一種體外重組的屏障缺陷表皮模型及構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種體外重組的屏障缺陷表皮模型及其構(gòu)建方法,該缺陷模型在轉(zhuǎn)染成功的表皮細(xì)胞中，兜甲蛋白基因水平的表達(dá)量為正常細(xì)胞的40％；用該細(xì)胞構(gòu)建的模型，兜甲蛋白含量下降為正常模型的35％；該缺陷模型與正常模型相比，模型厚度為正常模型的60％；活細(xì)胞層數(shù)為3-4層；模型活力測(cè)定OD值維持在0.8-1.0。該屏障缺陷表皮模型的構(gòu)建方法,包括兜甲蛋白基因缺陷表達(dá)的表皮細(xì)胞的制備、缺陷培養(yǎng)基的制備及屏障缺陷表皮模型的三維培養(yǎng)。本發(fā)明應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建屏障缺陷的表皮替代模型，對(duì)于開發(fā)屏障修復(fù)性化妝品及化妝品功效性驗(yàn)證有重要意義。
【專利說(shuō)明】一種體外重組的屏障缺陷表皮模型及構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種體外重組的屏障缺陷表皮模型及構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著體外科學(xué)的發(fā)展，體外皮膚替代模型的開發(fā)與利用取得突破性進(jìn)展。目前國(guó) 外已有Epiderm、Episkin兩款表皮皮膚替代模型研發(fā)成功，并被多家實(shí)驗(yàn)室和化妝品公司 購(gòu)買用于化妝品皮膚安全性評(píng)價(jià)測(cè)試。
[0003] 近年來(lái)，隨著消費(fèi)者對(duì)化妝品功效重視度的提高，皮膚模型不再用于單一的安全 性評(píng)價(jià)，功效性驗(yàn)證成為未來(lái)的發(fā)展方向。與安全性評(píng)價(jià)相比，功效性驗(yàn)證對(duì)皮膚模型的要 求更為嚴(yán)格，它更注重于模型與問題肌膚的真實(shí)擬合度。隨著年齡的變化及環(huán)境因素的影 響，人體肌膚的屏障功能逐漸下降，各種肌膚問題也會(huì)逐漸顯現(xiàn)。導(dǎo)致皮膚屏障功能下降的 因素有很多，最主要原因是表皮細(xì)胞增殖分化平衡逐漸被打破，屏障相關(guān)膜套蛋白表達(dá)量 發(fā)生改變，如LOR蛋白的含量隨著年齡的升高，顯著下降等?，F(xiàn)有商品化的表皮模型都是模 擬健康皮膚構(gòu)建而成，模型的屏障功能較強(qiáng)，用于功效性評(píng)價(jià)，難以做到真實(shí)、客觀。因此， 開發(fā)新的屏障功能缺陷的體外皮膚模型更為重要。
[0004] 皮膚角質(zhì)層是人體發(fā)揮自身屏障，抵御外界環(huán)境的主戰(zhàn)場(chǎng)。角質(zhì)層獨(dú)特的"磚灰" 結(jié)構(gòu)是屏障的基石。三大脂類物質(zhì)（神經(jīng)酰胺、膽固醇、脂肪酸）與角質(zhì)細(xì)胞膜套蛋白交聯(lián) 共同構(gòu)建了磚灰結(jié)構(gòu)。已有研宄證明，角質(zhì)層膜套蛋白的主要成分是兜甲蛋白（Loricrin)， 其含量占膜套蛋白總含量的80%以上。并且，隨著年齡的增加，人體皮膚屏障功能逐漸降 低，角質(zhì)層細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，兜甲蛋白含量也逐步降低，間接說(shuō)明兜甲蛋白對(duì)人體屏障功 能的發(fā)揮，具有重要作用?；诖耍绻ㄟ^(guò)分子生物學(xué)方法如（RNA干擾技術(shù)）缺陷兜甲蛋 白基因（LOR)的表達(dá)，同時(shí)改變模型培養(yǎng)液中表皮生長(zhǎng)因子與鈣離子的濃度，模擬老化皮 膚增殖分化的類似環(huán)境，達(dá)到實(shí)現(xiàn)構(gòu)建表皮屏障功能缺陷模型的目的。表皮生長(zhǎng)因子（EGF) 通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活受體內(nèi)在的酪氨酸激酶的活性，啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn) DNA合成和細(xì)胞的增殖。表皮鈣離子從基底層到顆粒層依次形成梯度，在顆粒層上層達(dá)到最 高水平（1.5mmol/L)。媽離子的濃度直接影響表皮細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記（marker)的表達(dá)，對(duì) 被月旲顆粒中脂質(zhì)的有序運(yùn)輸及屏障相關(guān)的蛋白的有序穩(wěn)定表達(dá)至關(guān)重要。
[0005] RNA干擾技術(shù)（RNA interference，縮寫為RNAi)指一種分子生物學(xué)上由雙 鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。傳統(tǒng)的RNA干擾方法是向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染短的雙鏈RNA分子 (double-standed RNA, dsRNA)，但在實(shí)際應(yīng)用中，存在穩(wěn)定性差、可能改變其他基因正常表 達(dá)等缺陷。Stealth? RNAi是新一代的RNA干涉分子，具有更高的特異性和穩(wěn)定性。其主要 流程是：1、引物設(shè)計(jì)與合成：設(shè)計(jì)3條Stealth TMsiRNA和1條陰性對(duì)照（設(shè)立陰性對(duì)照的 目的是用來(lái)檢測(cè)RNAi的特異性。陰性對(duì)照，也稱為"零亂" siRNA (scrambled siRNA)，是在 打亂特異性siRNA序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的），并由引物設(shè)計(jì)公司進(jìn)行合成。2、將核酸導(dǎo)入細(xì)胞， 實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染；3、檢測(cè)篩選對(duì)LOR基因有顯著抑制的表皮細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上利用缺陷的表皮細(xì) 胞進(jìn)行模型構(gòu)建，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)模型生發(fā)階段關(guān)鍵因子的濃度，模擬問題肌膚微環(huán)境，構(gòu)建 屏障缺陷表皮皮膚模型，用于化妝品功效性檢測(cè)。
[0006] 截止目前，曾有國(guó)外學(xué)者利用RNA干擾技術(shù)，缺陷表皮細(xì)胞保濕相關(guān)絲聚蛋白基 因（FLG)的表達(dá)，構(gòu)建有保濕缺陷的表皮模型。本發(fā)明所構(gòu)建的缺陷模型與該模型相比，更 接近于問題肌膚狀態(tài)，對(duì)于開發(fā)屏障修復(fù)性化妝品及化妝品功效性驗(yàn)證更有意義。與本文 類似的通過(guò)改變LOR基因的表達(dá)構(gòu)建屏障缺陷的表皮模型，尚未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建靶向兜甲蛋白基因（LOR)的 Stealth?RNA，轉(zhuǎn)染人表皮細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染驗(yàn)證成功的基礎(chǔ)上，選擇含有缺陷LOR基因的表皮 細(xì)胞構(gòu)建表皮模型，同時(shí)通過(guò)改變表皮培養(yǎng)液中生長(zhǎng)因子（EGF)及鈣離子的濃度，調(diào)節(jié)模 型增殖分化平衡，從而構(gòu)建體外重組的屏障缺陷表皮模型，適用于化妝品功效性驗(yàn)證試驗(yàn)。
[0008] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明所提出的體外重組的屏障缺陷表皮模型，其特點(diǎn)在于：兜甲蛋白基因水平 的表達(dá)在轉(zhuǎn)染成功的表皮細(xì)胞中，明顯降低一表達(dá)量為正常細(xì)胞的40% ;用該細(xì)胞構(gòu)建的 模型兜甲蛋白含量明顯下降一表達(dá)量為正常細(xì)胞的35%。模型形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)方面，缺陷模型 與正常模型相比，模型厚度變薄一為正常模型厚度的60%;活細(xì)胞層數(shù)變少一為3-4層。模 型活力測(cè)定OD值為0. 8?I. 0 (正常模型OD值在I. 0?2. 5之間）。用缺陷模型與正常模 型同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性物功效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示缺陷模型對(duì)活性物的作用效果更為敏感，模型 給藥前后形態(tài)學(xué)差異更為顯著。
[0010] 本發(fā)明含有缺陷屏障的表皮皮膚模型的制備方法，包括兜甲蛋白基因缺陷表達(dá)的 表皮細(xì)胞的制備、缺陷培養(yǎng)基的制備及屏障缺陷表皮模型的三維培養(yǎng)，具體步驟如下： [0011] 一.兜甲蛋白基因缺陷表達(dá)的表皮細(xì)胞的制備
[0012] 步驟一、RNA干涉分子（Stealth? RNA)的設(shè)計(jì)與合成：
[0013] 本發(fā)明人根據(jù)LOR基因序列（Gene Bank號(hào)NM_000427)，遵循EIbashir的siRNA 序列設(shè)計(jì)原則，采用siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3條siRNAs和一條scramble對(duì)照。設(shè)計(jì)3條 siRNAs的目的是通過(guò)增加平行試驗(yàn)以期提高試驗(yàn)的成功率。本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的三段siRNA位 點(diǎn)基本上分散于mRNA的全長(zhǎng)上，目的是分散設(shè)計(jì)可以減少實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。本步驟設(shè)計(jì)的 Stealth? RNA,由Invitrogen公司代為合成。3條siRNA和scrambled對(duì)照的具體序列如 下表所示：
[0014] 表I. siRNA序列列表
[0015]

【權(quán)利要求】
1. 一種體外重組的屏障缺陷表皮模型，其特征在于： 在轉(zhuǎn)染成功的表皮細(xì)胞中，兜甲蛋白基因水平的表達(dá)量為正常細(xì)胞的40% ;用該細(xì)胞 構(gòu)建的模型，兜甲蛋白含量下降為正常模型的35%;該缺陷模型與正常模型相比，模型厚度 為正常模型的60% ;活細(xì)胞層數(shù)為3-4層；模型活力測(cè)定OD值維持在0. 8-1. 0。
2. -種體外重組的屏障缺陷表皮模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括兜甲蛋白基因缺 陷表達(dá)的表皮細(xì)胞的制備、缺陷培養(yǎng)基的制備及屏障缺陷模型的三維培養(yǎng)，具體方法步驟 如下： 1) 兜甲蛋白基因缺陷表達(dá)的表皮細(xì)胞的制備 步驟一、RNA干涉分子（Stealth?RNA)的設(shè)計(jì)與合成： 根據(jù)LOR基因序列（Gene Bank號(hào)NM_000427)，遵循EIbashir的siRNA序列設(shè)計(jì)原則， 采用siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3條siRNAs和一條scramble對(duì)照； 步驟二、RNA干涉分子（Stealth?RNA)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后鑒定分析： 本步驟中所選用的表皮細(xì)胞取自有細(xì)胞庫(kù)中凍存的表皮第二代細(xì)胞，復(fù)蘇后，傳代至 第4代或第5代備用，隨后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染前試劑準(zhǔn)備工作和轉(zhuǎn)染操作，具體步驟如下： (1) 表皮細(xì)胞接種：按照IX 104-1. 5 X 104個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種細(xì)胞，37°C， C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到30?50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染； (2) 轉(zhuǎn)染液的制備及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染操作前，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書制備轉(zhuǎn)染液。轉(zhuǎn)染液 制備具體步驟及孔板每孔轉(zhuǎn)染試劑，具體用量如下： ① 稀釋Lipofectamine?2000 Regent :使用前遵照說(shuō)明書，輕搖混勻 Li pofectamine?20()() Regent，然后吸取 6-15 jiLLi pofectamine?2000 Regent 在 150. L Opt i-MEM?低血清培養(yǎng)基中稀釋待用； ② 稀釋siRNA:根據(jù)siRNA的制備濃度，吸取總量為14yg的siRNA于 700yLOpU-MEM?低血清培養(yǎng)基稀釋待用； ③ 脂質(zhì)體-S iRNA混合物的制備：各吸取步驟①和②配置的液體150 y L，按照體積比 1:1，混勻，室溫靜置5分鐘； ④ 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：按照每孔250 yL的加樣量將步驟③配置的脂質(zhì)體-S iRNA混合物添加至 含有2ml表皮培養(yǎng)液的細(xì)胞孔中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染； ⑤ 觀察分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞：將步驟④進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的細(xì)胞置于37°C，C02培養(yǎng)箱孵育 24-72h，然后顯微觀察并檢測(cè)LOR基因的表達(dá)； 2) 缺陷培養(yǎng)基的制備 步驟三、屏障缺陷的表皮皮膚模型的制備： ① 表皮細(xì)胞接種：將步驟二轉(zhuǎn)染后經(jīng)過(guò)PCR鑒定，LOR基因抑制率最高的SiRNAl轉(zhuǎn)染 組細(xì)胞作為接種對(duì)象，按照7E5-lE6/cm2的接種密度接種于培養(yǎng)小室； ② 模型培養(yǎng)液的制備：根據(jù)人體表皮的生發(fā)特點(diǎn)，模型培養(yǎng)液根據(jù)模型生發(fā)特點(diǎn)分 為兩種，液下培養(yǎng)液和氣液面培養(yǎng)液：液下培養(yǎng)液的主要成分及含量具體如下：基礎(chǔ)培 養(yǎng)液 FAD 1L，氫化可的松 0. 4-0. 6 y g/mL，胰島素 1-1. 5 y g/mL，腺嘌呤 2. 2-2. 4 y g/ mL，EGF 0.05-0. 15ng/mL;氣液面培養(yǎng)液的主要成分及含量如下：基礎(chǔ)液FAD 1L，氯化鈣 0? 47-0. 6mmol/L，氫化可的松 0? 2-0. 4 y g/mL，胰島素 1-1. 5 y g/mL,腺嗓呤 2. 2-2. 4 y g/ mL, VC 20-30ng/mL ； ③模型培養(yǎng)：表皮模型培養(yǎng)液根據(jù)小室與培養(yǎng)液的接觸程度分為液下培養(yǎng)液和氣液面 培養(yǎng)液兩種；模型生發(fā)期總計(jì)l〇d，在模型接種后1-2天采用液下培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液添加 量為：小室內(nèi)部200 yL，孔板內(nèi)添加量為I. 5mL。模型生發(fā)3-10天，培養(yǎng)液更換為氣液面培 養(yǎng)液，培養(yǎng)液添加量為：小室內(nèi)部不添加，孔板內(nèi)添加量為I. 5mL，48h換液一次。模型總計(jì) 培養(yǎng)IOd后出廠。
【文檔編號(hào)】C12N15/88GK104498437SQ201410803937
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】張艷云, 盧永波 申請(qǐng)人:陜西博溪生物科技有限公司