一種疏水色譜純化激肽釋放酶的方法及含有激肽釋放酶的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種疏水色譜純化激肽釋放酶的方法及含有激肽釋放酶的藥物組合物，該方法通過以下工藝步驟：（1）離子交換層析;（2）鹽析；（3）超濾；（4）熱原處理；（5）透析；（6）疏水色譜；（7）凍干，制備激肽釋放酶。本發(fā)明對激肽釋放酶的生產(chǎn)工藝進(jìn)行不斷改進(jìn)，特別是對各工藝參數(shù)進(jìn)行反復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，不斷優(yōu)化，最終確立了一套更為科學(xué)的規(guī)?；a(chǎn)工藝，經(jīng)疏水色譜純化所得的激肽釋放酶的效價(jià)高達(dá)1500～1800iu/mg,并且各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國藥典規(guī)定。
【專利說明】一種疏水色譜純化激肽釋放酶的方法及含有激肽釋放酶的藥物組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及一種應(yīng)用疏水色譜純化激肽釋放酶的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]激肽釋放酶屬于絲氨酸蛋白酶，它包括血漿型激肽釋放酶和組織型激肽釋放酶兩種類型，分子量分別為25200道爾頓和33800道爾頓，均能使激肽原釋放出一種多肽——激肽，而激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)(kallikrein kinin system, KKS)是體內(nèi)主要的降壓系統(tǒng)之一，作為一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)源性多酶系統(tǒng)，參與調(diào)控心血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等的生理功能，與心臟病、腎病、炎癥反應(yīng)、癌癥等疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系。
[0003]近年來在心血管系統(tǒng)方面的研究進(jìn)展很快，許多臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)糖尿病、高血壓、心力衰竭、心肌梗死及左心室肥厚等疾病的發(fā)生與KKS的活性降低有關(guān)。因而深入研究KKS的作用為研究心血管相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療手段提供了又一新的途徑。
[0004]本發(fā)明人自2008年開始對胰酶的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研究，特別是在糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的生產(chǎn)過程中，不斷探索，力求優(yōu)化完善工藝參數(shù)，并且在原有工藝的基礎(chǔ)上另辟蹊徑，成功完成提取激肽釋放酶原的工藝研究，其收率為0.2%?0.4%，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種疏水色譜純化激肽釋放酶的方法及含有激肽釋放酶的藥物組合物，通過疏水色譜等生物分離工程技術(shù)純化激肽釋放酶，較好的保持蛋白活性。
[0006]一種疏水色譜純化激肽釋放酶的方法及含有激肽釋放酶的藥物組合物，其特征在于:采用疏水色譜等現(xiàn)代生物分離技術(shù)，將激肽釋放酶效價(jià)提高到1500?1800iu/mg，更好的保持了蛋白的活性。在發(fā)明技術(shù)方案中，其特征還在于所述提取工藝包括如下步驟:
1)離子交換層析
1.1)將激肽釋放酶原用0.001-0.01mol/L,PH3-6的醋酸緩沖液溶解離心，上清液加入離子交換樹脂，攪拌、吸附，收集樹脂，漂洗直至無泡沫；
1.2)再用 0.01-0.3mol/L, PH3-8 的 0.l_5mol/L，PH5-10 的 NaCL 溶液攪拌洗脫樹脂，分離樹脂得洗脫液；
2)鹽析
調(diào)節(jié)洗脫液PH值至3.0?5.0，加入固體硫酸銨，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅；
3)超濾
加入濾餅重量15倍量的(w/v)磷酸鹽緩沖液，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7.0?9.0，待液體超濾，體積控制在3/10 ；
4)熱原處理 4.1)取超濾液，按50:5:3的比例，先后加入磷酸鈉溶液和醋酸鈣溶液；
4.2)調(diào)節(jié)pH值至8.0?10.0，攪拌，離心，棄去沉淀物，取濾液，準(zhǔn)備透析扎包；
5)透析工序
取濾液，透析液扎包，放入純化水中，進(jìn)行透析交換，透析4?6天；
6)疏水色譜
6.1)用適量的含 0.5-3mol/L (NH4)2SO4^ 0.01-0.3mol/L, PH3-8 的 NaAc-HAc 緩沖液來平衡疏水色譜快膠柱；
6.2)將透析液流經(jīng)此柱,流速控制在l~5mL/min左右；
6.3)平衡后，用0.5-3!1101/1的(NH4)2SCV^液洗脫至蛋白檢測儀顯示至基線；
6.4)再用不含(NH4)2SO4平衡緩沖液洗脫，收集含激肽釋放酶活性峰的洗脫液，-20°C保存；
7 )凍干
調(diào)節(jié)PH值至5.5?6.5，裝盤、凍干，得激肽釋放酶。
[0007]經(jīng)檢測,所得激肽釋放酶效價(jià)約為1500?1800iu/mg。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
選用疏水色譜等現(xiàn)代生物分離技術(shù)純化激肽釋放酶，可以使其理化性質(zhì)和生物活性在后續(xù)生產(chǎn)過程中保持穩(wěn)定，最終使激肽釋放酶的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過工藝的不斷改進(jìn)和完善，使得激肽釋放酶效價(jià)提高到1500?1800iu/mg,節(jié)約成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。

【具體實(shí)施方式】
[0009]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而不以任何方式限制。
[0010]實(shí)施例1
1)離子交換層析
1.1)將激肽釋放酶原20kg用0.005mol/L, PH4的醋酸緩沖液100L溶解離心，上清液加入離子交換樹脂，攪拌吸附2h，收集樹脂，漂洗直至無泡沫；
1.2)再用0.03mol/L, PH5的NaCL溶液150L攪拌洗脫樹脂lh，分離樹脂得洗脫液138L ；
2)鹽析
調(diào)節(jié)洗脫液PH值至3.0?5.0,加入固體硫酸銨，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅
13.5kg ；
4)超濾
將所得濾餅投入反應(yīng)罐中，加入磷酸鹽緩沖液163L，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH值至8.5，待液體超濾，體積控制在3/10，得超濾液165L;
5)熱原處理
5.1)取上述超濾液，按50:5:3的比例，先加入0.4mol/L磷酸鈉溶液16.5L，在不斷攪拌下緩緩加入lmol/L醋酸鈣溶液9.90L;
5.2)用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0,穩(wěn)定后繼續(xù)攪拌1.5小時(shí)，結(jié)束后，離心20分鐘，棄去沉淀物，得濾液162L; 6)透析工序
取上述濾液，透析液扎包(10mL/包)，將透析袋放入4°C純化水中，進(jìn)行透析交換5天，每24小時(shí)換一次純化水；
7)疏水色譜
7.1)用 44L 的含 1.5mol/L (NH4)2SO4的 0.2mol/L，PH3_8 的 NaAc-HAc 緩沖液來平衡疏水色譜快膠柱；
7.2)將透析液流經(jīng)此柱,流速控制在3mL/min左右；
7.3)平衡后，用1.5mol/L的(NH4)2SO4溶液洗脫至蛋白檢測儀顯示至基線；
7.4)再用不含(NH4)2SOJ衡緩沖液洗脫，收集含激肽釋放酶活性峰的洗脫液，-20°C保存；
8)凍干
用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，裝盤、凍干，得激肽釋放酶6.5kg。
[0011]經(jīng)檢測，所得激肽釋放酶效價(jià)約為1725iu/mg。
[0012]實(shí)施例2
1)離子交換層析
1.1)將激肽釋放酶原1.8kg用0.005mol/L, PH4的醋酸緩沖液90L溶解離心，上清液加入離子交換樹脂，攪拌吸附2h，收集樹脂，漂洗直至無泡沫；
1.2)再用0.03mol/L, PH5的NaCL溶液140L攪拌洗脫樹脂lh，分離樹脂得洗脫液126L ；
2)鹽析
調(diào)節(jié)洗脫液PH值至3.0?5.0,加入固體硫酸銨，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅
12.9kg ；
4)超濾
將所得濾餅投入反應(yīng)罐中，加入磷酸鹽緩沖液156L，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH值至8.5，待液體超濾，體積控制在3/10，得超濾液158L;
5)熱原處理
5.1)取上述超濾液，按50:5:3的比例，先加入0.4mol/L磷酸鈉溶液15.8L，在不斷攪拌下緩緩加入lmol/L醋酸鈣溶液9.48 L;
5.2)用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0,穩(wěn)定后繼續(xù)攪拌1.5小時(shí)，結(jié)束后，離心20分鐘，棄去沉淀物，得濾液155L;
6)透析工序
取上述濾液，透析液扎包(10mL/包)，將透析袋放入4°C純化水中，進(jìn)行透析交換5天，每24小時(shí)換一次純化水；
7)疏水色譜
7.1)用 42L 的含 2mol/L (NH4)2SO4的 0.15mol/L, PH3-8 的 NaAc-HAc 緩沖液平衡疏水色譜快膠柱；
7.2)將透析液流經(jīng)此柱，流速控制在2mL/min左右；
7.3)平衡后，用lmol/L的(NH4)2SO4溶液洗脫至蛋白檢測儀顯示至基線；
7.4)再用不含(NH4)2SOJ衡緩沖液洗脫，收集含激肽釋放酶活性峰的洗脫液，-20°C保存；
8)凍干
用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5，裝盤、凍干，得激肽釋放酶6.2kg。
[0013]經(jīng)檢測，所得激肽釋放酶效價(jià)約為1688iu/mg。
[0014]實(shí)施例3
將實(shí)施例2制備的胰激肽原酶120000單位、預(yù)膠化淀粉217g、微晶纖維素65g置混合機(jī)內(nèi)，攪拌15分鐘，再加入羥丙基甲基纖維素7.Hg、硬脂酸鎂0.34 g，緩緩均勻地加入混合機(jī)內(nèi)攪拌，至顆粒形成，放入制粒機(jī)中制粒，中間體檢驗(yàn)，合格后用高速旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)制成10000片，片芯檢驗(yàn)合格后按每公斤素片加入腸溶型薄膜包衣預(yù)混劑(蘭色)0.15kg完成包腸溶衣工序。
[0015]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種疏水色譜純化激肽釋放酶的方法及含有激肽釋放酶的藥物組合物，該方法通過疏水色譜等現(xiàn)代生物分離技術(shù)，提高了純化激肽釋放酶的效率，保持激肽釋放酶的效價(jià)穩(wěn)定。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:以激肽釋放酶原為原料，依次經(jīng)過離子交換層析、鹽析、超濾、熱原處理、透析、疏水色譜、凍干等工序純化得到激肽釋放酶。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述純化工藝包括如下步驟: 1)將激肽釋放酶原用醋酸緩沖液溶解，離心，上清液加入離子交換樹脂，攪拌、吸附、漂洗、洗脫； 2)調(diào)節(jié)pH值后加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析，靜置過夜，過濾，收集濾餅； 3)加入磷酸鹽緩沖液攪拌調(diào)節(jié)pH值，超濾； 4)超濾液加入磷酸鈉溶液和醋酸鈣溶液后，調(diào)節(jié)pH攪拌，離心，棄沉淀物； 5)取上述濾液置于于透析袋中，透析4?6天； 6)疏水色譜，用2種洗脫液進(jìn)行洗脫，最終收集含激肽釋放酶活性峰的洗脫液，-200C保存； 7)調(diào)節(jié)pH值，裝盤、凍干，得激肽釋放酶。
4.如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于離子交換樹脂選AmheriteCG-50，并且m(樹脂):m (粗制品)=50:lo
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于離子交換層析選用洗脫液為0.01-0.3mol/L,PH3-8 的 NaCL 溶液。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于鹽析工序中每升提取液中加入500g硫酸銨。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述疏水色譜快膠柱包括:Butyl-Sepharose 2B FFjButyl-Sepharose 4B FFjButyl-Sepharose 6B FF,Butyl-Sepharose CL-2B FFj Butyl-Sepharose CL-4B FFj Butyl-Sepharose CL-6B FF。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述疏水色譜條件為:平衡液選用含0.5-3mol/L (NH4)2SO4的 0.01-0.3mol/L, PH3-8 的 NaAc-HAc 緩沖液，流速控制在 l~5mL/min左右，洗脫液選用0.5-3mol/L的(NH4) 2S04溶液和不含(NH 4) 2S04平衡緩沖液。
9.如權(quán)利要求1?7所述的方法，其特征在于:疏水色譜純化所得激肽釋放酶效價(jià)高達(dá) 1500 ?1800iu/mg。
10.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-9制備的激肽釋放酶原作為活性成分，還含有預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素、硬脂酸鎂及腸溶型薄膜包衣預(yù)混劑(蘭色)。
【文檔編號】C12N9/64GK104498461SQ201410807834
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】劉冠男, 林曉磊, 孫延年 申請人:青島康原藥業(yè)有限公司