一種利用離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法
【專利摘要】一種利用離子交換纖維固定果糖基轉(zhuǎn)移酶制備方法，是利用弱堿性陰離子交換纖維為載體把液態(tài)游離果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化于載體上，使用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶活力能夠長期保存且能的重復(fù)長期使用。本發(fā)明包括兩部份技術(shù)內(nèi)容，利用生物溶菌酶制備液態(tài)游離果糖基轉(zhuǎn)移酶和利用離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶；米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)得大量菌體，經(jīng)洗滌、利用纖維酶溶解菌體、提取游離酶液、用離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，所得制得固定化酶活力≥180U/g、半衰期≥40次，轉(zhuǎn)化蔗糖轉(zhuǎn)化率≥90%，轉(zhuǎn)化蔗糖生成低聚果糖含量55～60%。與目前公開技術(shù)相比具有酶提取簡潔、操作時間短、容易再生利用、固定化過程不使用交聯(lián)劑、產(chǎn)品質(zhì)量安全性高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種利用離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，具體是一種利用離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，果糖基轉(zhuǎn)移酶高活性菌絲體發(fā)酵、酶法細(xì)胞分解提取酶液、離子交換纖維固定化果糖轉(zhuǎn)移酶。

【背景技術(shù)】
[0002]離子交換纖維(1n Exchange Fiber,簡稱IEF)是一種纖維狀離子交換材料，離子交換纖維作為新型功能高分子材料，具有獨(dú)特的化學(xué)及物理吸附和分離功能，在一些相關(guān)領(lǐng)域有著不可代替的作用。離子交換纖維具有以下特點(diǎn):形狀多樣，可制成長短纖維，也可織布編網(wǎng)，易于制成各種組件，并可根據(jù)其應(yīng)用目的而選擇其最好的形狀、交換容量大、比表面積大、交換速度快，一般能達(dá)到顆粒狀樹脂的20倍，并且具有吸附效率高、易于再生等優(yōu)點(diǎn)、再生速度快，循環(huán)使用次數(shù)多，使用中纖維損耗低。在生物酶固定化領(lǐng)域是利用帶胺基的離子交換纖維與酶的之間的靜電引力來實現(xiàn)接枝方式進(jìn)行固化，是新型的生物酶固定化載體材料。
[0003]果糖基轉(zhuǎn)移酶(fructosyltransferase, FTase , EC2.4.1.9)能催化水溶液蔗糖分子內(nèi)轉(zhuǎn)移生成蔗果低聚糖。其酶促反應(yīng)機(jī)理:當(dāng)以蔗糖為底物時，最初只有蔗果三糖(GF2 )和葡萄糖(G)生成:2GF — GF2+ G,但隨著反應(yīng)進(jìn)行下去，蔗果三糖(GF2 )和蔗果四糖(GF3 )也可以作為反應(yīng)底物，其反應(yīng)分別是:2GF2 — GF3 + G; 2GF3 — GF4(蔗果五糖)+ G，也可用一個反應(yīng)方程式來描述FTase的酶促反應(yīng):GFn + GFn — GFn +工+ GFn-1，是工業(yè)上酶法轉(zhuǎn)化蔗糖制備低聚果糖(FOS)的關(guān)鍵酶。酶是否能回收再次使用是各研究機(jī)構(gòu)及企業(yè)研究重點(diǎn)，其中，把果糖基轉(zhuǎn)移酶固定于特定載體上是最有效的途徑。如中國專利CN01128345.9公開了闡述了一種以蔗糖為原料，工業(yè)化生產(chǎn)蔗果低聚糖(低聚果糖)方法，它包括固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)以及利用該酶制劑進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)FOS兩部分:一、選擇具有能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)良菌株，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁，用離心法和超濾法將酶分離純化，再用殼聚糖或樹脂為載體以戊二醛為交聯(lián)試劑將酶固定下來，固定化條件:PH=4?9，溫度=10?60°C，攪拌轉(zhuǎn)速=20?100r/min，酶活與載體比=20?160U，交聯(lián)劑戊二醛濃度=0.05?0.3%。固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶可重復(fù)使用多次；二、分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法以固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖；采用本發(fā)明方法得到的蔗果低聚糖產(chǎn)品不必經(jīng)過活性碳脫色，不需離子交換柱脫鹽，可以獲得Brix彡75，固形物中總低聚糖彡50%的FOS糖漿；中國專利CN200910094419.7公開一種新型果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化方法，包括下列步驟:(I)向殼聚糖醋酸溶液中加入0.01%?0.05%粘合劑聚乙烯吡咯烷酮；(2)將上述殼聚糖醋酸溶液滴加到乙醇調(diào)節(jié)過的NaOH溶液中，制備殼聚糖球形顆粒，并將殼聚糖球形顆粒用蒸餾水洗滌至中性；(3)將中性殼聚糖球形顆粒置于pH = 7的磷酸緩沖液中，加入戊二醛交聯(lián)劑，使之鍵合在殼聚糖球形顆粒上，并充分洗滌，以除掉未鍵合的戊二醛；(4)將鍵合了戊二醛的殼聚糖球形顆粒置于PH = 7磷酸緩沖液，然后向其中加入果糖基轉(zhuǎn)移酶，使之固定化；本發(fā)明固定了果糖基轉(zhuǎn)移酶，提高了殼聚糖作為固定化酶載體的機(jī)械強(qiáng)度，提高了酶負(fù)載量；中國專利CN200910026901.7公開一種以大孔陰離子樹脂固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，屬于固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明包括游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備及果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化兩部分，本發(fā)明篩選出了大孔陰離子樹脂D380、D296R、或D301-1II為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，采用先吸附后交聯(lián)的方法進(jìn)行固定化。載體材料價格低廉，機(jī)械強(qiáng)度好，物化性能穩(wěn)定，容易再生，樹脂吸附酶間接起到提取作用，因此對于粗酶液的純度沒有過高的要求，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，所得固定化酶酶活回收率可達(dá)81.2%以上，可循環(huán)使用10次。
[0004]以上幾種固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶比游離酶有較好工業(yè)應(yīng)用前景，實現(xiàn)了可回收重復(fù)使用特點(diǎn)，但是以上幾種方法都存在制備較繁雜，固定化后活性不高、固定化酶半衰期短、使用較多化學(xué)試劑、使用具有毒性戊二醛作交聯(lián)劑，由于反應(yīng)過程中部酶脫落造成戊二醛游離出對產(chǎn)品有食品安全風(fēng)險，固定化酶機(jī)械抗性差等不足。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，它能夠提固定化回收率、固定化酶活性高、半衰期長、安全性高、不使用化學(xué)試劑等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的:一種利用離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟:
(1)高含果糖基轉(zhuǎn)移酶菌絲體制備:米曲霉(Aspergillusoryzae)在溫度=28?33°C,pH=4.5?6.5，時間=36?42h，通氣量為0.15VVM，轉(zhuǎn)速=150r/min條件下大量發(fā)酵得到菌絲體，經(jīng)分離洗滌得到干凈菌絲體；
(2)游離果糖基轉(zhuǎn)移酶液制備:將步驟(I)制得的干凈菌絲體置于攪拌罐內(nèi)，添加2?4倍(W/W)重量的純化水和1.5?2%(W/W)活力10?15萬/g的固定化纖維酶，攪拌罐攪拌轉(zhuǎn)速=50?80r/min，操作溫度=30°C，反應(yīng)5?8h后離心分離，離心機(jī)為上卸料式，離心半徑=400_，電機(jī)轉(zhuǎn)速=1400?1500r/min,，離心分離取液體得到游離果糖基轉(zhuǎn)移酶；
(3)固定化載體處理:選用粒度均勻的弱堿性陰離子交換纖維，用食品級乙醇，濃度=55?70% (V/V)浸泡40?60min，分離回收乙醇，然后用純化水洗滌離子交換纖維2?4次后備用；
(4)固定化:將步驟(2)得到的游離果糖基轉(zhuǎn)移酶添加至固定化反應(yīng)罐內(nèi)并按每300U?400U酶活力加入I?1.5g離子交換纖維載體，固定化溫度=25?28°C，PH值=5.5?
6.5,攪拌轉(zhuǎn)速=35?45r/min,吸附時間=2?3h,過濾取固體物得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶；
(5)冷藏:冷藏的目的是穩(wěn)定吸附提升固定化，將步驟(4)所得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶置于2?5°C冷庫內(nèi)保存4?6h，用純化水沖洗3?4次，即得到高活性固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0007]本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)在于:
(I)利用帶胺基的離子交換纖維與酶的之間的靜電引力來實現(xiàn)接枝方式進(jìn)行固化，不使用具有毒性戊二醛交聯(lián)劑，確保固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶使用安全性且提高固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的半衰期。利用離子交換纖維具有交換容量大、比表面積大、交換速度快、循環(huán)使用次數(shù)多、使用過程中纖維損耗低等優(yōu)點(diǎn)成功實現(xiàn)了離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，并提高固定化回收率、固定化酶活性。
[0008](2)使用酶法破碎菌絲體細(xì)胞，避免使用機(jī)械破碎過熱導(dǎo)致酶失活、超聲波破碎法設(shè)備投資大等缺點(diǎn)。
[0009](3)工藝簡潔、設(shè)備成熟、操作方便適合工業(yè)化應(yīng)用。

【具體實施方式】
[0010]以下通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。
[0011]實施例1
米曲霉(Aspergillus oryzae)在溫度=28°C,ρΗ=4.5,時間=36h,通氣量為 0.15VVM,轉(zhuǎn)速=150r/min條件下發(fā)酵、分離洗滌得到干凈菌絲體置于攪拌罐內(nèi)，添加2倍(W/W)重量的純化水和1.5%(ff/ff)活力10萬U/g的固定化纖維酶，攪拌轉(zhuǎn)速=50r/min，操作溫度=30°C，反應(yīng)5h，用離心半徑=400mm，電機(jī)轉(zhuǎn)速=1400r/min的離心機(jī)分離取液體得到游離果糖基轉(zhuǎn)移酶并置于固定化反應(yīng)罐內(nèi)，按每酶活力=300U加入Ig用濃度=55% (V/V)食品級乙醇浸泡40min，純化水洗滌2次的弱堿性陰離子交換纖維。固定化溫度=25°C，PH值=5.5，攪拌轉(zhuǎn)速=35r/min，吸附時間=2h后過濾取固體物得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶；所得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶置于2°C冷庫內(nèi)保存4h，用純化水沖洗3次，得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。按GB/T23528-2009附錄B方法檢測固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶活力=255U/g，蔗糖轉(zhuǎn)化率=92%，低聚果糖含量=59.2%,間歇式轉(zhuǎn)化鹿糖試驗得到半衰期=45次。
[0012]實施例2
米曲霉(Aspergillus oryzae)在溫度=33°C, ρΗ=5.5,時間=42h,通氣量為 0.15VVM,轉(zhuǎn)速=150r/min條件下發(fā)酵、分離洗滌得到干凈菌絲體置于攪拌罐內(nèi)，添加4倍(W/W)重量的純化水和2.0%(W/W)活力15萬U/g的固定化纖維酶，攪拌轉(zhuǎn)速=50r/min，操作溫度=30°C,反應(yīng)8h,用離心半徑=400mm,電機(jī)轉(zhuǎn)速=1500r/min的離心機(jī)分離取液體得到游離果糖基轉(zhuǎn)移酶并置于固定化反應(yīng)罐內(nèi)，按每酶活力=400U加入1.5g用濃度=70% (V/V)食品級乙醇浸泡60min，純化水洗滌4次的陰性弱堿性離子交換纖維。固定化溫度=28°C，PH值=6.5，攪拌轉(zhuǎn)速=45r/min，吸附時間=3h后過濾取固體物得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶；所得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶置于5°C冷庫內(nèi)保存6h，用純化水沖洗4次，得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。按GB/T23528-2009附錄B方法檢測固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶活力=245U/g，蔗糖轉(zhuǎn)化率=91.8%,低聚果糖含量=60.6%間歇式轉(zhuǎn)化鹿糖試驗得到半衰期=42次。
[0013]實施例3
米曲霉(Aspergillus oryzae)在溫度=31°C, ρΗ=5.5,時間=38h,通氣量為 0.15VVM,轉(zhuǎn)速=150r/min條件下發(fā)酵、分離洗滌得到干凈菌絲體置于攪拌罐內(nèi)，添加3倍(W/W)重量的純化水和2.0%(W/W)活力12萬U/g的固定化纖維酶，攪拌轉(zhuǎn)速=60r/min，操作溫度=30°C,反應(yīng)5h,用離心半徑=400mm,電機(jī)轉(zhuǎn)速=1500r/min的離心機(jī)分離取液體得到游離果糖基轉(zhuǎn)移酶并置于固定化反應(yīng)罐內(nèi)，按每酶活力=320U加入1.2g用濃度=60% (V/V)食品級乙醇浸泡45min，純化水洗滌3次的陰性弱堿性離子交換纖維。固定化溫度=26°C，PH值=6.0，攪拌轉(zhuǎn)速=40r/min，吸附時間=3h后過濾取固體物得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶；所得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶置于4°C冷庫內(nèi)保存6h，用純化水沖洗2次，得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。按GB/T23528-2009附錄B方法檢測固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶活力=250U/g，蔗糖轉(zhuǎn)化率=91.8%,低聚果糖含量=59.5%間歇式轉(zhuǎn)化鹿糖試驗得到半衰期=43次。
[0014]實施例4
米曲霉(Aspergillus oryzae)在溫度=30°C, ρΗ=5.2,時間=40h,通氣量為 0.15VVM,轉(zhuǎn)速=150r/min條件下發(fā)酵、分離洗滌得到干凈菌絲體置于攪拌罐內(nèi)，添加3倍(W/W)重量的純化水和1.8%(W/W)活力14萬U/g的固定化纖維酶，攪拌轉(zhuǎn)速=50r/min，操作溫度=30°C,反應(yīng)6h,用離心半徑=400mm,電機(jī)轉(zhuǎn)速=1400r/min的離心機(jī)分離取液體得到游離果糖基轉(zhuǎn)移酶并置于固定化反應(yīng)罐內(nèi)，按每酶活力=350U加入1.4g用濃度=65% (V/V)食品級乙醇浸泡50min，純化水洗滌3次的陰性弱堿性離子交換纖維。固定化溫度=26°C，PH值=5.3，攪拌轉(zhuǎn)速=40r/min，吸附時間=2h后過濾取固體物得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶；所得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶置于3°C冷庫內(nèi)保存5h，用純化水沖洗3次，得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。按GB/T23528-2009附錄B方法檢測固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶活力=235U/g，蔗糖轉(zhuǎn)化率=90.9%,低聚果糖含量=58.5%,間歇式轉(zhuǎn)化鹿糖試驗得到半衰期=44次。
【權(quán)利要求】
1.一種利用離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)高含果糖基轉(zhuǎn)移酶菌絲體制備:經(jīng)米曲霉(Aspergillusoryzae)大量發(fā)酵得到菌絲體，經(jīng)分離洗滌得到干凈菌絲體； (2)游離果糖基轉(zhuǎn)移酶液制備:將步驟(1)制得的干凈菌絲體置于攪拌罐內(nèi)，添加2?4倍(W/W)重量的純化水和1.5?2%(W/W)的活力為10?15萬U/g固定化纖維酶，反應(yīng)5?8h，離心分離取液體得到游離果糖基轉(zhuǎn)移酶； (3)固定化載體處理:選用粒度均勻的離子交換纖維，用食品級乙醇處理40?60min，然后用純化水洗滌2?4次后備用； (4)固定化吸附:將步驟(2)得到的游離果糖基轉(zhuǎn)移酶添加至固定化反應(yīng)罐內(nèi)并同時加入定量的離子交換纖維，吸附2?3h，過濾取固體物得到固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶； (5)冷藏穩(wěn)定吸附提升固定化:將步驟(4)所得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶置于2?5°C冷庫內(nèi)保存4?6h，純化水沖洗3?4次，即得到高活性固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)米曲霉(Aspergillus oryzae)發(fā)酵產(chǎn)酶，溫度=28?33°C,pH=4.5?6.5,時間=36?42h,通氣量為0.15VVM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于所述步驟(2)攪拌罐攪拌轉(zhuǎn)速為50?80r/min,離心機(jī)為上卸料式，離心半徑=400mm,電機(jī)轉(zhuǎn)速=1400?1500/min，操作溫度=30°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶制備方法，其特征在于，所用離子交換纖維是弱堿型，所述步驟(3)食品級乙醇濃度=55?70% (V/V)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)固定化溫度=25?28°C，PH=5.5?6.5，攪拌轉(zhuǎn)速=35?45r/min，每300?400U活力加入1?1.5g離子交換纖維載體，吸附時間=2?3h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子交換纖維固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶制備方法，其特征在于，所述步驟(5)固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶置于冷藏溫度=2?5°C，時間=4?6h，純化水洗滌即得到高活性固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
【文檔編號】C12R1/69GK104450662SQ201410847613
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】方昱 申請人:臨沂市宏昱生物科技有限公司