一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法包括以下步驟：(1) 取材，新鮮人乳腺組織標(biāo)本；（2）經(jīng)機(jī)械剪切、膠原酶和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化，制備乳腺組織細(xì)胞懸液；(3) 通過低速及差速離心使不同細(xì)胞組分分層、分離；（4）經(jīng)多次離心、洗滌及貼壁培養(yǎng)進(jìn)行純化，得到乳腺組織的的不同細(xì)胞組分，分別為上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞。本發(fā)明可快速、簡(jiǎn)便和有效地從同一乳腺組織中分離純化不同細(xì)胞組分，所培養(yǎng)各乳腺細(xì)胞數(shù)量充足、細(xì)胞活力和純度達(dá)95％以上?？蔀槿橄偌叭橄侔┫嚓P(guān)分子生物學(xué)研究提供非常有用的材料以及為乳腺微環(huán)境多細(xì)胞培養(yǎng)模型的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組織細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，具體涉及一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是一種通常發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見的腫瘤之一，嚴(yán)重影響著婦女身心健康甚至危及生命。據(jù)WHO資料統(tǒng)計(jì)，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10%，全世界每年大約有120萬女性罹患乳腺癌，50萬人死于該病。
[0003]腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜的過程。在正常狀態(tài)下，上皮組織內(nèi)部的動(dòng)態(tài)平衡由上皮細(xì)胞與其微環(huán)境之間動(dòng)態(tài)的相互作用來維持。微環(huán)境是腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境，是一個(gè)復(fù)雜的綜合系統(tǒng)，由腫瘤細(xì)胞本身和在腫瘤細(xì)胞周圍區(qū)域中與之相互作用的非腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等組成，包括各種基質(zhì)細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及一些血管細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。一方面，這些細(xì)胞可以被腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)，促使其產(chǎn)生大量的細(xì)胞生長(zhǎng)因子、趨化因子以及一些蛋白酶等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲；另一方面，一些基質(zhì)細(xì)胞本身也可通過釋放各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子、激素等到微環(huán)境介質(zhì)中來影響腫瘤上皮細(xì)胞的行為。機(jī)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境中的其他細(xì)胞存在所謂的“交叉對(duì)話”，錯(cuò)綜復(fù)雜，其結(jié)果可能促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及轉(zhuǎn)移。然而以往的研究中大部分的細(xì)胞模型都是采用孤立的單一的細(xì)胞種類，沒有考慮到與腫瘤細(xì)胞相連的其他細(xì)胞種類組成的微環(huán)境的影響。
[0004]女性乳腺是一個(gè)復(fù)雜的器官，成體乳腺組織包括許多種細(xì)胞類型，有乳腺上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等等。隨著對(duì)乳腺組織的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞組分與腫瘤上皮細(xì)胞的相互作用在腫瘤的生長(zhǎng)過程中具有重要作用。但以往對(duì)乳腺癌的研究采用的細(xì)胞模型大多只是針對(duì)乳腺癌上皮細(xì)胞，其他乳腺組織中其他細(xì)胞組分對(duì)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的影響研究較少，其原因之一是目前乳腺組織細(xì)胞的分離和培養(yǎng)多是針對(duì)單一細(xì)胞類型進(jìn)行，未見對(duì)同一乳腺組織中的其他細(xì)胞組分進(jìn)行分離和培養(yǎng)，大大限制了對(duì)乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境多層細(xì)胞模型的構(gòu)建和研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服上述缺陷，提供一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，該方法簡(jiǎn)便有效，特別是針對(duì)以手術(shù)切除獲得的人乳腺組織來進(jìn)行的人乳腺組織中不同細(xì)胞組分的分離培養(yǎng)方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，以新鮮乳腺組織為材料，經(jīng)機(jī)械剪切、膠原酶和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化、差速離心、洗滌、貼壁培養(yǎng)純化，分離培養(yǎng)人乳腺組織中的上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及前脂肪細(xì)胞，包括以下步驟:
(I)取乳腺組織小塊，剔除乳腺組織中的血塊、血管及纖維組織，浸泡于75%的酒精中消毒30s，然后用DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)液清洗三次，并將其剪碎，置于培養(yǎng)皿中，加入相當(dāng)于乳腺組織量5-10倍體積的消化培養(yǎng)液(DMEM/F12 (1:1)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中包含1.05mM CaCl2,5% BSA, 10ng/mL霍亂毒素，6000-6300 U/mL膠原蛋白酶和80-110 U/mL透明質(zhì)酸酶)，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中(5% CO2,95%空氣，37°C )，搖床80轉(zhuǎn)/min，過夜消化12_17h ;用不含血清的DMEM/F12溶液將消化液稀釋1-2倍，反復(fù)輕輕吹打分散組織，經(jīng)低速離心后吸出上層脂肪層，并去上清液，重復(fù)操作1-2次，將大部分脂肪去除后，加入DMEM/F12溶液分散即得乳腺組織細(xì)胞懸液；
(2)將所得乳腺組織細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管進(jìn)行第一次低速離心(500-800rpm,5-10min)，離心后可分為較明顯的上、中和下三層，用移液管小心將其分別轉(zhuǎn)移至不同的無菌試管中，分別用于進(jìn)一步分離純化前脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞；
(3)以上各試管中分別加入無酚紅無血清DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)液，內(nèi)含雙抗(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)和0.25 g/mL兩性霉素B)，用移液管上下吹吸，混勻，然后室溫下進(jìn)行第二次低速離心(1000-1200 rpm, 5_8min),棄去上清,底層沉淀為細(xì)胞團(tuán)，再加入和上面相同的培養(yǎng)液，混勻，同樣條件離心，如此分別反復(fù)操作3-5次，以去除雜質(zhì)和其他種類細(xì)胞；
(4)將步驟(3)反復(fù)洗滌沉淀獲得的細(xì)胞小球中分別加入三種類型細(xì)胞各自的生長(zhǎng)培養(yǎng)液，吸打均勻成細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞密度為lX105/cm2，接種培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中37°C恒溫培養(yǎng)，貼壁后，換液除去死亡及未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋80%板底表面積時(shí)，得到原代培養(yǎng)的3種乳腺細(xì)胞；
(5)細(xì)胞的純化:采用反復(fù)貼壁法，將步驟(4)得到的3種乳腺細(xì)胞分別經(jīng)過濾、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度至5X104 /ml，種植在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待細(xì)胞鋪至板底80%時(shí)，再依次重復(fù)1-2次，分別得到預(yù)純化的三種乳腺細(xì)胞；去除培養(yǎng)基，并用DMEM/F12液沖洗，隨后加入EDTA-胰酶混合消化液消化細(xì)胞，至倒置顯微鏡下觀察80-90%細(xì)胞回縮時(shí)終止，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)液，分別得到純化的3種乳腺細(xì)胞；
(6)乳腺細(xì)胞的傳代培養(yǎng):將步驟(5)純化后的各細(xì)胞組分分別離心(1000rpm, 5min)，并用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2-3遍，去掉上清，用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，以5X 14 /ml的密度植入培養(yǎng)瓶中置37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天更換培養(yǎng)液，一般可傳5?9代；
(7)三種乳腺細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)液分別為:
a.上皮細(xì)胞培養(yǎng)液:低鈣無酚紅DMEM/F12(1:1) (0.04 mM CaCl2)，含5ug/ml氫化可的松、5 μ g/mL胰島素、200ng/ml霍亂毒素(CTX)、20 ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)，雙抗(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)和0.25 g/mL兩性霉素B，加Chelex-100樹脂處理過的10%胎牛血清；
b.前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液:高鈣無酚紅DMEM/F12(1:1) (1.05 mM CaCl2),含雙抗(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)，加10 %胎牛血清；
c.基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液:高鈣無酚紅DMEM/F12(1:1) (1.05 mM CaCl2),含雙抗(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)和5 μ g/mL胰島素,加5 %胎牛血清。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是:
(I)本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法中，采用膠原酶和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化、低速及差速離心、多次洗滌、貼壁培養(yǎng)純化等相結(jié)合方法，并對(duì)各條件進(jìn)行了優(yōu)化，能從同一乳腺組織中分離培養(yǎng)不同的乳腺組織細(xì)胞成分；
(2)本發(fā)明建立的人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便易行，所獲細(xì)胞活力和純度達(dá)95%以上，可為相關(guān)研究提供較好的細(xì)胞模型。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1從人乳腺組織中分離原代細(xì)胞的流程；
圖2原代培養(yǎng)人乳腺上皮細(xì)胞(A)、基質(zhì)細(xì)胞(B)和前脂肪細(xì)胞(C)的形態(tài)(X100)；圖3原代培養(yǎng)人乳腺上皮細(xì)胞免疫熒光鑒定(1300X).A.乳腺上皮細(xì)胞核(DAPI染色)，熒光顯微鏡下呈藍(lán)色；B.同一視野下的乳腺上皮細(xì)胞Cytokeratin在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，熒光顯微鏡下呈紅色；C.是A和B的疊加；
圖4原代培養(yǎng)人乳腺基質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定(430X).A.乳腺基質(zhì)細(xì)胞核(DAPI染色)，熒光顯微鏡下呈藍(lán)色；B.同一視野下的乳腺上皮細(xì)胞Vimentin在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，熒光顯微鏡下呈紅色；C.是A和B的疊加；
圖5人乳腺前脂肪細(xì)胞的鑒定(200 X).A.分化后形成的脂肪滴；B.脂肪細(xì)胞油紅-O染色。

【具體實(shí)施方式】
[0009]下面通過實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
[0010]乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離培養(yǎng)過程如下:
(I)取材:取自腫瘤醫(yī)院腫瘤切除手術(shù)(患者女性，48歲)的新鮮乳腺癌組織。
[0011](2)分離培養(yǎng)步驟:將乳腺癌組織置于無酚紅的DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)液中，4°C保藏并于當(dāng)天運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。在無菌室中用外科手術(shù)剪刀剔除乳腺組織中的血塊、血管及纖維組織，浸泡于75%的酒精中消毒30s，然后用DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)液清洗三次，并將其剪碎，置于培養(yǎng)皿中，加入相當(dāng)于乳腺組織量5-10倍體積的消化培養(yǎng)液(DMEM/F12 (1:1)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中包含1.05mM CaCl2, 5% BSA, 10ng/mL霍亂毒素，6000-6300 U/mL膠原蛋白酶和80-110 U/mL透明質(zhì)酸酶)，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中(5% CO2,95%空氣，37°C )，搖床80轉(zhuǎn)/min，過夜消化12-17h ;用不含血清的DMEM/F12溶液將消化液稀釋1_2倍，反復(fù)輕輕吹打分散組織，經(jīng)低速離心后吸出上層脂肪層，并去上清液，重復(fù)操作1-2次，將大部分脂肪去除后，加入DMEM/F12溶液分散即得乳腺組織細(xì)胞懸液；將所得乳腺組織細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管進(jìn)行第一次低速離心(800 rpm，5min)，離心后可分為較明顯的上、中和下三層，用移液管小心將其分別轉(zhuǎn)移至不同的無菌試管中，分別用于進(jìn)一步分離純化前脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞；以上各試管中分別加入無酚紅無血清DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)液，內(nèi)含雙抗(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)和0.25 g/mL兩性霉素B)，用移液管上下吹吸，混勻，然后室溫下進(jìn)行第二次低速離心(1000-1200 rpm, 5_8min)。棄去上清，底層沉淀為細(xì)胞團(tuán)，再加入和上面相同的培養(yǎng)液，混勻，同樣條件離心，如此分別反復(fù)操作4次，以去除雜質(zhì)和其他種類細(xì)胞；將以上反復(fù)洗滌沉淀獲得的細(xì)胞小球中分別加入三種類型細(xì)胞各自的生長(zhǎng)培養(yǎng)液，吸打均勻成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為I X 105/cm2，接種培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中37°C恒溫培養(yǎng)，貼壁后，換液除去死亡及未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。分別培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋80%板底表面積時(shí)，得到原代培養(yǎng)的3種乳腺細(xì)胞；
(3)細(xì)胞的純化:采用反復(fù)貼壁法，將步驟(2)得到的3種乳腺細(xì)胞分別經(jīng)過濾、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度至5X104 /ml，種植在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待細(xì)胞鋪至板底80%時(shí)，再依次重復(fù)1-2次，分別得到預(yù)純化的三種乳腺細(xì)胞；去除培養(yǎng)基，并用DMEM/F12液沖洗，隨后加入EDTA-胰酶混合消化液消化細(xì)胞，至倒置顯微鏡下觀察80-90%細(xì)胞回縮時(shí)終止，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)液，分別得到純化的3種乳腺細(xì)胞；
(4)乳腺細(xì)胞的傳代培養(yǎng):將步驟(3)純化后的各細(xì)胞組分分別離心(1000rpm, 5min),并用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2-3遍，去掉上清，用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，以5X 14 /ml的密度植入培養(yǎng)瓶中置37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天更換培養(yǎng)液，一般可傳5?9代；
(5)三種乳腺細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)液分別為:
a.上皮細(xì)胞培養(yǎng)液:低鈣無酚紅DMEM/F12(1:1) (0.04 mM CaCl2)，含5ug/ml氫化可的松、5 μ g/mL胰島素、200ng/ml霍亂毒素(CTX)、20 ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)，雙抗(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)和0.25 g/mL兩性霉素B，加Chelex-1OO樹脂處理過的10%胎牛血清；
b.前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液:高鈣無酚紅DMEM/F12(1:1) (1.05 mM CaCl2),含雙抗(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)，加10 %胎牛血清；
c.基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液:高鈣無酚紅DMEM/F12(1:1) (1.05 mM CaCl2),含雙抗(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)和5 μ g/mL胰島素,加5 %胎牛血清；
(6)形態(tài)觀察及鑒定
每天用倒置顯微鏡直接觀察貼壁的活細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并拍照。
[0012]采用細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin)及波形蛋白(Vimentin)抗體分別對(duì)原代培養(yǎng)人乳腺上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。操作按照說明書進(jìn)行。一抗波形蛋白抗體的工作濃度為1:100，細(xì)胞角蛋白抗體的工作濃度為1:200。 二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，工作濃度為1:200，隨后用DAPI染色液進(jìn)行顯色。觀察鑒定分離培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)判斷其純化程度。人乳腺前脂肪細(xì)胞采用成脂誘導(dǎo)分化進(jìn)行鑒定，油紅-O染色，在倒置顯微鏡下觀察出現(xiàn)明顯脂肪滴的細(xì)胞為分化陽性細(xì)胞，通過成脂情況判斷細(xì)胞純度。
【權(quán)利要求】
1.一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:以新鮮乳腺組織為材料，經(jīng)機(jī)械剪切、膠原酶和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化、差速離心、洗滌、貼壁培養(yǎng)純化，分離培養(yǎng)人乳腺組織中的上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及前脂肪細(xì)胞；具體步驟如下: (1)乳腺組織細(xì)胞懸液制備:取乳腺組織小塊，剔除乳腺組織中的血塊、血管及纖維組織，浸泡于75%的酒精中消毒30s，然后用培養(yǎng)液清洗三次，并將其剪碎，置于培養(yǎng)皿中，力口入相當(dāng)于乳腺組織量5-10倍體積的消化培養(yǎng)液，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，搖床80轉(zhuǎn)/min，過夜消化12_17h ;用不含血清的DMEM/F12:1:1溶液將消化液稀釋1-2倍，反復(fù)輕輕吹打分散組織，經(jīng)低速離心后吸出上層脂肪層，并去上清液，重復(fù)操作1-2次，將大部分脂肪去除后，加入DMEM/F12:1:1溶液分散即得乳腺組織細(xì)胞懸液； (2)將所得乳腺組織細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管進(jìn)行第一次低速離心，離心后細(xì)胞懸液可分為較明顯的上、中、下三層，用移液管小心將這三層液體分別轉(zhuǎn)移至三個(gè)不同的無菌試管中，用于進(jìn)一步分離純化前脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞； (3)以上各試管中分別加入無酚紅無血清DMEM/F12:1:1培養(yǎng)液，用移液管上下吹吸，混勻，然后室溫下進(jìn)行第二次低速離心，棄去上清，底層沉淀為細(xì)胞團(tuán)，再加入和上面相同的培養(yǎng)液，混勻，同樣條件離心，如此分別反復(fù)操作3-5次，以去除雜質(zhì)和其他種類細(xì)胞； (4)將步驟(3)反復(fù)洗滌沉淀獲得的細(xì)胞團(tuán)中分別加入三種類型細(xì)胞各自的生長(zhǎng)培養(yǎng)液，吸打均勻成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為I X 105/cm2,分別接種培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中37°C恒溫培養(yǎng)，貼壁后，換液除去死亡及未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋80%板底表面積時(shí)，得到原代培養(yǎng)的3種乳腺細(xì)胞； (5)細(xì)胞的純化:采用反復(fù)貼壁法，將步驟(4)得到的3種乳腺細(xì)胞分別經(jīng)過濾、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度至5X 14/ml，種植在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待細(xì)胞鋪至板底80%時(shí)，再依次重復(fù)1-2次，分別得到預(yù)純化的三種乳腺細(xì)胞；去除培養(yǎng)基，并用DMEM/F12液沖洗，隨后加入EDTA-胰酶混合消化液消化細(xì)胞，至倒置顯微鏡下觀察80-90%細(xì)胞回縮時(shí)終止，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)液，分別得到純化的3種乳腺細(xì)胞； (6)乳腺細(xì)胞的傳代培養(yǎng):將步驟(5)純化后的各細(xì)胞組分分別離心，并用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2-3遍，去掉上清，用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，以5X 14 /ml的密度植入培養(yǎng)瓶中置370C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天更換培養(yǎng)液，一般可傳5?9代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(I)所述的消化培養(yǎng)液為:DMEM/F12:1:1作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)液中還包含1.05mM CaCl2, 5% BSA, 10ng/mL 霍亂毒素，6000-6300 U/mL 膠原蛋白酶和 80-110 U/mL透明質(zhì)酸酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(I)所述的恒溫恒濕培養(yǎng)箱的溫度為條件37°C，培養(yǎng)箱的氣體為5% 0)2和95%空氣。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)所述的低速離心為500-800 rpm離心5_10min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(3)所述的DMEM/F12培養(yǎng)液，內(nèi)含雙抗:100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素和0.25g/mL兩性霉素B。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(3)所述的第二次低速離心為1000-1200 rpm離心5_8min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(6)所述的離心為1000 rpm離心5 min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(4)所述的三種乳腺細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)液分別為: a.上皮細(xì)胞培養(yǎng)液:低鈣無酚紅DMEM: F12 (1:1),0.04 mM CaCl2、含5ug/ml氫化可的松、5 μ g/mL胰島素、200ng/ml霍亂毒素CTX、20 ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF、雙抗:100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素、0.25 g/mL兩性霉素B，加Chelex-1OO樹脂處理過的10%胎牛血清； b.前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液:高鈣無酚紅DMEM: F12=l:l,1.05 mM CaCl2、含雙抗:100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素，加10 %胎牛血清； c.基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液:高鈣無酚紅DMEM: F12=l:l,1.05 mM CaCl2、含雙抗:100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素、5 μ g/mL胰島素，加5 %胎牛血清。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳腺組織不同細(xì)胞組分的分離與培養(yǎng)方法，其特征在于:所述新鮮乳腺組織包括正常乳腺組織和乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織，取自乳腺腫瘤切除術(shù)、乳房成形術(shù)、乳腺增生區(qū)段切除術(shù)臨床上手術(shù)切除的人體乳腺組織。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK104480062SQ201410833788
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】鐘賽意, 葉偉平, 徐萍萍, 諶素華, 秦小明, 王維民 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)