羥甲基化暨甲基化長序列標(biāo)簽測序技術(shù)的制作方法
【專利摘要】羥甲基化暨甲基化長序列標(biāo)簽測序技術(shù)。本發(fā)明提供了一種檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法，包括如下步驟：對基因組 DNA中的5-hmC進(jìn)行糖基化修飾以及對照組反應(yīng)；限制性內(nèi)切酶MspI酶切消化；接頭A的連接；Bst DNA polymerase fragment 處理；EcoP15I或MmeI酶切；片段選擇；P7接頭連接；PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物的回收；文庫質(zhì)控。本發(fā)明檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法具有如下優(yōu)勢：可以同時檢測全基因組內(nèi)幾乎全部CCGG位點的不同修飾即甲基化和羥甲基化的豐度；具有高通量、高準(zhǔn)確性并可降低實驗和測序誤差；不依賴于重亞硫酸鹽的轉(zhuǎn)換，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)甲基化檢測技術(shù)中無法分辨甲基化和羥甲基化修飾的缺點。
【專利說明】羥甲基化暨甲基化長序列標(biāo)簽測序技術(shù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種羥甲基化暨甲基化長序列標(biāo)簽測序 技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 5-羥甲基胞嘧啶（5hmC)是早在1952年發(fā)現(xiàn)的存在于噬菌體中胞嘧啶的一種修飾 形式，也是最近同時在小鼠的神經(jīng)元和胚胎干細(xì)胞中檢測到的存在于哺乳動物基因組中的 又一種修飾方式。隨后，大量的研宄集中于揭示5hmC和TET蛋白家族氧化酶在基因組組織 以及鼠干細(xì)胞分化中可能承擔(dān)的角色，并且證明TET蛋白酶家族可以通過氧化作用將5mC 轉(zhuǎn)換為5hmC。而Tet家族酶與疾病的發(fā)展與調(diào)控有關(guān)。已報道TET蛋白和5hmC存在于許 多不同的組織中，并且它們的表達(dá)/活性在胚胎干細(xì)胞分化過程中受到嚴(yán)格調(diào)控。TETl和 TET2均與癌癥有關(guān)：TET1在急性骨髓樣白血?。ˋML)和急性淋巴樣白血病（ALL)中是MLL 的的一個配體，而TET2功能的缺失也與急性骨髓樣白血病（AML)以及各種骨髓細(xì)胞生成障 礙綜合征和骨髓增生性疾病密切相關(guān)。TET蛋白和hmC引起DNA甲基化失調(diào)，在胚胎干細(xì)胞 多潛能性，致癌性轉(zhuǎn)化以及神經(jīng)元的功能中可能具有重要作用。
[0003] 然而，盡管5hmC修飾堿基早在50年前就在噬菌體中發(fā)現(xiàn)，然而目前幾乎沒有一種 有效的酶或化學(xué)的方法可以特異性識別5hmC殘基并分辨其在基因組中的具體分布。例如 甲基化依賴性內(nèi)切酶MspJI家族或McrBC均不能分辨5mC和5hmC，而甲基化敏感類內(nèi)切酶 如MspI或HpaII等，在大多情況下，5mC和5hmC對其有相同的影響。之前認(rèn)為是檢測甲基 化金標(biāo)準(zhǔn)的重亞硫酸鹽處理分析同樣不能有效地分辨是5mC修飾還是5hmC修飾。最近隨 著5hmC特異性抗體的出現(xiàn)，依賴于免疫學(xué)檢測5hmC的技術(shù)如斑點印跡分析技術(shù)、細(xì)胞免疫 熒光或免疫組化分析技術(shù)等已被廣泛應(yīng)用于羥甲基化相關(guān)的科學(xué)研宄之中，但這些技術(shù) 基本上都只限于檢測5hmC在組織或細(xì)胞內(nèi)的存在與否或表達(dá)量的高低，而不能定位其在 基因組上的分布。目前，在全基因組范圍內(nèi)檢測5hmC分布的技術(shù)主要集中在富集捕獲結(jié)合 測序分析的策略，如：hMeDIP、anti-CMS、JBP-pull down等，但所有這些富集捕獲的實驗方 法均不足以達(dá)到單堿基精確分辨5hmC在DNA序列內(nèi)精確分布的程度，而且依賴于抗體或 蛋白捕獲的該類技術(shù)大多受到非特異性捕獲以及捕獲偏好性的限制。最近基于生物氧化反 應(yīng)建立起來的TAB-Seq和基于化學(xué)氧化建立起來的oxBS-seq可以檢測全基因組的羥甲基 化修飾，而且可以進(jìn)行單堿基分辨，但是這兩種檢測方法所需要的數(shù)據(jù)量巨大且實驗技術(shù) 不宜在普通實驗室建立，其廣泛應(yīng)用受到限制。
[0004] 另一方面，用于檢測5hmC在全基因組或不同細(xì)胞或組織中含量的檢測方法卻不 斷發(fā)展，5hmC在不同細(xì)胞或組織中含量的檢測也不僅限于胚胎干細(xì)胞和腦組織中了。令 人興奮的是最新兩個研宄分別運用免疫組化和免疫測定的方法檢測到5hmC在胚胎和成體 組織均廣泛存在。免疫測定發(fā)現(xiàn)5hmC在腦、肝、腎和結(jié)腸直腸組織中的百分含量比較高為 0. 40-0. 65 %，而在肺組織中含量相對較低為0. 18 %，在心臟，乳房和胎盤中的含量極低，僅 為0. 05-0. 06%。相對正常結(jié)腸直腸組織0. 46-0. 57%的百分含量，該研宄同樣檢測發(fā)現(xiàn)在 癌變的結(jié)腸直腸組織中其含量僅為0. 02-0. 06%。這表明更亟待需要建立一種能夠精確檢 測5hmC在基因組范圍內(nèi)精確分布的大規(guī)模檢測技術(shù)，為進(jìn)一步研宄5-羥甲基胞嘧啶在基 因組內(nèi)的分布及其相關(guān)的表觀調(diào)控機(jī)制提供一種有力的工具，也為進(jìn)一步探索其對相關(guān)疾 病的發(fā)生發(fā)展或在個體發(fā)育過程中所承擔(dān)角色的實現(xiàn)提供前提條件。
[0005] 最近，NEB公司根據(jù)T4噬菌體β -葡糖基轉(zhuǎn)移酶（T4-BGT)可以高效的將尿嘧啶 二磷酸葡萄糖（UDP-Glucose)的葡萄糖單元轉(zhuǎn)移至雙鏈DNA的5-輕甲基胞喃啶殘基上，形 成的β-葡糖基-5-羥甲基胞嘧啶（5gmC)不能被MspI切開的原理建立了一種檢測基因組 CCGG位點甲基化和羥甲基化修飾的技術(shù)，具體如下：首先，全基因組經(jīng)過MspI酶切，在酶切 效率為100%的基礎(chǔ)上，基因組所有的CCGG位點均可被切開（包括甲基化修飾和羥甲基化 修飾位點）；第二步，酶切后的片段以dCTP為底物，經(jīng)過Klenow fragment的作用形成5' 突出一個堿基C的粘性末端；第三步，4%的丙稀酰胺凝膠回收40-300bp范圍的經(jīng)Klenow fragment修復(fù)的DNA片段；第四步，回收片段連接5'突出堿基G的雙鏈接頭（接頭可以介 導(dǎo)后續(xù)的PCR擴(kuò)增和測序）；第五步，連接接頭的回收片段經(jīng)BGT糖基化修飾，則基因組原 序列的CCGG位點如果含有羥甲基化修飾，則形成5gmC ;第六步，連接接頭后的糖基化修飾 產(chǎn)物再進(jìn)行MspI酶切，如果原CCGG位點是羥甲基化修飾，則連接的接頭不會被切下來；第 七步，取1/3的上述產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序，只有兩端都有接頭的序列即兩端都是羥甲基 化修飾的序列可以檢測到。剩余2/3的產(chǎn)物分兩份，每份各取1/3不直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而 分別在dCTP底物的作用下，經(jīng)過Klenow fragment再次進(jìn)行末端修復(fù)，形成一端或兩端突 出一個堿基C的粘性末端產(chǎn)物，然后在連接酶的作用下連接另外一種接頭，連接產(chǎn)物中的 一份直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序。另一份經(jīng)HpaII酶切后再次經(jīng)過末端修復(fù)和接頭連接，PCR 擴(kuò)增測序。這樣第一組檢測到的序列兩端的CCGG位點均羥甲基化修飾，第二組檢測到的序 列的一端為羥甲基化修飾，而另一端為甲基化修飾或不修飾，第三組檢測到的序列的一端 為羥甲基化修飾，而另一端為非修飾的CCGG位點。該技術(shù)需要經(jīng)過多次的連接和酶切反 應(yīng)，DNA的CCGG粘性末端連接和酶切效率相對較低，特別是經(jīng)過糖基化修飾后的連接和酶 切效率可直接影響檢測的準(zhǔn)確性。此外，該技術(shù)主要是應(yīng)用于基于PCR擴(kuò)增的單基因或位 點的檢測，目前應(yīng)用于高通量檢測的具體方法和數(shù)據(jù)還沒有報道。
[0006] 此外，研宄者運用T4噬菌體β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（T4-BGT)修飾建立了一種 HMST-seq的技術(shù)，該技術(shù)可以檢測基因組大部分CCGG位點甲基化和羥甲基化修飾狀態(tài)。借 助5hmC經(jīng)過糖基化修飾后不能被MspI限制性內(nèi)切酶切割，而5mC和5C均可被MspI切開的 原理，設(shè)計了一套含有生物素修飾的接頭和含MmeI酶切位點的接頭，全基因組依次經(jīng)過糖 基化修飾、MspI酶切、生物素修飾的接頭連接、NlaIII酶切、鏈霉素磁珠捕獲、以及含MmeI 酶切位點的接頭連接和MmeI酶切等操作構(gòu)建文庫，借助高通量測序儀精確檢測5hmC在全 基因組范圍內(nèi)的精確定位，建立一種單堿基分辨，精確檢測5hmC的技術(shù)。該技術(shù)需要構(gòu)建3 個不同的文庫，由于人為的濃度計算會引入相應(yīng)的誤差，影響檢測準(zhǔn)確性。此外，該技術(shù)檢 測的并不是直接的CCGG位點，而是在基因組上與其相鄰的CATG位點，因此不論是基因組結(jié) 構(gòu)的變異還是信息關(guān)聯(lián)的算法都會導(dǎo)致檢測位點關(guān)聯(lián)的錯誤。此外，由于非直接檢測CCGG 位點，需要保證所有的DNA片段內(nèi)都具有CATG位點，這大大降低了基因組檢測的范圍。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是降低實驗成本、高通量、提高基因組檢測范圍以及增 加數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性的檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法。
[0008] 本發(fā)明提供了一種檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法，其特征在于，包 括以下步驟：
[0009] 步驟一：設(shè)置三組反應(yīng)，其中一組對核酸進(jìn)行糖基化處理，其余兩組的核酸未經(jīng)糖 基化處理；
[0010] 步驟二：將步驟一中經(jīng)糖基化處理后的核酸的一組和未經(jīng)糖基化處理的核酸的一 組分別平行進(jìn)行MspI酶切反應(yīng)；將步驟一中剩余的未經(jīng)糖基化處理的核酸的一組同時進(jìn) 行HpaII酶切反應(yīng)；
[0011] 步驟三：將步驟二中三組中的每組的酶切片段分別連接含有不同Index且同時包 含Ecopl5I或MmeI酶切位點的接頭A，將連接有不同的接頭A的各組的核酸混合到一起，得 到一個包含無修飾、甲基化修飾和羥甲基化修飾的核酸文庫；
[0012] 步驟四：運用Bst DNA聚合酶將核酸文庫中的雙鏈DNA接頭中有缺口的一條鏈進(jìn) 行修復(fù)；
[0013] 步驟五：對上一步得到的核酸進(jìn)行Ecopl5I或MmeI酶切，產(chǎn)生短片段DNA序列。
[0014] 步驟六：回收連接接頭A的短DNA片段；
[0015] 步驟七：將一段有兩個堿基粘性末端的P7接頭與步驟六的連接接頭A的短DNA片 段進(jìn)行連接；
[0016] 步驟八：以接頭A和P7接頭的DNA序列設(shè)計通用引物對步驟七得到的連有P7接 頭及接頭A的短DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收純化PCR產(chǎn)物，建立測序文庫。
[0017] 步驟九：對步驟八得到的測序文庫進(jìn)行測序，分析比較序列信息，獲得核酸甲基化 修飾和羥甲基化修飾的信息。
[0018] 所述步驟一中所述的核酸為基因組DNA。
[0019] 所述步驟一中所述的糖基化處理為：核酸在T4-BGT酶的作用下，以尿嘧啶二磷酸 葡萄糖為底物，將葡萄糖單元轉(zhuǎn)移至核酸的5-羥甲基胞嘧啶上，形成β -葡糖基-5-羥甲 基胞嘧啶。
[0020] 所述接頭 A 序列為三對：SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6。
[0021] 所述 P7 接頭序列為 SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8。
[0022] 所述步驟八中的進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用的通用引物為SEQ ID NO :9和SEQ ID NO : 10。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的試劑盒，包括如 下組分：
[0024] (1)用于進(jìn)行糖基化修飾的試劑；
[0025] (2)限制性內(nèi)切酶，
[0026] (3)含有不同Index的接頭A，
[0027] (4) Bst DNA 聚合酶；
[0028] (5) -段有兩個堿基粘性末端的P7接頭；
[0029] (6)根據(jù)接頭A的DNA序列設(shè)計的通用引物；
[0030] (7)根據(jù)P7接頭的DNA序列設(shè)計通用引物；
[0031] 所述用于進(jìn)行糖基化修飾的試劑為T4 β -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0032] 所述限制性內(nèi)切酶為包括MspI、HpaII以及EcoP15I，或者包括MspI、HpaII以及 MmeI0
[0033] 所述接頭A序列同時包含Ecopl5I或MmeI酶切位點，為三對：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ;所述P7 接頭為 SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8 ;所述根據(jù)接頭A的DNA序列設(shè)計的通用引物為SEQ ID NO :9,所 述根據(jù)P7接頭的DNA序列設(shè)計通用引物為SEQ ID NO: 10。
[0034] 本發(fā)明檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法運用糖基化轉(zhuǎn)移酶修飾和甲 基化敏感性不同的限制性內(nèi)切酶酶切，可以同時檢測全基因組內(nèi)幾乎全部CCGG位點的不 同修飾即甲基化和羥甲基化的豐度；通過在接頭A內(nèi)引入index和酶切位點，可以將酶切后 產(chǎn)生的未修飾、甲基化修飾和羥甲基化修飾的短DNA序列混合到一起，3個不同的文庫整合 到一個文庫中，三個文庫可以平行建庫和實驗，相互作為參照，直接分析基因組CCGG位點 的修飾情況，具有高通量、高準(zhǔn)確性并可降低實驗和測序誤差；此外，該技術(shù)不依賴于重亞 硫酸鹽的轉(zhuǎn)換，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)甲基化檢測技術(shù)中無法分辨甲基化和羥甲基化修飾的缺點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為本發(fā)明檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法檢測文庫片段的結(jié)果， 其中橫坐標(biāo)為插入片段大小，縱坐標(biāo)為信號強(qiáng)度。
[0036] 圖2為本發(fā)明檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法的流程圖。
[0037] 圖3為本發(fā)明檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法的測序和數(shù)據(jù)比對結(jié) 果。
[0038] 圖4為本發(fā)明檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法檢測的各CCGG位點的 甲基化、羥甲基化水平。

【具體實施方式】
[0039] 本發(fā)明提供了一種檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法，如圖2所示，包 括如下步驟：
[0040] 步驟一：對基因組DNA中的5-hmC進(jìn)行糖基化修飾以及對照組反應(yīng)
[0041] 圖2的上端從左至右依次為A組、C組和B組
[0042] A組：取沒有蛋白、RNA污染的完整基因組DNA用T4 β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（簡稱 T4-BGT)進(jìn)行處理；
[0043] B組和C組：同時，各取兩份與A組等量的基因組DNA不進(jìn)行糖基化處理，作為參 照組，設(shè)為B組和C組。
[0044] A組中經(jīng)T4-BGT處理后的基因組DNA，羥甲基胞嘧啶（5-hmC)轉(zhuǎn)化為糖基羥甲基 化胞嘧啶（5-ghmC)。該反應(yīng)不依賴于DNA的序列結(jié)構(gòu)，所有的5-hmC都將被糖基化修飾，而 胞嘧啶（5-C)和甲基胞嘧啶（5-mC)則不會糖基化。
[0045] B組和C組由于沒有糖基化處理，所有的堿基都不會發(fā)生堿基修飾的改變。
[0046] 所述基因組DNA可以來源于動物組織提取的基因組DNA、細(xì)胞基因組DNA等，只要 基因組序列中的CCGG位點存在C hCGG羥甲基化修飾，均可運用該技術(shù)進(jìn)行檢測。
[0047] 步驟二：限制性內(nèi)切酶MspI酶切消化
[0048] 將步驟一中A組經(jīng)T4-BGT處理后的DNA和B組DNA分別平行進(jìn)行MspI酶切反 應(yīng)，MspI能識別和切割CCGG位點，該酶切反應(yīng)不受甲基化（5-mC)和羥甲基化（5hmC)修飾 的影響，但是當(dāng)5-hmC轉(zhuǎn)變?yōu)?-ghmC后，抑制了 MspI的酶切，因此，A組中該位點經(jīng)糖基羥 甲基修飾后不能被切開，而B組該位點未經(jīng)糖基羥甲基修飾則可以被切開。
[0049] 將步驟一中C組DNA同時進(jìn)行HpaII酶切反應(yīng)。該HpaII酶同樣識別CCGG位點， 但是受甲基化（5-mC)和羥甲基化（5hmC)修飾的抑制，只能切割未經(jīng)任何修飾的識別位點。
[0050] 步驟三：接頭A的連接
[0051] 將上述A組、B組和C組中的每組的酶切片段分別連接含有不同Index的接頭A， 其接頭序列同時包含Ecopl5I或MmeI酶切位點。
[0052] 將連接有不同的接頭A的各組的DNA混合到一起，得到一個包含無修飾、甲基化修 飾和羥甲基化修飾的DNA文庫。
[0053] 步驟四：Bst DNA polymerase fragment 處理
[0054] 運用Bst DNA聚合酶將雙鏈DNA接頭中有缺口的一條鏈進(jìn)行修復(fù)，彌補(bǔ)DNA與接 頭之間可能存在的缺口。
[0055] 步驟五：EcoP15I或MmeI酶切
[0056] 對上一步得到的DNA進(jìn)行Ecopl5I或MmeI酶切（根據(jù)接頭A的接頭序列確定，當(dāng) 接頭序列同時包含Ecopl5I時，這里使用Ecopl5I酶切，當(dāng)接頭序列同時包含MmeI時，這 里使用MmeI酶切），產(chǎn)生短片段DNA序列。這些短片段DNA序列連接接頭A的一端包含有 CCGG位點的修飾信息，另一端產(chǎn)生一個兩堿基的粘性末端。通過分析連接不同index的短 片段的數(shù)量，即可得出該位置甲基化修飾、羥甲基化修飾的相對豐度。
[0057] 步驟六：片段選擇
[0058] 通過丙烯酰胺凝膠電泳，回收連接接頭A的短DNA片段。
[0059] 步驟七：P7接頭連接
[0060] 在DNA連接酶的作用下，將一段有兩個堿基粘性末端的P7接頭與步驟六的連接接 頭A的短DNA片段進(jìn)行連接。
[0061] 步驟八：PCR擴(kuò)增
[0062] 以接頭A和P7接頭的DNA序列設(shè)計通用引物對步驟七得到的連有P7接頭及接頭 A的短DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立可以高通量測序的文庫。
[0063] 步驟九：PCR產(chǎn)物的回收
[0064] 用丙烯酰胺凝膠電泳回收純化PCR產(chǎn)物，得到上機(jī)文庫。
[0065] 步驟十文庫質(zhì)控
[0066] 回收產(chǎn)物運用QPCR和Agilent Bio-analyzer進(jìn)行文庫插入片段和上機(jī)濃度的質(zhì) 控。
[0067] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的試劑盒，所述試 劑盒包括：
[0068] (1)用于進(jìn)行糖基化修飾的試劑；優(yōu)選為T4 β -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；
[0069] (2)限制性內(nèi)切酶，優(yōu)選為包括MspI、HpaII以及EcoP15I，或者優(yōu)選為包括MspI、 HpaII 以及 MmeI ;
[0070] (3)含有不同Index的接頭A，其接頭序列同時包含Ecopl5I或MmeI酶切位點；優(yōu) 選為三對：SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO:6。
[0071] (4) Bst DNA 聚合酶；
[0072] (5) -段有兩個堿基粘性末端的P7接頭；優(yōu)選為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8。
[0073] (6)根據(jù)接頭A的DNA序列設(shè)計的通用引物；優(yōu)選為SEQ ID NO :9。
[0074] (7)根據(jù)P7接頭的DNA序列設(shè)計通用引物；優(yōu)選為SEQ ID NO : 10。
[0075] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0076] 步驟一：對基因組DNA中的5-hmC進(jìn)行糖基化修飾以及對照組反應(yīng)
[0077] A組：取500ng人源基因組DNA (全血DNA)為起始量進(jìn)行糖基化處理：
[0078] B組和C組：同時，各取兩份500ng人源基因組DNA (全血DNA)不進(jìn)行糖基化處理， 作為參照組，設(shè)為B組和C組。
[0079] 各組的處理方法如下：
[0080] 1)在I. 5ml的離心管中配制如表1所示的反應(yīng)體系：
[0081] 表 1
[0082]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一：設(shè)置三組反應(yīng)，其中一組對核酸進(jìn)行糖基化處理，其余兩組的核酸未經(jīng)糖基化 處理； 步驟二：將步驟一中經(jīng)糖基化處理后的核酸的一組和未經(jīng)糖基化處理的核酸的一組 分別平行進(jìn)行MspI酶切反應(yīng)；將步驟一中剩余的未經(jīng)糖基化處理的核酸的一組同時進(jìn)行 Hpall酶切反應(yīng)； 步驟三：將步驟二中三組中的每組的酶切片段分別連接含有不同Index且同時包含 Ecopl5I或Mmel酶切位點的接頭A，將連接有不同的接頭A的各組的核酸混合到一起，得到 一個包含無修飾、甲基化修飾和羥甲基化修飾的核酸文庫； 步驟四：運用Bst DNA聚合酶將核酸文庫中的雙鏈DNA接頭中有缺口的一條鏈進(jìn)行 修復(fù)； 步驟五：對上一步得到的核酸進(jìn)行Ecopl5I或Mmel酶切，產(chǎn)生短片段DNA序列； 步驟六：回收連接接頭A的短DNA片段； 步驟七：將一段有兩個堿基粘性末端的P7接頭與步驟六的連接接頭A的短DNA片段進(jìn) 行連接； 步驟八：以接頭A和P7接頭的DNA序列設(shè)計通用引物對步驟七得到的連有P7接頭及 接頭A的短DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收純化PCR產(chǎn)物，建立測序文庫； 步驟九：對步驟八得到的測序文庫進(jìn)行測序，分析比較序列信息，獲得核酸甲基化修飾 和羥甲基化修飾的信息。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法，其特征在于， 步驟一中所述的核酸為基因組DNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法，其特征在于， 步驟一中所述的糖基化處理為：核酸在T4- BGT酶的作用下，以尿嘧啶二磷酸葡萄糖為底 物，將葡萄糖單元轉(zhuǎn)移至核酸的5-羥甲基胞嘧啶上，形成0 -葡糖基-5-羥甲基胞嘧啶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法，其特征在于， 所述接頭 A 序列為三對：SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法，其特征在于， 所述P7接頭序列為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的方法，其特征在于， 所述步驟八中的進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用的通用引物為SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:10。
7. -種用于檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的試劑盒，其特征在于，包括如下組 分： (1) 用于進(jìn)行糖基化修飾的試劑； (2) 限制性內(nèi)切酶， (3) 含有不同Index的接頭A， (4) Bst DNA 聚合酶； (5) -段有兩個堿基粘性末端的P7接頭； (6) 根據(jù)接頭A的DNA序列設(shè)計的通用引物； (7)根據(jù)P7接頭的DNA序列設(shè)計通用引物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的試劑盒，其特征 在于，所述用于進(jìn)行糖基化修飾的試劑為T4 0 -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的試劑盒，其特 征在于，所述限制性內(nèi)切酶為包括MspI、HpaII以及EcoP15I，或者包括MspI、HpaII以及 MmeI〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于檢測核酸甲基化修飾和羥甲基化修飾的試劑盒，其特 征在于，所述接頭A序列同時包含Ecopl5I或Mmel酶切位點，為三對：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ;所述P7 接頭為 SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8 ;所述根據(jù)接頭A的DNA序列設(shè)計的通用引物為SEQ ID NO :9,所 述根據(jù)P7接頭的DNA序列設(shè)計通用引物為SEQ ID NO: 10。
【文檔編號】C12Q1/68GK104480214SQ201410841922
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】高飛, 王君文, 夏渝東, 吉冠玉 申請人:深圳市易基因科技有限公司