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      一種用于檢測番茄斑萎病毒的nasba方法

      文檔序號:498723閱讀:338來源:國知局
      一種用于檢測番茄斑萎病毒的nasba方法
      【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測番茄斑萎病毒的NASBA方法,所用于檢測TSWV的NASBA引物,其引物序列分別為SEQ ID NO:1~2。發(fā)明根據(jù)TSWV的N基因高度保守區(qū)的設計了兩個特異性內(nèi)引物,該保守基因序列為具有TSWV的不同株系所共有,以保證從株系的水平上檢測不同來源的TSWV的可靠性。本發(fā)明適用于對TSWV進行快速檢測確證,可廣泛應用于生產(chǎn)和環(huán)境中的病害監(jiān)控、進出口貿(mào)易中該病毒的確證。
      【專利說明】-種用于檢測番茄斑萎病毒的NASBA方法

      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明屬于植物病原檢測【技術領域】,具體涉及一種用于檢測番茄斑萎病毒的 NASBA方法。

      【背景技術】
      [0002] 近年來,番爺斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)以其廣泛的寄主范圍 和造成的巨大經(jīng)濟損失已被列為世界危害最大的十種植物病毒之一。在20世紀60?80 年代,該病毒曾在歐美及非洲的煙草和番茄上大流行,每年的發(fā)病率為20 %?50 %,造成 高達數(shù)10億美元的損失。在美國夏威夷、巴西、意大利和南非,TSWV在20世紀80?90年 代的流行曾導致番茄、萵苣等作物近乎絕產(chǎn)。近年來,番茄斑萎病毒屬病毒特別是TSWV,已 成為全世界引起多種經(jīng)濟作物和觀賞植物極大經(jīng)濟損失的重要因子。
      [0003] 我國目前種植的辣椒、洋蔥、生菜等蔬菜種子很多來自于世界各地,尤其是番茄種 子基本依賴進口,進口國別包括美國、日本、荷蘭、泰國等國,這些進口國目前都有番茄斑萎 病毒的發(fā)生與報道,我國口岸曾于2012年在進境的種子中截獲TSWV病毒。而傳統(tǒng)的TSWV 檢測及確證方法一般通過生物寄主、形態(tài)學試驗判定植株是否具有植物病毒,這些方法費 時,操作繁瑣,不能滿足病害防治的需要。
      [0004] 目前針對該病毒的檢疫鑒定主要局限在電鏡技術、血清學技術以及RT-PCR等傳 統(tǒng)檢測技術,如ELISA方法,分子雜交,熒光定量PCR方法,普通PCR方法等等,但在這些方 法中,血清學、雜交技術檢測靈敏度低,操作步驟繁瑣,周期長;電鏡、熒光PCR技術依賴大 型儀器,因此很多實驗室在儀器配置和檢測能力上無法達到要求。另外,由于番茄斑萎病毒 為單鏈RNA病毒,易于降解,以上方法操作的復雜性與靈敏度限制了對該病的檢測與預報。 應用PCR技術檢測雖然靈敏,但目前的檢測實踐表明經(jīng)常出現(xiàn)檢測假陽性或假陰性。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測TSWV的NASBA方法,即利用具有高靈敏性和特 異性的引物引導,在含有T7RNA聚合酶、RNAseH、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、NTP、dNTP及反應緩沖液所 組成的反應體系中,通過連續(xù)均一的體外特異性酶促反應實現(xiàn)核苷酸序列的等溫擴增,對 樣品中的番茄斑萎病毒進行準確的檢測。
      [0006] 本發(fā)明首先提供一種用于檢測TSWV的NASBA引物,其引物序列分別為SEQ ID N0:1 ?2。
      [0007] NA-P1:5 ' -aattctaatacgactcactatagggagTGTCAGTGGCTCCAATCCTG-3 '
      [0008] NA-P2:5 ' -aattctaatacgactcactatagggagGCTTTGTTGACACAAGGCAAAG-3 '。
      [0009] 本發(fā)明還提供一種檢測TSWV的試劑盒,包含有如下的組分
      [0010] I) NASBA擴增反應液A :
      [0011] 每 25μ L 包括 10XAMV buffer 2· 5μ 1,6· 25mmol/L NTPs 3μ L,lOmmol/L dNTPs I. 5 μ L,10 μ mol/L 弓丨物 ΝΑ-PI、NA-P2 各 0· 5 μ L,雙蒸水 9ml ;
      [0012] 其中 10XAMV buffer 為含 40mmol/L ΡΗ8· 5 的 Tris-HCL,70mmol/L KCL,12mmol/ L MgCL2,5mmol/L DTT 的緩沖液;
      [0013] 2) NASBA擴增反應液B:
      [0014] 所述的NASBA擴增反應液B包含有:0· 5U RNaseH,32U T7RNA聚合酶,6. 4U AMV反 轉(zhuǎn)錄酶,2 μ L DMS0,0· 1 μ Llmol/L 二硫蘇糖醇,0· 25 μ L lOmg/mL BSA,20U RNA 酶抑制劑,
      [0015] 上述的試劑盒用于檢測TSWV,包含有如下的步驟:
      [0016] 1)樣品RNA的提取
      [0017] A、取0. Ig樣品,加液氮研磨成粉末狀,將研磨物迅速移入1.5mL離心管中,加入 1mT, Trizol Reagent,顛倒混勻,2°C?8°C,12000g,離心 IOmin ;
      [0018] B、取上清,15°C?30°C,放置5min;加入0. 2mL氯仿,用手劇烈震蕩(勿渦旋振 蕩),約 15s,15--3(TC,放置 2min ?3min ;2°C?8°C,12000g,離心 15min ;
      [0019] C、吸取600μ?的上層水相,加500μ?異丙醇混合上清液,15°C?30°C,放置 IOmin ;2°C?8°C,12000g,離心 IOmin ;
      [0020] D、去除上清液,沉淀中加入ImL 75%乙醇,洗滌;2°C?8°C,7500g,離心5min ;
      [0021] E、去除上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 μ L?50 μ L無 RNase的水中,即為 待檢模板RNA ;
      [0022] 2)進行 TSWV 的 NASBA 擴增
      [0023] Α、在裝有14 μ L環(huán)介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢
      [0024] Α、在裝有14 μ L環(huán)介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA,
      [0025] Β、在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5min ;
      [0026] C.在反應管中迅速加入4 μ L反應液B ;
      [0027] D.于 41°C 溫育 2h;
      [0028] E.將金屬浴調(diào)到4 C中止反應,3min后取出;
      [0029] 3)電泳檢測
      [0030] 取3g瓊脂糖,于IOOmL電泳緩沖液中加熱,充分溶化,加入溴化乙錠貯存液至終濃 度為0. 5 μ g/mL,制膠,在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液面剛剛沒過凝膠;將3 μ L?6 μ L PCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合,點樣;9V/cm恒壓電泳,直至溴酚藍指示劑遷移 至凝膠中部;紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。如果擴增片段為235bp,說明待檢病毒是 TSWV,如果沒有出現(xiàn)235bp擴增片段,則說明待檢病毒不是TSWV。
      [0031] 本發(fā)明根據(jù)TSWV的N基因高度保守區(qū)的設計了兩個特異性內(nèi)引物,該保守基因序 列為具有TSWV的不同株系所共有,以保證從株系的水平上檢測不同來源的TSWV的可靠性。 本發(fā)明適用于對TSWV進行快速檢測確證,可廣泛應用于生產(chǎn)和環(huán)境中的病害監(jiān)控、進出口 貿(mào)易中該病毒的確證。
      [0032] 與現(xiàn)有技術相比,本發(fā)明的有益效果包括:
      [0033] 第一,便捷性。該發(fā)明在進行恒溫擴增時,不需要昂貴的核酸擴增反應裝置,整個 過程始終在42°C進行,無需熱循環(huán)儀,僅1個普通的恒溫水浴鍋就可完成。
      [0034] 第二,精確度高。該發(fā)明酶循環(huán)反應的循環(huán)數(shù)少,不需高溫變性步驟,相對于 RT-PCR錯配率較低,更適于檢測和定量特異RNA。
      [0035] 第三,靈敏度高。該發(fā)明比起PCR技術,能用較少的循環(huán)便擴增出大量的目的基 因,保證了檢測的高敏感性。
      [0036] 第四,縮短周期。由于反轉(zhuǎn)錄過程被直接合并到擴增反應中,PCR大約需要20輪 循環(huán)才能擴增IO 6倍,而NASBA只需循環(huán)4?5輪即可達到IO6倍。
      [0037] 第五,降低了對植物RNA模板的質(zhì)量要求。由于細胞壁中富含大量的多糖、酚類物 質(zhì),植物病毒RNA的提取存在著穩(wěn)定性差、重復性低、效率低等問題,加之在提取過程中RNA 本身的自降解現(xiàn)象,病毒RNA的含量往往較低,對檢測方法的靈敏度和穩(wěn)定性提出了較高 要求。由于該發(fā)明針對的模板是RNA,反應的產(chǎn)物也是RNA,反應的結(jié)果不受環(huán)境中DNA的 影響。即使存在外來的雙鏈DNA污染,但由于其不具備T7啟動子序列,不可能被擴增,其 次,該反應只在42°C恒溫條件下進行,不需高溫變性步驟,所以NASBA反應流程不會受到外 來雙鏈DNA的污染,因此對于模板純度和質(zhì)量要求較低。

      【專利附圖】

      【附圖說明】:
      [0038] 圖1為本發(fā)明對病株樣品中NASBA擴增圖譜:其中M:ssRNA Ladder marker ;1 : TSWV感病材料;2 :健康番茄。
      [0039] 圖2特異性結(jié)果圖:其中M:ssRNA Ladder marker ;1 :番爺斑萎病毒;2 :陰性對 照;3 :煙草環(huán)斑病毒;4 :番茄黑環(huán)病毒;5 :黃瓜花葉病毒;6 :番茄花葉病毒;7 :番茄黃化 曲葉病毒。
      [0040] 圖 3NASBA 靈敏度檢測圖譜:其中 M: ssRNA Ladder marker ; 1 ?6 :1. 56X 1CT1、 1. 56Χ1(Γ2、1· 56Χ1(Γ3、1· 56Χ1(Γ4、1· 56Χ1(Γ5、1· 56Xl(T6ng/y LTSWV 感病材料總 RNA。
      [0041] 圖 4PCR 靈敏度圖譜:其中 M:DNA D2000marker ;1 ?6 :1. 56父10'1· 56ΧΚΓ2、 1. 56 X 10' 1. 56 X 1(Γ4、1. 56 X 1(Γ5、1. 56 X l(T6ng/ μ LTSWV 感病材料總 RNA。
      [0042] 圖5 :實際樣品檢測:其中Μ: ssRNA Ladder marker ; 1?9 :實際樣品。

      【具體實施方式】
      [0043] NASBA (Nuleic and sequence based amplipicain, NASBA)即"核酸序列依賴性擴 增"檢測技術是一種經(jīng)典的恒溫擴增技術,適用于單鏈核糖核酸RNA -步擴增及檢測,已廣 泛應用于人類及動植物病原的檢測與診斷。NASBA是由一對引物引導的,在含有T7RNA聚 合酶、RNAseH、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各種反應緩沖液所組成的標準反應體 系中,通過連續(xù)均一的體外特異性酶促反應實現(xiàn)核苷酸序列的等溫擴增。
      [0044] 本發(fā)明首先依據(jù)TSWV核衣殼蛋白(nucterotein,N)設計特異性引物;再提取待測 樣品的核糖核酸(RNA),然后分別以N基因的特異性引物進行NASBA擴增;用瓊脂糖凝膠電 泳對擴增產(chǎn)物進行檢測,最后根據(jù)NASBA擴增結(jié)果來判定樣品中是否含有TSWV。
      [0045] 本發(fā)明實施例所使用的材料信息如下:
      [0046] 1、病毒
      [0047] 番茄斑萎病毒采自云南楚雄開放種植的田間植株果實,煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ring spot virus, TRSV)分離自進口日本甜葉菊、番爺黑環(huán)病毒(Tomato black ring virus, TBRV)分離于意大利黃瓜種子的黃瓜花葉病毒(Cuccumber mosaic virus, CMV)與 番爺花葉病毒(Tomato mosaic virus, ToMV)分離于智利西瓜種子的番爺黃化曲葉病毒 (Tomato yellow curl virus, ToYCLV)分離于青島番爺種植區(qū)。
      [0048] 2、試劑
      [0049] 反轉(zhuǎn)錄聚合酶AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7RNA聚合酶、dNTP、ssRNA marker、 rNTP均購于NEW ENGLAND BIOLAB公司;PCR擴增試劑、DNA marker及等均購于北京天根公 司。
      [0050] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的說明
      [0051] 實施例1 :引物的設計
      [0052] 根據(jù)NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中TSWV的N基因全長序列(KC294570. 1 (昆明分離 物)、HM581936. 1 (南京分離物)、JF730744. 1 (韓國分離物)、HM180089 (臺灣分離物)、 HQ406984. 1 (美國分離物)、KC494503. 1 (新西蘭分離物)、KM379142. 1 ( 土耳其分離物)、 KF146703. 1(委內(nèi)瑞拉分離物)),在保證擴增的兼并性和通用性的前提下通過比較分析 TSWV N基因的高度保守區(qū),設計5'端帶有T7啟動子序列NASBA反應引物(NA-P1\NA-P2、 NA-P3\NA-P4),設計完成后將引物在數(shù)據(jù)庫的Primer-Blast模塊下進行比對驗證。其中 NA_P3\NA_P4 的序列分別為:NA_P3:5' -aattctaatacgactcactatagggagTCCTAAGGCTTCCCT GGTGT-3,和 NA_P4:5, -aatt-ctaatacgactcactatagggagGCTTGTCGAGGAAACTGGGA-3'。
      [0053] 在對陽性番茄和陰性番茄檢測中,以NA-P1\NA_P2為擴增引物對時,TSWV陽性樣 品的擴增產(chǎn)物在RNA marker對應235bp左右的位置出現(xiàn)了預期特異的單一條帶,而陰性對 照無條帶。而以NA-P3\NA-P4擴增引物對時,陽性樣品出現(xiàn)了包括預期條帶在內(nèi)的雙帶,陰 性對照也出現(xiàn)了一條擴增條帶,其大小與陽性樣品的非預期條帶相近。后經(jīng)測序證實,該條 帶的產(chǎn)物為番茄線粒體RNA序列,長為312bp。雖然該產(chǎn)物比NA-P1\NAP2大一些,但極易對 檢測結(jié)果造成混淆,也容易導致擴增效率的下降。因此,選擇引物對NA-P1\NAP2作為本發(fā) 明的NASBA檢測引物。
      [0054] 實施例2 :TSWV的檢測
      [0055] 1、病毒RNA的提取
      [0056] 取0. Ig樣品,加液氮研磨成粉末狀,將研磨物迅速移入I. 5mL離心管中,加入ImL Trizol Reagent,顛倒混勻,2 °C ?8 °C,12000g,離心 lOmin。取上清,15 °C ?30 °C,放置 5min ;加入0. 2mL氯仿,用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩),約15s。15°C?30°C,放置2min? 3min ;2°C?8°C,12000g,離心15min。小心吸取約為600μ L的上層水相,勿擾動中間相和 下層相。加50(^1^異丙醇混合上清液,151:?301:,放置101^11。21:?81:,1200(^,離心 lOmin。去除上清液,沉淀中加入ImL 75%乙醇,洗滌;2°C?8°C,7500g,離心5min。去除 上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 μ L?50 μ L無 RNase的水中,即為待檢模板RNA。
      [0057] 2、NASBA 擴增體系
      [0058] Α、在裝有14 μ L環(huán)介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA,
      [0059] Β、在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5min,;
      [0060] C.在反應管中迅速加入4 μ L反應液B ;
      [0061] D.于 41°C 溫育 2h;
      [0062] E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應,3min后取出;
      [0063] 3、電泳檢測
      [0064] 取3g瓊脂糖,于IOOmL電泳緩沖液中加熱,充分溶化,加入溴化乙錠貯存液至終濃 度為0. 5 μ g/mL,制膠,在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液面剛剛沒過凝膠;將3 μ L?6 μ L PCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合,點樣;9V/cm恒壓電泳,直至溴酚藍指示劑遷移 至凝膠中部;紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。預期產(chǎn)物大小為235bp。見圖1。
      [0065] 本發(fā)明采用NASBA檢測TSWV完成以下實驗:
      [0066] (1)特異性實驗
      [0067] 1、提取番茄斑萎病毒、煙草環(huán)斑病毒、番茄黑環(huán)病毒、黃瓜花葉病毒與番茄花葉病 毒、番茄黃化曲葉病毒的RNA,使用NASBA方法進行檢測。
      [0068] 2、病毒RNA的提取
      [0069] 取0. Ig樣品,加液氮研磨成粉末狀,將研磨物迅速移入I. 5mL離心管中,加入ImL Trizol Reagent,顛倒混勻,2 °C ?8 °C,12000g,離心 lOmin。取上清,15 °C ?30 °C,放置 5min ;加入0. 2mL氯仿,用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩),約15s。15°C?30°C,放置2min? 3min ;2°C?8°C,12000g,離心15min。小心吸取約為600μ L的上層水相,勿擾動中間相和 下層相。加50(^1^異丙醇混合上清液,151:?301:,放置101^11。21:?81:,1200(^,離心 lOmin。去除上清液,沉淀中加入ImL 75%乙醇,洗滌;2°C?8°C,7500g,離心5min。去除 上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 μ L?50 μ L無 RNase的水中,即為待檢模板RNA。 [0070] 3、擴增反應
      [0071] Α、在裝有14 μ L環(huán)介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA,
      [0072] Β、在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5min,;
      [0073] C.在反應管中迅速加入4μ L反應液B ;
      [0074] D.于 41? 溫育 2h;
      [0075] E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應,3min后取出;
      [0076] 4、NASBA產(chǎn)物電泳檢測
      [0077] 取3g瓊脂糖,于IOOmL電泳緩沖液中加熱,充分溶化,加入溴化乙錠貯存液至終濃 度為0. 5 μ g/mL,制膠,在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液面剛剛沒過凝膠;將3 μ L?6 μ L PCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合,點樣;9V/cm恒壓電泳,直至溴酚藍指示劑遷移 至凝膠中部;紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。電泳結(jié)果顯示,使用NASBA方法進行檢測 番爺斑萎病毒、煙草環(huán)斑病毒、番爺黑環(huán)病毒、黃瓜花葉病毒與番爺花葉病毒、番爺黃化曲 葉病毒的RNA,只有番茄斑萎病毒得到預期235bp的擴增產(chǎn)物(見圖2)。
      [0078] (2)敏感性比對實驗
      [0079] 1、用DEPC水將TSWV病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀釋,依次為I. 56X 10' 1.56\10'1.56\10'1.56\10'1.56\10'1.56父10-6叩/^1^,各取2 4 1^為模板分別進 行NASBA及RT-PCR擴增反應。NASBA引物選用NA-Pl和NA-P2,PCR引物序列(5' -3')分 別為:Pl :TGTCAGTGGCTCCAATCCTG 和 P2 :GCTTTGTTGACACAAGGCAAAG
      [0080] 2、病毒RNA的提取
      [0081] 取0. Ig樣品,加液氮研磨成粉末狀,將研磨物迅速移入I. 5mL離心管中,加入ImL Trizol Reagent,顛倒混勻,2 °C ?8 °C,12000g,離心 lOmin。取上清,15 °C ?30 °C,放置 5min ;加入0. 2mL氯仿,用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩),約15s。15°C?30°C,放置2min? 3min ;2°C?8°C,12000g,離心15min。小心吸取約為600μ L的上層水相,勿擾動中間相和 下層相。加50(^1^異丙醇混合上清液,151:?301:,放置101^11。21:?81:,1200(^,離心 lOmin。去除上清液,沉淀中加入ImL 75%乙醇,洗滌;2°C?8°C,7500g,離心5min。去除 上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 μ L?50 μ L無 RNase的水中,即為待檢模板RNA。
      [0082] 3、NASBA 擴增反應
      [0083] A、在裝有14 μ L環(huán)介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA,
      [0084] Β、在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5min,;
      [0085] C.在反應管中迅速加入4 μ L反應液B ;
      [0086] D.于 41°C 溫育 2h;
      [0087] E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應,3min后取出;
      [0088] 4、RT-PCR 擴增反應
      [0089] RT-PCR擴增體系參照TIANGEN公司的Quant -步法RT-PCR試劑盒說明配置,反應 條件為 50°C反轉(zhuǎn)錄 30min;94°C預變性 2min;94°C 30s,53°C 30s,72°C 30s,循環(huán)反應 35 次;65°C延伸 lOmin。
      [0090] 5、NASBA產(chǎn)物電泳檢測
      [0091] 取3g瓊脂糖,于IOOmL電泳緩沖液中加熱,充分溶化,加入溴化乙錠貯存液至終濃 度為0. 5 μ g/mL,制膠,在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液面剛剛沒過凝膠;將3 μ L?6 μ L PCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合,點樣;9V/cm恒壓電泳,直至溴酚藍指示劑遷移 至凝膠中部;紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。NASBA產(chǎn)物鑒定:電泳結(jié)果顯示,本發(fā)明 的引物檢測番茄斑萎病毒能夠得到1〇_ 4稀釋倍數(shù)的模板(見圖3),可達到fg級水平,使用 RT-PCR方法能夠得到KT3稀釋倍數(shù)(圖4),只有pg級水平。
      [0092] 實施例3 :實際樣品檢測及對比實驗
      [0093] 將從云南、山東、四川等地田間采集的具有典型TSWV癥狀的病樣及實驗室留樣, 分別采用NASBA、RT-PCR進行檢測,比較兩種方法的效果,以進一步評估NASBA方法的可靠 性。
      [0094] 1、實際樣品NASBA檢測
      [0095] 1)病毒RNA的提取
      [0096] 取0. Ig樣品,加液氮研磨成粉末狀,將研磨物迅速移入I. 5mL離心管中,加入ImL Trizol Reagent,顛倒混勻,2 °C ?8 °C,12000g,離心 lOmin。取上清,15 °C ?30 °C,放置 5min ;加入0. 2mL氯仿,用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩),約15s。15°C?30°C,放置2min? 3min ;2°C?8°C,12000g,離心15min。小心吸取約為600μ L的上層水相,勿擾動中間相和 下層相。加50(^1^異丙醇混合上清液,151:?301:,放置101^11。21:?81:,1200(^,離心 lOmin。去除上清液,沉淀中加入ImL 75%乙醇,洗滌;2°C?8°C,7500g,離心5min。去除 上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 μ L?50 μ L無 RNase的水中,即為待檢模板RNA。
      [0097] 2)擴增反應
      [0098] Α、在裝有14 μ L環(huán)介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA,
      [0099] Β、在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5min,;
      [0100] C.在反應管中迅速加入4μ L反應液B ;
      [0101] D.于 41。〇溫育211;
      [0102] Ε.將金屬浴調(diào)到4 C中止反應,3min后取出;
      [0103] 3) NASBA 產(chǎn)物鑒定
      [0104] 紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果并記錄,電泳結(jié)果顯示,在9份樣品中3份樣品為陽 性,其他樣品為陰性(見圖5)。
      [0105] 2、PCR 擴增
      [0106] 1)方法:普通RT-PCR反應條件為50°C反轉(zhuǎn)錄30min ;94°C預變性2min ;94°C 30s, 53°C 30s,72°C 30s,循環(huán)反應 35 次;65°C延伸 lOmin。
      [0107] 2)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果:在9份樣品中,3份為陽性,其余為6份。
      [0108] 結(jié)論:利用上述NASBA和PCR方法同時檢測實際樣品,兩種方法的符合率100%, 但NASBA對設備要求更低,便捷性更高。
      【權利要求】
      1. 一種檢測番茄斑萎病毒的NASBA擴增引物對,其特征在于,所述的引物對的上游引 物、下游引物的序列分別為SEQ ID NO: 1?2。
      2. 權利要求1所述的引物對在檢測植物樣品中番茄斑萎病毒的應用。
      3. -種檢測番茄斑萎病毒的NASBA擴增試劑盒,包括如下組分: 1. NASBA擴增反應液A : 每 25iiL 包括 10XAMV buffer 2.5iil,6.25mmol/L NTPs 3iiL,10mmol/L dNTPs 1. 5 ii L,10 ii mol/L 引物 NA-P1、NA-P2 各 0? 5 ii L,雙蒸水 9ml ;其中引物 NA-P1、NA-P2 為權 利要求1所述的上游引物、下游引物; 其中 10XAMV buffer 為含 40mmol/L PH8. 5 的 Tris-HCL,70mmol/L KCL,12mmol/L MgCL2,5mmol/L DIT 的緩沖液; 2. NASBA擴增反應液B: 所述的NASBA擴增反應液B包含有:0. 5U RNaseH,32U I7RNA聚合酶,6. 4U AMV反轉(zhuǎn)錄 酶,2 ii L DMS0,0? 1 ii Llmol/L 二硫蘇糖醇,0? 25 ii L 10mg/mL BSA,20U RNA 酶抑制劑。
      4. 權利要求3所述的試劑盒在檢測植物樣品中番茄斑萎病毒的應用。
      5. -種使用權利要求3所述的試劑盒檢測植物樣品中番茄斑萎病毒的方法,其特征在 于,所述的方法包括如下的步驟: 1) 樣品RNA的提取 A、 取0. lg樣品,加液氮研磨成粉末狀,將研磨物迅速移入1.5mL離心管中,加入lmL Trizol Reagent,顛倒混勻,2°C?8°C,12000g,離心 lOmin, B、 取上清,15°C?30°C,放置5min ;加入0. 2mL氯仿,用手劇烈震蕩,約15s,15°C? 3(TC,放置 2min ?3min ;2°C?8°C,12000g,離心 15min, C、 小心吸取約為600 y L的上層水相,勿擾動中間相和下層相,加500 y L異丙醇混合上 清液,15°C?30°C,放置 10min,2°C?8°C,12000g,離心 10min ; D、 去除上清液,沉淀中加入lmL 75%乙醇,洗滌;2°C?8°C,7500g,離心5min ; E、 去除上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 ii L?50 ii L無RNase的水中,即為待檢 模板RNA ; 2) 進行TSWV的NASBA擴增 A. 在裝有14 y L環(huán)介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 y L待檢模板RNA, B. 在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5min,; C. 在反應管中迅速加入4 ii L反應液B ; D. 于41°C溫育2h; E. 將金屬浴調(diào)到4°C中止反應,3min后取出; 3) 電泳檢測 取3g瓊脂糖,于100mL電泳緩沖液中加熱,充分溶化,加入溴化乙錠貯存液至終濃度為 0. 5 y g/mL,制膠,在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液面剛剛沒過凝膠;將3 y L?6 y L PCR 擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合,點樣;9V/cm恒壓電泳,直至溴酚藍指示劑遷移至凝 膠中部;紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。
      【文檔編號】C12R1/94GK104404173SQ201410798148
      【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月21日 優(yōu)先權日:2014年12月21日
      【發(fā)明者】吳興海, 陳長法, 封立平, 王簡, 尼秀媚, 王英超, 張云霞, 余冬冬 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
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