一株具有生理活性產胞外多糖植物乳桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株具有生理活性產胞外多糖植物乳桿菌及其應用。本發(fā)明提供了一株植物乳桿菌Lactobacillus plantarum SKT109，其保藏編號為CGMCC No.10130。上述的植物乳桿菌SKT109在權利要求1所述的植物乳桿菌SKT109和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產物在制備胞外多糖中的應用。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現了一株新的植物乳桿菌SKT109，其可產胞外多糖，利用其制備發(fā)酵酸乳可降低增稠劑和穩(wěn)定劑的用量，同時賦予產品良好的口感和風味，本發(fā)明在發(fā)酵食品領域具有廣闊的應用前景。
CGMCC No.10130
20141202
【專利說明】一株具有生理活性產胞外多糖植物乳桿菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及乳品加工【技術領域】，尤其涉及一株具有生理活性 產胞外多糖植物乳桿菌及其應用。

【背景技術】
[0002] 乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPSs)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌 到胞外的莢膜多糖或黏液多糖。乳酸菌胞外多糖作為一種新興的天然食品級添加劑，具有 使用安全的天然優(yōu)勢。在食品加工領域，乳酸菌胞外多糖具有重要的工藝學功能，包括改善 發(fā)酵乳、干酪及多數乳制品的流變學特性、質構、口感以及風味等。乳酸菌胞外多糖可以提 高菌體對胃腸道表面的非特異性粘附能力，改善腸道菌群結構，保護菌體抵抗外界不利環(huán) 境，促進菌體對金屬離子的吸附以及預防噬菌體的侵染等作用。在生物學活性方面，乳酸菌 胞外多糖具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調節(jié)、降膽固醇、降血壓等作用。
[0003] 近年來，部分具有特定生物活性的產胞外多糖嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧 桿菌及乳酸桿菌作為附屬發(fā)酵劑已成功應用于發(fā)酵乳制品生產中，并取得了良好的經濟效 益。植物乳桿菌為革蘭氏陽性菌，通常作為附屬發(fā)酵劑與主發(fā)酵劑合并制備發(fā)酵乳。植物 乳桿菌作為乳酸菌中的一員在我國傳統(tǒng)食品中有著廣泛的來源。近年來我國學者已從發(fā) 酵蔬菜制品、發(fā)酵乳制品及肉制品中篩選出多株具有良好益生特性及功能特性的植物乳桿 菌。雖然植物乳桿菌的胞外多糖產量普遍較低，但作為天然的增稠劑，不僅能改善乳制品的 質地，同時還會賦予產品獨特的風味，深受消費者的青睞。
[0004] 然而，從目前國內來看，研宄成熟并且能夠在實踐中推廣應用的產胞外多糖植物 乳桿菌菌株并不是很多。因此，開展產胞外多糖植物乳桿菌的研宄，尤其是開展對提高植物 乳桿菌胞外多糖產量方法研宄、胞外多糖理化及生物活性的分析及產胞外多糖植物乳桿菌 在發(fā)酵乳中的應用研宄，對于改善發(fā)酵乳品質、開發(fā)具有特定功能性的乳酸菌發(fā)酵乳制品， 具有十分重要的研宄價值和經濟價值。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一株具有生理活性產胞外多糖植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum SKT109。
[0006] 本發(fā)明提供的植物乳桿菌Lactobacillus plantarum SKT109,其保藏編號為 CGMCC No. 10130。
[0007] 上述的植物乳桿菌SKT109和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產物在 制備胞外多糖中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0008] 上述應用中，所述胞外多糖具有如下1)和/或2)的特征：
[0009] 1)所述胞外多糖重均分子量為2. I X IO6Da ;
[0010] 2)所述胞外多糖組分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物質摩爾比為 3 :1〇
[0011] 上述的植物乳桿菌SKT109和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產物在 制備抑制腫瘤或抑制腫瘤細胞增殖產品中的應用。
[0012] 上述應用中，所述腫瘤為結腸癌；所述腫瘤細胞為結腸癌細胞HT-29。
[0013] 上述的植物乳桿菌SKT109和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產物在 發(fā)酵酸乳中的應用。
[0014] 上述應用中，所述植物乳桿菌SKT109以SKT109發(fā)酵劑的形式存在；
[0015] 所述SKT109發(fā)酵劑按照如下方法制備：發(fā)酵上述的植物乳桿菌SKT109,收集發(fā) 酵產物，離心收集沉淀；將所述沉淀與凍干保護劑按照體積比為1:2混勻，冷凍干燥，得到 SKT109發(fā)酵劑；
[0016] 所述SKT109發(fā)酵劑中植物乳桿菌SKT109的活菌數濃度為101QCfu/g ;
[0017] 所述凍干保護劑由質量百分含量11 %脫脂乳粉、質量百分含量3%甘油、質量百 分含量1 %谷氨酸鈉、質量百分含量1 %乳糖及質量百分含量84%水組成。
[0018] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備胞外多糖的方法。
[0019] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述的植物乳桿菌SKT109,收集發(fā)酵產 物，即得到胞外多糖。
[0020] 上述方法中，所述發(fā)酵的條件為：37°C培養(yǎng)24-36h。
[0021] 上述方法中，在所述收集發(fā)酵產物的步驟后，還包括如下步驟：
[0022] 1)用三氯乙酸加入所述發(fā)酵產物的上清至其質量體積百分比為6%，混勻，收集 上清液A ;
[0023] 2)用95 %乙醇水溶液加入所述上清液A，混勻，收集沉淀；
[0024] 3)溶解所述沉淀后進行透析，得到胞外多糖。
[0025] 由上述的方法制備的胞外多糖也是本發(fā)明保護的范圍；所述胞外多糖具體具有如 下1)和/或2)的特征：
[0026] 1)所述胞外多糖重均分子量為2. I X IO6Da ;
[0027] 2)所述胞外多糖組分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物質摩爾比為 3 :1〇
[0028] 菌株SKT109于2014年12月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所， 郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 10130,該菌株分類命名為植物乳桿菌（Lactobacillus pIantarum)〇
[0029] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現了一株新的具有生理活性植物乳桿菌SKT109,其 可產胞外多糖，利用其制備發(fā)酵酸乳可降低增稠劑和穩(wěn)定劑的用量，同時賦予產品良好的 口感和風味，本發(fā)明在發(fā)酵食品領域具有廣闊的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明具有生理活性產胞外多糖植物乳桿菌SKT109的細胞形態(tài)
[0031] 圖2為本發(fā)明具有生理活性產胞外多糖植物乳桿菌SKT109在SDM培養(yǎng)基中37°C 培養(yǎng)56h期間的活菌數、發(fā)酵液粘度、pH及胞外多糖產量變化情況
[0032] 圖3為本發(fā)明植物乳桿菌SKT109胞外多糖粗品分別在DEAE-52陰離子交換柱（A) 和Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱（B)上的洗脫曲線；
[0033] 其中縱坐標為經過苯酚-硫酸法測得的在490nm處的吸光度值，橫坐標為管號
[0034] 圖4為本發(fā)明植物乳桿菌SKT109胞外多糖純品的體外抑制結腸癌細胞HT-29增 殖
[0035] 圖5為利用具有生理活性產胞外多糖植物乳桿菌SKT109制備的發(fā)酵酸乳與對照 組發(fā)酵酸乳在4°C冷藏21天期間的活菌數、胞外多糖含量、pH及持水力的變化
[0036] 圖6為利用具有生理活性產胞外多糖植物乳桿菌SKT109制備的發(fā)酵酸乳（A)與 對照組發(fā)酵酸乳（B)在4°C冷藏期第1天時的風味離子圖；
[0037] 圖中標號與表3中化合物序號相對應
[0038] 圖7為葡萄糖為基準物質的多糖標準曲線

【具體實施方式】
[0039] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041] 下述實施例中所用培養(yǎng)基的制備方法如下：
[0042] 還原脫脂乳培養(yǎng)基（RSM):將脫脂乳粉按照110g/L用水還原成脫脂乳培養(yǎng)基， 115°C滅菌15min，冷卻備用。
[0043] SDM液體培養(yǎng)基（IL):胰蛋白胨10. 0g、YNB (酵母氮源）6. 7g、K2HP042. 0g、無水乙 酸鈉 5. 0g、檸檬酸鈉 5. 0g、MgS04 ·7Η20 0· 2g、MnS04 ·Η20 0· 05g、葡萄糖 20. 0g、吐溫 801mL、 lmol/L乙酸調ρΗ6· 6,121°C滅菌15min，冷卻備用。
[0044] 植物乳桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基（IL):蛋白胨10. 0g、酵母粉5. 0g、牛肉膏10. 0g、 D-山梨醇20. 0g、無水乙酸鈉5. 0g、檸檬酸銨2. 0g、磷酸鉀2. 0g、硫酸鎂0. lg、硫酸錳 〇. 〇5g、溴甲酚紫0. 02g、環(huán)丙沙星0. 004g (過濾除菌）、瓊脂粉15. 0g，蒸餾水lOOOmL，Imol/ L乙酸調ρΗ6· 0,121°C滅菌15min，冷卻備用。
[0045] 實施例1、菌株的分離和鑒定
[0046] -、菌株的分離
[0047] 本發(fā)明從中國傳統(tǒng)發(fā)酵制品西藏靈菇中分離篩選菌株。將西藏靈菇接種至RSM 中，于42°C培養(yǎng)8h至凝乳凝固。取0. 5mL凝乳加入含4. 5mL滅菌生理鹽水的試管中逐級稀 釋涂布于SDM培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)24?36h。挑取表面光滑、邊緣整齊的乳白色單菌落， 將挑選出的菌落進行反復劃線培養(yǎng)獲得純化的菌株。將純化后的菌株依次經過過氧化氫酶 實驗、革蘭氏染色，篩選出氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性菌株。將其接種到SDM液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)后，加入20%甘油，-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0048] 采用苯酚硫酸法測定多株純培養(yǎng)菌株胞外多糖的產量，篩選出一株胞外多糖產量 高的菌株，將其命名為SKT109。
[0049] 上述苯酚硫酸法測定菌株胞外多糖產量的方法如下：
[0050] 1)葡萄糖標準曲線的繪制
[0051] 取適量分析純葡萄糖置于鼓風干燥箱中80°C干燥2h，冷卻后準確稱取葡萄糖 IOOmg于500mL容量瓶中，加水至刻度。反應體系各溶液體積按表1添加，先將標準葡萄糖 溶液加入到具塞刻度試管中，再加入6 %的苯酚溶液，最后加入IOmL濃硫酸混勻靜置，待其 冷卻后于490nm處測定吸光值，每組做3個平行。以葡萄糖含量（mg/L)為橫坐標，吸光度 (A490)為縱坐標繪制標準曲線，見表1。
[0052] 表1為苯酚-硫酸法標準曲線繪制
[0053]

【權利要求】
1. 一 株植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum SKT109，其保藏編號為 CGMCC No.10130。
2. 權利要求1所述的植物乳桿菌SKT109和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代 謝產物在制備胞外多糖中的應用。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于： 所述胞外多糖具有如下1)和/或2)的特征： 1) 所述胞外多糖重均分子量為2. 1 X 106Da ; 2) 所述胞外多糖組分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物質摩爾比為3 : 1〇
4. 權利要求1所述的植物乳桿菌SKT109和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代 謝產物在制備抑制腫瘤或抑制腫瘤細胞增殖產品中的應用。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于：所述腫瘤為結腸癌；所述腫瘤細胞為結腸 癌細胞HT-29。
6. 權利要求1所述的植物乳桿菌SKT109和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代 謝產物在發(fā)酵酸乳中的應用。
7. -種制備胞外多糖的方法，包括如下步驟：發(fā)酵權利要求1所述的植物乳桿菌 SKT109,收集發(fā)酵產物，即得到胞外多糖。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵的條件為：37°C培養(yǎng)24-36h。
9. 由權利要求7或8中所述的方法制備的胞外多糖；所述胞外多糖具體具有如下1)和 /或2)的特征： 1) 所述胞外多糖重均分子量為2. 1 X 106Da ; 2) 所述胞外多糖組分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物質摩爾比為3 : 1〇
【文檔編號】A23C9/123GK104498402SQ201410797909
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月19日 優(yōu)先權日:2014年12月19日
【發(fā)明者】楊貞耐, 王輯, 田政, 楊亞威, 鄭喆 申請人:北京工商大學