shù)生長期的菌液于4000rpm/ min下離心lOmin，去上清。將菌體用加入100 ymol/1乙酰丁香酮的液體培養(yǎng)基重懸，稀釋 到不同濃度備用。
[0076] 將繼代后7天的叢生芽塊剝?nèi)?mm大小的芽尖，在農(nóng)桿菌0D_0. 6的菌液中浸染 10-12min并附以0. 5 X 105MPa的負(fù)壓處理，然后轉(zhuǎn)到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn) 到含有頭孢霉素（150mg/L)的培養(yǎng)基上抑菌培養(yǎng)，2周后轉(zhuǎn)移到加有草丁膦（終濃度0. 1% 左右，因不同基因型而有差異）的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。每15天（加草丁膦）繼代培養(yǎng)一次， 連續(xù)篩選3代，得到不同比例的抗性芽，其中部分是轉(zhuǎn)化體。
[0077] 3)抗性芽的篩選、生根與移栽
[0078] 將抑菌后的芽叢切成約1cm左右的小塊，在含有0. 06-0. 1%草丁膦的篩選培養(yǎng)基 連續(xù)篩選3代，得到抗性芽。存活的抗性芽轉(zhuǎn)移到無選擇劑的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)生長。
[0079] 將2cm左右的高羊茅抗性芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，20天左右生根；根系發(fā) 達(dá)的小苗移到上層蛭石、下層壤土的花盒中，保持濕度，成活率達(dá)90%以上。移栽成活植株 定植于大田。
[0080] 4)轉(zhuǎn)化苗的分子鑒定和選擇
[0081] CTAB法微量提取轉(zhuǎn)化植株葉片DNA，采用PCR檢測轉(zhuǎn)基因。對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分 株繁殖或姊妹交結(jié)籽。無性克隆苗或子代小苗繼續(xù)用除草劑草丁膦篩選，抗性植株采用PCR 檢測轉(zhuǎn)基因、采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，選出轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平高的植株進(jìn)行分株繁 殖。后者用于抗性檢測實驗。
[0082] 5)抗旱性檢測
[0083] 移栽到花盆的小苗在適宜條件下生長2月，選取長勢一致的材料進(jìn)行干旱處 理。此時每盆材料的分蘗數(shù)在17 - 25個之間，生長較快。對照處理材料正常澆水，每 天澆水量為600毫升。干旱處理的材料先一次性澆足水份，處理期間不再澆水，溫度 30°C (日）/22°C，相對濕度低于45%，以植株開始萎蔫時記為處理第1天。當(dāng)干旱處理到第 12天時，未轉(zhuǎn)基因受體材料大部分地上部干枯死亡，而部分轉(zhuǎn)基因材料仍然生長較好。然后 恢復(fù)澆水，未轉(zhuǎn)基因受體材料幾乎全部死亡，轉(zhuǎn)基因材料多數(shù)株系恢復(fù)生長，10天時新葉達(dá) 到12-15片。即轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)出明顯提高的耐旱性。
[0084] 為了 了解轉(zhuǎn)基因耐旱材料的實用價值，對入選的材料進(jìn)行控水試驗，即將干旱處 理的材料平均每天澆水300ml，保證材料葉片在晚間伸展，白天萎蔫（葉片微卷）。與正常 澆水材料相比，轉(zhuǎn)基因材料新分蘗發(fā)生數(shù)少，生長變慢，植株高度稍有降低，葉色稍淺，抽苔 時間一般延后15 - 20天。即在節(jié)水50%的條件下，轉(zhuǎn)基因耐旱材料仍生長發(fā)育基本正常， 是較為理想的草坪草植物。
[0085] 實施例5 :轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因創(chuàng)造草地早熟禾耐熱新材料
[0086] 草地草地早熟禾（Poa pratensis L.)是溫帶地區(qū)最重要的草坪草草種之一。由 于它具有色美、抗寒能力強(qiáng)、耐蔭、耐修剪等優(yōu)點，在我國北方及中部地區(qū)、南方部分冷涼地 區(qū)被廣泛用作建坪草種。草地早熟禾也有其自身的缺點，如耐高溫能力差、不耐炎熱、易受 病蟲危害和抗旱力不強(qiáng)等，在盛夏季節(jié)生長停止，甚至部分死亡。這些缺點極大地制約了草 地早熟禾在夏季炎熱地區(qū)的廣泛利用。由于草地早熟禾具有孤雌生殖的特性，采用常規(guī)育 種技術(shù)改良這些不利性狀難度大，成功率低，因此采用基因工程手段培育草地早熟禾新品 種的工作受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因創(chuàng)造草地早熟禾耐熱種質(zhì)。
[0087] 1)轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建：遺傳轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒的構(gòu)建同實例2所示，選擇標(biāo)記基因也可 為除草劑抗性基因als (抗除草劑氯磺?。?、epsps (抗除草劑草甘膦）等。
[0088] 2)草地早熟禾轉(zhuǎn)化受體的建立：草地早熟禾種子經(jīng)70%酒精2分鐘、0.2%氯化 采14min滅菌，無菌水沖洗3?5遍，播于濕潤的無菌濾紙上萌發(fā)。10?15d后轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培 養(yǎng)基（MS 培養(yǎng)基+3mg/L 6-BA+O. 5mg/L 2, 4-D+200mg/L 水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖+6. 5g/L 瓊 脂）上誘導(dǎo)基部膨大，培養(yǎng)18d后轉(zhuǎn)入?yún)采堪l(fā)生培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2mg/L 6-BA+200mg/ L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂）誘導(dǎo)形成叢生芽。叢生芽塊轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上繼 代培養(yǎng)。為了使叢生芽塊能長期繼代培養(yǎng)，通過多種激素組合的比較試驗，得出MS培養(yǎng)基 +3mg/L 6-BA+O. 07mg/L 2, 4-D+200mg/L 水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +6. 5g/L 瓊脂為適宜繼代 培養(yǎng)基。當(dāng)2, 4-D濃度較高時，叢生芽塊基部產(chǎn)生愈傷化組織，分化小芽能力低。當(dāng)2, 4-D 濃度較低時，小苗容易老化，不易產(chǎn)生新芽。即使在適宜繼代培養(yǎng)基上，繼代5次后的叢生 芽塊小苗老化，增生能力降低。要保持草地早熟禾叢生芽處于幼嫩狀態(tài)，可在繼代4?5次 后將叢生芽分成單芽或者2?3mm小塊接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)膨大，然后再轉(zhuǎn)入成叢培 養(yǎng)基上產(chǎn)生叢生芽塊。培養(yǎng)溫度24±2°C，光強(qiáng)500?lOOOLx，光照14h/d。取在繼代培養(yǎng) 基上暗培養(yǎng)5d的叢生芽塊作為轉(zhuǎn)化受體。
[0089] 3)草地早熟禾叢生芽塊遺傳轉(zhuǎn)化
[0090] 挑取農(nóng)桿菌（攜帶轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒）單克隆培養(yǎng)物，接種到含有利福平25mg/L、卡那 霉素50mg/L的液體YEP液體培養(yǎng)基中28°C下振蕩（180r/min)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。菌液 4000r/min離心，倒掉上清液，菌體用液體培養(yǎng)基（改良MS培養(yǎng)基+2mg/L 6-BA+200mg/L 水解酪蛋白+30g/L蔗糖）重懸，稀釋濃度至0D_= 0. 6備用。在浸染前向此細(xì)菌懸液加 入0.2% (終濃度）的乙酰丁香酮（AS)。將草地早熟禾叢生芽塊切去葉片，剝除葉鞘，然后 切成1_左右的小芽塊，并盡量暴露出芽尖頂端的分生組織，放入培養(yǎng)皿中，盡快倒入農(nóng)桿 菌菌液，在0. 〇5MPa負(fù)壓處理下浸染4-6min。倒出菌液后，用無菌濾紙吸干殘留菌液，再將 小芽塊轉(zhuǎn)入?yún)采堪l(fā)生培養(yǎng)基上在24±2°C暗培養(yǎng)3天。
[0091] 將共培養(yǎng)后的芽塊轉(zhuǎn)到加有l(wèi)〇〇mg/L頭孢霉素的叢生芽發(fā)生培養(yǎng)基上抑制農(nóng)桿 菌生長，10d后再將叢生芽塊分成單芽置于含有0. 1-0.2%除草劑草丁膦（濃度因基因型不 同而有較大差異）的叢生芽發(fā)生培養(yǎng)基上篩選抗性小芽，連續(xù)篩選3代，每代篩選15d。篩 選3代后獲得的抗性小苗轉(zhuǎn)入?yún)采堪l(fā)生培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)和增殖培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入生根培 養(yǎng)基中，約8?15d后長出根。當(dāng)根生長到2?5cm長時，放在自然光下培養(yǎng)1?2d，去掉 封口膜煉苗1?2d后移栽入花盆。花盆下部為土壤，上部為6?8cm厚的輕石，每5d饒一 次1/2MS營養(yǎng)液，隔天澆水一次。移栽成活率為95%?99%。成活2月后取葉片進(jìn)行PCR 檢測。
[0092] 4)轉(zhuǎn)化植株的分子檢測
[0093] CTAB法提取草地早熟禾再生植株葉片DNA，以其為模板進(jìn)行PCR檢測轉(zhuǎn)基因。對 轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分株繁殖或姊妹交結(jié)籽。無性克隆苗或子代小苗繼續(xù)噴灑除草劑草丁膦 (0. 15%濃度）進(jìn)行篩選，抗性植株采用PCR檢測轉(zhuǎn)基因、RT-PCR測定轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，選 出轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平高的植株進(jìn)行分株繁殖。后者用于抗性檢測實驗。
[0094] 5)轉(zhuǎn)基因植株耐熱性檢測
[0095] 檢測分為2組進(jìn)行，以分別了解對持續(xù)高溫和短期高溫對植株存活和生長的影 響。
[0096] 在選擇對持續(xù)高溫有良好耐性材料的試驗中，通常將長勢無明顯差異的不同 株系的克隆材料放入人工氣候箱，氣候箱設(shè)置光周期12h/d，相對濕度70%。溫度按 30°C- 32°C- 34°C- 36°C- 38°C- 40°C梯度遞增，每個溫度2小時，最后40°C下維持3 天，觀察材料的變化，包括萎蔫程度，存活率，葉色變化等，然后在23°C下恢復(fù)培養(yǎng)。經(jīng)過 40°C熱脅迫處理，未轉(zhuǎn)基因受體株系與多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出明顯差別，40°C處理1天，未 轉(zhuǎn)基因受體植株出現(xiàn)萎蔫，而多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系植株形態(tài)變化不明顯。處理3天時，不同株系 植株均萎蔫，葉尖干枯，但多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系受損程度輕，恢復(fù)10天時，長勢明顯好于未轉(zhuǎn)基 因受體植株的。選出耐熱性優(yōu)良的株系進(jìn)行擴(kuò)繁。
[0097] 在檢測對短期高溫脅迫反應(yīng)的試驗中，通常將人工氣候室中培養(yǎng)的草地早熟禾植 株在光周期 12h/d和相對濕度70%下按23°C-38°C (2h) -40°C (2h) -42°C (2h) -44°C (2 h) - 46°C (5h) - 23°C (7d)的程序處理，并分別于處理前、處理結(jié)束后2天、7天時照相。其 中部分材料熱處理結(jié)束后將葉片全部剪去，觀察生長情況，生長10天后照相。熱脅迫處理 前各株系植株生長狀態(tài)一般基本一致，熱激處理后，未轉(zhuǎn)基因受體株系和多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系 在44°C處理階段已出現(xiàn)顯著差異，未轉(zhuǎn)基因受體植株很快出現(xiàn)萎蔫，葉尖干枯，處理后恢復(fù) 過程時間長，生長速率慢。而多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系植株受害較輕，在脅迫后恢復(fù)較快，生長速率 可很快恢復(fù)到處理前水平。
[0098] 綜合耐熱性檢測結(jié)果，挑選出耐熱性顯著提高的形態(tài)特征無明顯變化的草地早熟 禾新材料。
[0099] 實施例6 :轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因創(chuàng)造棉花耐旱新材料
[0100] 1) ZmNF-YB3基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
[0101] 將ZmNF-YB3基因編碼框與脅迫誘導(dǎo)型的啟動子Prd29B或組成型啟 動子PCaMV35S融合，采用常規(guī)基因重組技術(shù)將融合基因插入到植物表達(dá)載體 pCambial300-PCaMV35S: :bar 中，分別產(chǎn)生轉(zhuǎn)化載體 pCambial300-PCaMV35S: :ZmNF-YB3-P CaMV35S: :bar (用于株型高大的棉花品種，轉(zhuǎn)基因植株株型變小，適合密植）和pCambial30 0-Prd29B: : ZmNF-YB3-PCaMV35S: : bar。再采用氯化鈣法制備感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404 細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。即在室溫下加入1 y g重組質(zhì)粒DNA到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞懸液中，混勻 后冰浴30min，置液氮速凍lmin，經(jīng)37°C保溫3min后，加入lml YEP培養(yǎng)基搖勻，28°C下振 蕩（150rpm)培養(yǎng)3h。5000rpm離心3min收集菌體，加入100 y 1 YEP液體培養(yǎng)基重懸，涂 布于含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP平板上，28°C暗培養(yǎng)2-3d，待轉(zhuǎn)化菌落長到 合適大小，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定，挑選質(zhì)粒穩(wěn)定的LBA4404克隆用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化。
[0102] 2)棉花遺傳轉(zhuǎn)化
[0103] 棉花種子經(jīng)硫酸脫絨后，用70%乙醇浸泡lmin、0. 1%升汞浸泡15min，然后用無 菌水洗滌5遍。消毒后種子放入鋪有三層濾紙的無菌瓶中，加入適量無菌水，于30°C溫箱中 萌發(fā)。2-3天后下胚軸長到l-2cm，將萌發(fā)種子插到札固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，取株高7? 10cm小苗用于莖尖轉(zhuǎn)化。
[0104] 挑取LBA4404單克隆培養(yǎng)物，接種到加有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的液 體YEP培養(yǎng)基中于27°C，180rpm振蕩培養(yǎng)。菌液用4000r/min離心5分鐘，倒掉上清液， 菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基重懸，稀釋到OD_為0. 8左右備用。在浸染前向此細(xì)菌懸液加入 100mg/L 的乙酰丁香酮（acetosyringone，AS) 〇
[0105] 當(dāng)棉花種皮脫落或快脫落時，去掉種皮和一片子葉，裸露出小苗莖尖。若苗端已有 小葉出現(xiàn)，則用鑷子剝?nèi)?。輕輕劃傷頂端分生組織后，將蘸有農(nóng)桿菌菌液的棉球（由滅菌脫 脂棉制備）放到小苗頂端，然后將小苗置于真空干燥器中，輔以〇. 5X 105Pa的負(fù)壓處理10 分鐘。浸染過的幼苗于21°C左右暗培養(yǎng)3天，然后在光下培養(yǎng)2?3天后移栽入花盆?；?盆下部為壤土，上部為6?8cm厚的輕石，隔天饒灌1/2MS無機(jī)鹽溶液。
[0106] 3)轉(zhuǎn)化植株的篩選與PCR檢測
[0107] 轉(zhuǎn)化小苗在花盆中生長1-2周后（長出1-2片新葉），將蘸有0. 1 %草丁膦溶液 的棉球置于小苗莖尖進(jìn)行除草劑篩選，24小時后重復(fù)一次。約2周后統(tǒng)計存活植株。采用 CTAB法微量提取存活植株基因組DNA，采用PCR反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)基因是否存在，篩選出轉(zhuǎn)基因植 株。
[0108] 4)轉(zhuǎn)基因棉花的抗旱性檢測
[0109] 未轉(zhuǎn)基因受體品種和轉(zhuǎn)基因株系的T2代種子經(jīng)過硫酸脫絨和0. 1%升汞消毒后， 在鋪有三層濾紙的培養(yǎng)皿中于30°C培養(yǎng)箱中萌發(fā)。2-3天后下胚軸長到l-2cm，將萌發(fā)后的 小苗轉(zhuǎn)入裝滿Hogland營養(yǎng)液的體積約2升的塑料盒中繼續(xù)培養(yǎng)，每盒培養(yǎng)16株植株。小 苗長至3葉期時將小苗轉(zhuǎn)入含有12% PEG6000的Hogland營養(yǎng)液中處理，觀測植株生長狀 況。多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系的植株長勢明顯好于未轉(zhuǎn)基因受體品種的，受害輕，表明轉(zhuǎn)基因表達(dá)提 高了棉花的抗?jié)B透脅迫能力。
[0110] 為了確定干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因株系與未轉(zhuǎn)基因受體品種的表型及生長差異，將它 們的種子種在同一個裝滿蛭石的無蓋大盒子里。出苗后間苗，每株系保留2株，每天澆灌 1/2MS營養(yǎng)液。四周后，停止?jié)矤I養(yǎng)液，進(jìn)行干旱脅迫2周，統(tǒng)計植株葉片數(shù)和株高，然后輕 輕的分離棉花根系，烘干后測定根和地上部的生物量。
[0111] 蕾期和開花期是棉花對水分需求量比較大的關(guān)鍵時期。轉(zhuǎn)基因株系與未轉(zhuǎn)基因 受體品種在蕾期和開花期的抗旱性檢測以盆栽植株為材料進(jìn)行，生長條件為晝/夜溫度約 20/35°C，大氣相對濕度約40-55%。將同齡的不同基因型的小苗同期移栽到土壤一致的的 花盆中，每盆1株，為1個重復(fù)。這些植株分為3組，每組每株系3盆。第一組在剛剛出現(xiàn) 花蕾時，一次性澆足營養(yǎng)液，然后不再澆水，直至未轉(zhuǎn)基因受體植株葉片發(fā)生嚴(yán)重萎蔫。在 蕾期干旱脅迫處理前和脅迫處理后分別測定未轉(zhuǎn)基因受體植株和轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對 含水量、葉綠素含量、光合作用指標(biāo)、可溶性糖和游離氨基酸含量以及細(xì)胞溶質(zhì)勢。第二組 植株從第一朵花出現(xiàn)開始，每天控制澆水量，使土壤含水量保持在12%左右，進(jìn)行持續(xù)干旱 脅迫3周，然后恢復(fù)正常澆水。第三組一直正常澆水，作為未處理對照。在干旱脅迫過程中， 分別在干旱處理前、處理第7、14和21天時測定植株光合效率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率。在收 獲期測定株高，統(tǒng)計分支數(shù)、單株開花數(shù)、單株結(jié)鈴數(shù)和籽棉產(chǎn)量。結(jié)果顯示干旱脅迫不同 程度地影響了各株系植株的分支數(shù)、單株開花數(shù)和結(jié)鈴數(shù)；干旱脅迫后部分轉(zhuǎn)基因植株的 分支數(shù)比未轉(zhuǎn)基因受體品種多15% -35%，差異達(dá)到顯著水平；單株開花數(shù)比未轉(zhuǎn)基因受 體品種多5% -20% ;干旱脅迫導(dǎo)致不同基因型棉花單株籽棉產(chǎn)量下降，而部分轉(zhuǎn)基因株系 僅下降了 15%-20%，而未轉(zhuǎn)基因受體品種下降30%以上。生理參數(shù)的測定也支持這些結(jié) 果。
[0112] 綜合轉(zhuǎn)基因棉花耐旱性檢測結(jié)果，得出轉(zhuǎn)ZmNF-YB3基因創(chuàng)造出棉花耐旱新材料， 這為對提高干旱脅迫下棉花產(chǎn)量具有重要意義。
【權(quán)利要求】
1. 一種玉米核因子基因 ZmNF-YB3,其特征在于：所述基因的核苷酸序列為以下序列之 (1) ZmNF-YB3的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示； (2) 與（1)中SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列至少80%同源的序列；或與（1)中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列至少70%同源的序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的玉米核因子基因 ZmNF-YB3,其特征在于：所述基因的cDNA的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述玉米核因子基因 ZmNF-YB3在培育抗逆特性改變植物中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抗逆性是指耐旱性、耐澇性、耐熱性或 耐冷性；所述植物是指栽培的草本作物和牧草。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物是指玉米、棉花、高羊茅和草地早 熟禾。
6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用的方法是以正義形式將基因 ZmNF-YB3重組到植物表達(dá)載體中，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因 植株，從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選出抗逆性或產(chǎn)量明顯提高的株系，獲得在育種中具有 應(yīng)用價值的新種質(zhì)。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述ZmNF-YB3基因有cDNA形式或基因組 基因形式。
【文檔編號】C12N15/29GK104450742SQ201410796904
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】張舉仁, 李朝霞, 王保梅 申請人:山東大學(xué)