一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及檢測方法與檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及檢測方法與檢測試劑盒，其中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，檢測方法為首先提取待測樣品的基因組DNA；然后以該基因組DNA為模板，與特異性引物Lm16、PCR緩沖液、MgCl2溶液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反應(yīng)體系，進行PCR反應(yīng)；最后檢測PCR產(chǎn)物是否為大小為1623bp的單一擴增產(chǎn)物。試劑盒包括特異性引物、PCR緩沖液、MgCl2溶液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶。本發(fā)明提供的試劑盒能夠有效地檢測出食品中的單核細胞增生李斯特菌氏菌，且細菌的檢測靈敏度高，特異性好，抗干擾能力強。
【專利說明】-種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及檢 測方法與檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是食源性致病菌檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種用于檢測單核細胞增生李斯 特氏菌（Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌）的核苷酸序列及檢測方法與檢測 試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes, LM)是一種人畜共患病的 病原菌，屬于李斯特菌屬（Listeria spp.)，在自然界中的廣泛存在，當牲畜感染后，通過食 物鏈最后導(dǎo)致人類的感染。據(jù)WHO報道，健康人的糞便中單增李斯特菌攜帶率為0.6%? 16%，有70%的人可短期帶菌。人類受感染后可導(dǎo)致胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等疾 病，其中孕婦、嬰兒、老年人及免疫力低下者為易感人群，人類感染單增李斯特菌后有高達 20 %?30 %的致死率。因此，2002年WHO將單增李斯特菌列為僅次于大腸桿菌0157、沙門氏 菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。單增李斯特在4°C的環(huán)境中仍可生長繁殖， 是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。國際國內(nèi)食品標準規(guī)定食品中致病菌不得檢 出，為有效控制原菌的發(fā)生和擴散，有效控制和預(yù)防食品中單增李斯特菌污染至關(guān)重要。
[0003] 目前，單增李斯特菌的檢測方法以傳統(tǒng)的鑒別培養(yǎng)為基礎(chǔ)，通過分離培養(yǎng)、生化反 應(yīng)、溶血試驗、動物試驗等進行分離鑒定。實驗設(shè)備要求不高，可操作性強，但檢驗周期長， 需6-7d。一些快速單增李斯特菌檢測方法除了 ELISA法應(yīng)用于實際檢測外，分子生物學(xué)方 法大多數(shù)處于科學(xué)研究階段，尚未廣泛應(yīng)用。因此單增李斯特菌急需特異性和敏感度高的 快速診斷方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于為了克服以上現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種用于檢測單核細胞 增生李斯特氏菌的核苷酸序列及檢測方法與檢測試劑盒；檢測試劑盒具有特異性好、靈敏 度高、檢測時間短的單核細胞增生李斯特氏菌的特點，提高其檢測效率和精確度。
[0005] 技術(shù)方案
[0006] -種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列，包括1623bp，序列為SEQ ID NO. 1 所示。
[0007] -種檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)提取待測樣品的基因組DNA ;
[0009] (2)以步驟⑴所提取的基因組DNA為模板，與特異性引物Lml6、PCR緩沖液、MgCl2溶液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反應(yīng)體系，進行PCR反應(yīng)；
[0010] 其中特異性引物 Lml6 為 Lml6F :5' -CTGITCGTCGGTCCGTGGTA-3'，
[0011] Lml6R :5' -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3' ；
[0012] (3)檢測PCR產(chǎn)物是否為權(quán)利要求1所述的大小為1623bp的單一擴增產(chǎn)物。
[0013] 以上檢測方法的步驟（1)中，提取基因組DNA的方法為分子生物學(xué)領(lǐng)域常用方法， 各種市售細菌基因組DNA提取試劑盒均可實現(xiàn)相同提取目的。
[0014] 在本發(fā)明種擴增產(chǎn)物的判定原則為PCR反應(yīng)之后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，若 步驟（2)所得PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物在1623bp位置有對應(yīng)產(chǎn)物，則判定結(jié)果為陽性，若所得PCR 產(chǎn)物無擴增條帶或在1623bp位置無對應(yīng)產(chǎn)物，則判定結(jié)果為陰性。
[0015] 進一步地，以上所述的檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，步驟（2)中PCR 反應(yīng)體系包括 10XPCR buffer，5.0 ?10. OmM MgCl2,1.0 ?2. OmM dNTP，10 ?20 ii M 引物 Lml6F，10 ?20iiM 引物 Lml6R，1 ?10ng/ii L 基因組 DNA，0. 5 ?IU Taq DNA 聚合酶，雙蒸 水補齊至 25 ii L ;PCR 反應(yīng)過程為：① 94°C，3min ;② 94°C，30s ;③ 60°C，30s ;④ 72°C，75s ; 步驟②至④循環(huán)35次；⑤72°C，IOmin ;⑥4°C保存。
[0016] 進一步地，以上所述的檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，步驟（3)中PCR 反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0017] 一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，包括特異性引物Lml6、PCR 緩沖液、MgCl2溶液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶，所述特異性引物Lml6序列 如下：
[0018] 上游引物 Lml6F :5' -CTGITCGTCGGTCCGTGGTA-3'
[0019] 下游引物 Lml6R :5' -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3'。
[0020] 進一步地，所述的用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，所述試劑盒 還包括含有以上所述的核苷酸序列的單增李斯特氏菌標準菌株的DNA標準品。
[0021] 進一步地，所述的用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，PCR緩沖液為 10XPCR buffer，MgCl2溶液濃度為5. 0?10. OmM，脫氧三磷酸核苷混合物濃度為I. 0? 2. OmM，引物Lml6F濃度為10?20 ii M，引物Lml6R濃度為10?20 ii M，TaqDNA聚合酶活為 0? 5 ?1U。
[0022] 本發(fā)明適用于食品樣品，尤其是液態(tài)乳制品、新鮮禽肉、水產(chǎn)品及冷凍食品。
[0023] 有益效果
[0024] 本發(fā)明提供的單核細胞增生李斯特氏菌檢測試劑盒及檢測方法，具有特異性好、 靈敏度高、抗干擾性強、檢測效率高、結(jié)果判定簡單的優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為實施例1中引物對Lml6以李斯特菌屬內(nèi)六個種為模板進行PCR反應(yīng) 的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖中，M:DS 2000DNA marker。CK:空白對照（CldH2O)。 泳道 1 - 16 依次為：單增李斯特菌（CICC21662, CICC21632, CICC21633, CICC21634， CICC21635, CICC21637, CICC21638, CICC21639, CICC21533 及 CICC21583)，英諾克李斯特菌 (CICC10417, CICC10416)，伊氏李斯特菌（CICC21663)，格氏李斯特菌（CICC21670)，斯氏李 斯特菌（CICC21671)，威氏李斯特菌（CICC21672)。
[0026] 圖2為實施例1中測定基因組檢測靈敏度和細胞培養(yǎng)物檢測靈敏度的PCR產(chǎn)物 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖中，M :DNA ladder I marker。CK:空白對照（CldH2O)。圖（A) 對應(yīng)于基因組檢測靈敏度，泳道1-10分別對應(yīng)不同基因組DNA濃度：11. 9ng/ii L，I. 19ng/ U L, 119. Opg/u L,11. 9pg/u L,I. 19pg/u L,119. Ofg/u L,11. 9fg/u L,I.19fg/u L, 119. 0ag/iiL，11.9ag/iiL。圖（B)對應(yīng)于細胞的檢測靈敏度，泳道1-10分別對應(yīng)細胞濃 度 I. 89X 109cfu/mL，I. 89X 108cfu/mL，I. 89X 107cfu/mL，I. 89X 106cfu/mL，I. 89X IO5Cfu/ mL, I. 89 X 104cfu/mL, I. 89 X 103cfu/mL, 189cfu/mL, 18. 9cfu/mL, I. 89cfu/mL。
[0027] 圖3為實施例I中測定抗干擾能力的PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié) 果。M:DS? 2000 DNA marker。N:陰性對照（CldH2O)。圖中：泳道1-5對應(yīng)單增李斯特菌 CICC21635和大腸桿菌0157 CICC21530的混合物，單增李斯特菌CICC21635和腸炎沙門氏 菌CMCC50041的混合物，單增李斯特菌CICC21635和金黃色葡萄球菌ATCC27217的混合物， 單增李斯特菌CICC21635和英諾克李斯特菌CICC10417的混合物，單增李斯特菌和其它四 種菌的混合物。

【具體實施方式】
[0028] 下面通過實施例和附圖的方式來說明和解釋本發(fā)明，但本發(fā)明并不只是限制在所 述的實施例范圍。本實例中，所有引物均交付上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，所 使用的DNA標準分子量DS? 2000DNA marker及DNA ladder I購置廣州東盛生物科技有限 公司。
[0029] 實施例1 :對單核細胞增生李斯特菌標準菌株CICC21635的檢測
[0030] (1)采用本發(fā)明的一對引物Lml6對單核細胞增生李斯特菌標準菌株CICC21635進 行PCR檢測。
[0031] 所用引物對Lml6的序列如下：
[0032] Lml6F :5' -CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3'（SEQ ID NO. 2);
[0033] Lml6R :5, -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3,（SEQ ID NO. 3)。
[0034] 所對應(yīng)的PCR擴增產(chǎn)物大小為1623bp。
[0035] 本發(fā)明所使用的PCR反應(yīng)體系如下：
[0036] 所述優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系包括 10XPCR buffer，5. 0 ?10. OmM MgCl2,1. 0 ?2. OmM dNTP，10 ?20iiM 引物 Lml6F，10 ?20iiM 引物 Lml6R，1 ?10ng/ii L 基因組 DNA，0. 5 ?IU TaqDNA聚合酶，雙蒸水補齊至25 ii L ;所述最適的PCR反應(yīng)程序為：①94°C，3min ;②94°C， 30s ;③60°C，30s ;④72°C，75s ;步驟②至④循環(huán)35次；⑤72°C，10min ;⑥4°C保存。
[0037] 在最適的反應(yīng)條件下，均能夠獲得單一的，清晰的1623bp大小條帶。
[0038] 因此本發(fā)明所建立的PCR檢測方法如下：
[0039] 在 PCR 反應(yīng)管中依次加入 10XPCR buffer 2. 5 ii L，20mM MgCl2L 5 ii L，2. OmM dNTP liiL，10iiM3_Lml6F I y L，10 y M 弓丨物 Lml6R I y L，IOng/y L 基因組 DNA I u L, IU/ii L Taq DNA聚合酶Iii L，其余以雙蒸水補齊，總體積為25 iiL，并設(shè)置空白對照。將 PCR反應(yīng)管放入離心機離心混勻反應(yīng)體系后，放入PCR儀，按照如下條件進行反應(yīng)：①94°C， 3min ;② 94°C，30s ;③ 60°C，30s ;④ 72°C，75s ;步驟②至④共 35 個循環(huán)；⑤ 72°C，10min ; ⑥4°C保存。PCR擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖1即為Lml6的PCR檢測結(jié)果， 其條帶大小為1623bp，清晰可見，經(jīng)測定，該1623bp大小的條帶的序列為SEQ ID NO. 1所 /Jn 〇
[0040] ⑵特異性評價試驗
[0041] 將10株單核細胞增生李斯特菌標準菌株和5株單核細胞增生李斯特菌食品分離 株，以及同屬于李斯特菌屬的其他5個種標準菌株，接種于BHI培養(yǎng)基中，于37°C，180rpm 過夜培養(yǎng)；取ImL菌液于I. 5mL離心管中，按照常規(guī)的基因組提取方法提取并純化基因組 DNA ;基因組DNA放置于-20°C備用。5株單核細胞增生李斯特菌食品分離菌株通過生理生 化鑒定到種。表1中所示的李斯特菌屬外的其他細菌的基因組DNA提取和純化類似。本發(fā) 明所涉及的菌株均可以通過公開途徑獲得。
[0042] 將提取的基因組DNA稀釋至IOng/ ii L后各取I ii L作為模板進行PCR反應(yīng)。反應(yīng) 完畢之后，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，根據(jù)是否在1623bp處有單一條帶來判斷 結(jié)果為陰性還是陽性。詳細的PCR結(jié)果見表1。
[0043] 表1中共涉及41株菌株，李斯特菌屬標準菌株共計16株，其中，單核細胞增生李 斯特菌10株，英諾克李斯特菌2株，伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、斯氏李斯特菌和威氏李 斯特菌各1株。單核細胞增生李斯特菌食品分離菌株5株。李斯特菌屬外共20株菌株，其 中，沙門氏菌屬6株，克諾羅桿菌屬6株，大腸桿菌1株，耶爾森氏菌1株，志賀氏菌1株，金 黃色葡萄球菌1株，蠟樣芽胞桿菌1株，奇異變形桿菌1株，熒光假單胞菌1株，副溶血弧菌 1株。表1為特異性評價試驗的PCR結(jié)果，結(jié)果表明除單核細胞增生李斯特菌標準菌株外， 其余PCR結(jié)果均為陰性，這表明本發(fā)明中的檢測方法具有較高的特異性。
[0044] 表1引物特異性評價實驗采用的菌株及其PCR結(jié)果
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列，其特征在于，包括1623bp， 序列為SEQ ID NO. 1所示。
2. -種檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取待測樣品的基因組DNA ; (2) 以步驟（1)所提取的基因組DNA為模板，與特異性引物Lml6、PCR緩沖液、1%(：12溶 液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反應(yīng)體系，進行PCR反應(yīng)；其中 特異性引物 Lml6 為 Lml6F :5' -CTGITCGTCGGTCCGTGGTA-3'， Lml6R:5' -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3' ； (3) 檢測PCR產(chǎn)物是否為權(quán)利要求1所述的大小為1623bp的單一擴增產(chǎn)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，步 驟（2)中 PCR反應(yīng)體系包括 10XPCR buffer，5.0~10.0mM MgCl2，1.0~2.0mM dNTP，10~20iiM 引物1^16卩，10~2011]?引物1^161?，1~10叩/111基因組0嫩，0.5~川139 0嫩聚合酶，雙蒸 水補齊至 25 ii L ;PCR 反應(yīng)過程為：① 94°C，3min ;② 94°C，30s ;③ 60°C，30s ;④ 72°C，75s ; 步驟②至④循環(huán)35次；⑤72°C，lOmin ;⑥4°C保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，步 驟（3)中PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。
5. -種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，其特征在于，包括特異性引 物Lml6、PCR緩沖液、MgCl2溶液、脫氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶，所述特異性引 物Lml6序列如下： 上游引物 Lml6F :5' -CTGITCGTCGGTCCGTGGTA-3' 下游引物 Lml6R :5' -CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，其特征 在于，所述試劑盒還包括含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列的單增李斯特氏菌標準菌株的 DNA標準品。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的檢測試劑盒，其特征在 于，PCR緩沖液為10XPCR buffer，MgCl2溶液濃度為5. 0~10. OmM，脫氧三磷酸核苷混合物 濃度為1. 〇~2. OmM，引物Lml6F濃度為10~20iiM，引物Lml6R濃度為10~20iiM，TaqDNA聚合 酶活為〇. 5~1U。
【文檔編號】C12R1/01GK104450940SQ201410833123
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】陸兆新, 陶婷婷, 別小妹, 呂鳳霞, 張充, 趙海珍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)