基于數(shù)字pcr鑒定純合型或雜合型mon810的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于數(shù)字PCR鑒定純合型或雜合型MON810的方法，涉及分子生物學(xué)及轉(zhuǎn)基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本方法是：①收集：采用歐盟經(jīng)過驗(yàn)證的MON810特異性轉(zhuǎn)化事件以及玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因hmgA定量檢測(cè)方法；②數(shù)字PCR擴(kuò)增：以MON810的DNA為研究模板；③數(shù)據(jù)分析：如果MON810特異性轉(zhuǎn)化事件和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間有重疊，判定為純合型MON810；如果MON810特異性轉(zhuǎn)化事件目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間的二倍和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間有重疊，則判定為雜合型MON810；本發(fā)明是一種快速、準(zhǔn)確和可靠地鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810絕對(duì)定量的方法。
【專利說明】基于數(shù)字PCR鑒定純合型或雜合型M0N810的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及轉(zhuǎn)基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于數(shù)字PCR鑒定 純合型或雜合型M0N810的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉(zhuǎn)基因作物已在很多國(guó)家獲準(zhǔn)種植和生 產(chǎn)，截止到2013年，世界范圍內(nèi)已經(jīng)有27種作物涉及336個(gè)轉(zhuǎn)化體在36個(gè)不同的國(guó)家和 地區(qū)獲準(zhǔn)種植或用作加工原料，種植面積已達(dá)1. 75億公頃，其中27%的面積種植著包括多 個(gè)轉(zhuǎn)化事件的基因疊加品種（James，2013,國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織)。隨著轉(zhuǎn)基因 事件的不斷增加，給各國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管帶來了越來越大的挑戰(zhàn)。
[0003] 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，在制 備轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的程序和環(huán)節(jié)過程中，原材料純合度鑒定是制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 目前美國(guó)油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOCS)和歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和度量研究所（IRMM)鑒定純合度的方法 主要是采用傳統(tǒng)的育種方式或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的方法(李允靜等，2013,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué))。 同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)采用傳統(tǒng)育種方式，需要通過多年多代自交，才能獲得純合轉(zhuǎn)基因材料，耗 時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；而實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法本身誤差大，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行純合度鑒定時(shí)， 誤差比較大，給結(jié)果判定帶來很大困難。
[0004] 數(shù)字 PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作為 DNA 定量的新技術(shù)， 實(shí)現(xiàn)了單分子DNA絕對(duì)定量。目前在臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定量、單細(xì)胞基因表達(dá)、環(huán)境微 生物檢測(cè)和下一代測(cè)序等方面的研究發(fā)揮了重要作用（李亮等，2012,生物化學(xué)與生物物理 進(jìn)展)。Corbisier等采用數(shù)字PCR技術(shù)分析了轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米M0N810種子粉末的外源檢 測(cè)基因和&基因的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)采用數(shù)字PCR檢測(cè)的拷貝數(shù)比值絕對(duì)定量結(jié)果，同采用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法并利用質(zhì)粒DNA做標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)種子粉末進(jìn)行相對(duì)定量的結(jié)果比 值相一致。因此提出了數(shù)字PCR具有計(jì)量特性，可以用來測(cè)量轉(zhuǎn)基因相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DNA拷 貝數(shù)比率.單分子擴(kuò)增效率對(duì)于改善總DNA片段的拷貝數(shù)和短片段完整DNA的估計(jì)偏差 有顯著意義。目標(biāo)DNA分子在反應(yīng)室的隨機(jī)和獨(dú)立分布是數(shù)字PCR準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵，Bhat 等認(rèn)為，反應(yīng)室的容量是不確定度的主要來源，并且評(píng)定的相對(duì)不確定度在6%以下，這項(xiàng) 發(fā)現(xiàn)可以用于其他數(shù)字PCR測(cè)量的置信水平研究。
[0005] 我們希望通過利用數(shù)字PCR技術(shù)，建立一種鑒定純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米 品系M0N810的方法，進(jìn)而為制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或原材料的鑒定繁殖工作奠定基礎(chǔ)，保障材料背 景的真實(shí)可靠。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有采用傳統(tǒng)育種和應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法鑒定 轉(zhuǎn)基因材料純合度存在的困難，提供一種基于數(shù)字PCR鑒定純合型或雜合型M0N810的方 法，所述的M0N810是轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品種。
[0007] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的： 一、基于數(shù)字PCR鑒定純合型或雜合型M0N810的方法 ① 收集 采用歐盟經(jīng)過驗(yàn)證的M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件以及玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA定量檢測(cè)方 法， M0N810引物序列： M0N810F :5, -TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3，， M0N810R:5' -GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3' ； M0N810探針序列： M0N810P :5' -FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-TAMRA-3' ； 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA引物序列： hmgAF :5' -TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'， hmgAR:5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3' ； 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA探針序列： hmgAP :5' -FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-TAMRA-3' ； ② 數(shù)字PCR擴(kuò)增 以M0N810的DNA為研究模板，分別利用上述引物探針組合進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增，將 M0N810用水稀釋至5ng/ μ 1或8ng/ μ 1的濃度，在48. 770的數(shù)字芯片上分別對(duì)兩個(gè)參數(shù)進(jìn) 行數(shù)字PCR擴(kuò)增，并收集目標(biāo)分子熒光信號(hào)； ③ 數(shù)據(jù)分析 利用數(shù)字PCR儀數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別計(jì)算Μ0Ν810特異性轉(zhuǎn)化事 件和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間；如果Μ0Ν810品系中特異性 轉(zhuǎn)化事件和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間有重疊，判定為純合型 M0N810 ;如果M0N810品系中特異性轉(zhuǎn)化事件目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間的二倍和玉 米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間有重疊，則判定為雜合型M0N810。
[0008] 工作機(jī)理： 本方法利用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)單分子DNA進(jìn)行絕對(duì)定量的基本工作原理，采用當(dāng)前分析 化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器中，每 個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的 反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的 體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因分別進(jìn) 行獨(dú)立的擴(kuò)增，根據(jù)采集到的目標(biāo)熒光分子數(shù)，分別計(jì)算統(tǒng)計(jì)外源基因和內(nèi)標(biāo)基因目標(biāo)分 子數(shù)，以及特異性轉(zhuǎn)化事件和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間是否有重疊， 來鑒定轉(zhuǎn)基因作物的純合度。
[0009]二、應(yīng)用 當(dāng)模板量為6ng和9. 6ng時(shí)，本方法能夠成功鑒定出純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米 品系 M0N810。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果： ①首次提供了利用數(shù)字PCR技術(shù)來鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系M0N810純合度的方法； ② 避免了利用傳統(tǒng)育種方法篩選純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系M0N810耗時(shí)長(zhǎng) 的問題； ③ 避免了利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法鑒定純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系 M0N810誤差大、結(jié)果判斷困難的問題。
[0011] 總之，本發(fā)明是一種快速、準(zhǔn)確和可靠地鑒定純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品 系M0N810絕對(duì)定量的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是模板量為6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)1 ; 圖2是模板量為6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增曲 線，重復(fù)2 ; 圖3是模板量為6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增曲 線，重復(fù)3 ; 圖4是模板量為6ng的純合型M0N810，玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增曲 線，重復(fù)4 ; 圖5是模板量為6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增曲 線，重復(fù)5 ; 圖6是模板量為6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增曲 線，重復(fù)6 ; 圖7是模板量為6ng的純合型M0N810，M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò)增 曲線，重復(fù)1 ; 圖8是模板量為6ng的純合型M0N810，M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò)增 曲線，重復(fù)2 ; 圖9是模板量為6ng的純合型M0N810，M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò)增 曲線，重復(fù)3 ; 圖10是模板量為6ng的純合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)4 ; 圖11是模板量為6ng的純合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)5 ; 圖12是模板量為6ng的純合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)6 ; 圖13是模板量為9. 6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)1 ; 圖14是模板量為9. 6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)2 ; 圖15是模板量為9. 6ng的純合M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增 曲線，重復(fù)3 ; 圖16是模板量為9. 6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)4 ; 圖17是模板量為9. 6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)5 ; 圖18是模板量為9. 6ng的純合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)6 ; 圖19是模板量為9. 6ng的純合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)1 ; 圖20是模板量為9. 6ng的純合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)2; 圖21是模板量為9. 6ng的純合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)3; 圖22是模板量為9. 6ng的純合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)4 ; 圖23是模板量為9. 6ng的純合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)5 ; 圖24是模板量為9. 6ng的純合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)6 ; 圖25是模板量為6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增 曲線，重復(fù)1 ; 圖26是模板量為6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增 曲線，重復(fù)2 ; 圖27是模板量為6ng的雜合M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增曲 線，重復(fù)3 ; 圖28是模板量為6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增 曲線，重復(fù)4 ; 圖29是模板量為6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增 曲線，重復(fù)5 ; 圖30是模板量為6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò)增 曲線，重復(fù)6 ; 圖31是模板量為6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)1 ; 圖32是模板量為6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)2 ; 圖33是模板量為6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)3 ; 圖34是模板量為6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)4 ; 圖35是模板量為6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)5 ; 圖36是模板量為6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)6 ; 圖37是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)1 ; 圖38是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)2 ; 圖39是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)3 ; 圖40是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)4 ; 圖41是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)5 ; 圖42是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810,玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA在微流體面板上的擴(kuò) 增曲線，重復(fù)6 ; 圖43是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)1 ; 圖44是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)2; 圖45是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)3; 圖46是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)4 ; 圖47是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)5 ; 圖48是模板量為9. 6ng的雜合型M0N810, M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件在微流體面板上的 擴(kuò)增曲線，重復(fù)6 ; 圖49是數(shù)字PCR反應(yīng)熱圖。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說明： 1、采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的基因組DNA 1)先將研缽和研棒在_20°C下冷凍IOh以上，同時(shí)將I. 5XCTAB提取液加熱100°C，將 10%CTAB預(yù)熱到56°C ;液氮研磨8. 0 g左右的轉(zhuǎn)基因玉米M0N810新鮮葉片，將粉末轉(zhuǎn)移至 50ml的離心管中；向離心管中加入20 ml預(yù)熱的I. 5 X CTAB提取液，用玻璃棒迅速攪拌均 勻后，放到56°C水浴40 min，期間不時(shí)輕輕顛倒均勻；水浴后，冷卻至室溫；加入20 ml氯仿 /異戊醇（24 :1)，加蓋，顛倒均勻至形成乳池狀，室溫下4000 r/min離心20 min ;轉(zhuǎn)移上清 到新的50 ml離心管中，加入1/10體積56°C預(yù)熱的10%CTAB溶液，再加入等體積氯仿/異 戊醇（24 :1)，顛倒混合30min，4000 r/min離心20 min ;轉(zhuǎn)移上清至新的50ml離心管中，力口 入等體積1%CTAB析出液，輕輕混合至形成DNA絮狀物，3000 r/min離心10分鐘使DNA沉于 管底；棄去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上幾分鐘以風(fēng)干沉淀，加入5 ml I M NaCl溶液 和5 μ I RNase，56°C水浴溶解DNA，過夜；加入10 ml預(yù)冷的95%乙醇，析出DNA，把DNA勾 出放到76%乙醇中浸泡30min ;轉(zhuǎn)移DNA到95%乙醇中5 min，離心去掉95%的乙醇，真空干 燥；干燥后，用ImlTE溶解DNA。
[0014] 2)采用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的樣品進(jìn)行濃度測(cè)定，用IOOng/ μ 1的XDNA作為參照，將純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的濃度定量到lOOng/μ 1的 濃度，260/280的吸光值測(cè)定值分別為1. 84和1. 83,備用。
[0015] 2、數(shù)字PCR檢測(cè) 1) 選取了經(jīng)歐盟驗(yàn)證的Μ0Ν810轉(zhuǎn)化體的特異性和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA定量檢測(cè)方法， 其中M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件擴(kuò)增片段大小是92bp，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA的擴(kuò)增片段大小是 79bp，M0N810引物序列： M0N810F :5, -TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3，， M0N810R:5' -GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3' ； M0N810探針序列： M0N810P :5' -FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-TAMRA-3' ； 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA引物序列： hmgAF :5' -TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'， hmgAR:5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3' ； 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA探針序列： hmgAP :5' -FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-TAMRA-3' ； 2) 數(shù)字 PCR 分析是在一臺(tái) BioMark HD System (Fluidigm, BioMark HD, USA) 上進(jìn)行，采用48. 770數(shù)字芯片，檢測(cè)及信號(hào)搜集軟件為BioMark Data Collection，分 析軟件為 Fluidigm Digital PCR analysis。
[0016] 數(shù)字PCR反應(yīng)體積為4 μ 1，其中DNA模板量為6ng或9. 6ng，其他組分含量為： TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystem,PN 4369016) 2 μ I, 20XGE Sample Loading Reagent (Fluidigm ,PN 85000746) 0.4 μ 1,20X gene-specific assays 0· 2 μ I，DNA-free water 0· 2 μ 1，DNA 溶液量為 I. 2 μ 1。
[0017] 數(shù)字PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0° C UNG處理120秒，95° C預(yù)變性600秒，進(jìn)行40次 PCR循環(huán)：95° C變性15秒，60° Cl分鐘退火及延伸，收集熒光信號(hào)。
[0018] 用水將轉(zhuǎn)基因玉米M0N810基因組DNA梯度稀釋至5ng/y 1和8ng/y 1兩個(gè)濃度， 以1. 2 μ L基因組DNA為模板，進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)，每個(gè)濃度每個(gè)參數(shù)反應(yīng)重復(fù)6次。 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 利用本發(fā)明中提供的方法對(duì)純合型或雜合型Μ0Ν810進(jìn)行分析鑒定。
[0019] 以DNA量為6ng的純合型Μ0Ν810為模板，采用玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA和Μ0Ν810轉(zhuǎn) 化體特異性事件的引物和探針分別進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA擴(kuò)增曲線圖如 圖 1 ?6,熱圖反應(yīng)如圖 49 中的 PanelOl-SOl、Panel02-S02、Panel03-S03、Panel07-S07、 Panel08-S08、Panel09-S09,均可以觀察到在每個(gè)微流體面板上擴(kuò)增曲線完好，Ct值集中在 20-35之間，且每個(gè)面板上有信號(hào)的反應(yīng)室的數(shù)量集中在的363-391之間，平均值為381. 5， 檢測(cè)到的目標(biāo)分子數(shù)平均值為527. 2,如表I ; M0N810轉(zhuǎn)化體特異性事件擴(kuò)增曲線如圖 7 ?12,熱圖反應(yīng)如圖 49 中的 Panel04-S04、Panel05-S05、Panel06-S06、PanellO-SlO、 Panel I I-Sl UPanel 12-S12,均可以觀察到在每個(gè)微流體面板上擴(kuò)增曲線完好，Ct值集中在 20-35之間，且每個(gè)面板上有信號(hào)的反應(yīng)室的數(shù)量集中在的340-368之間，平均值為353. 8， 檢測(cè)到的目標(biāo)分子數(shù)平均值為474. 3,如表1。M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間有重疊，結(jié)果符合遺傳規(guī)律，可判定為純合型轉(zhuǎn)基 因抗蟲玉米M0N810。
[0020] 以DNA量為9. 6ng的純合型M0N810為模板，采用玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA和M0N810 轉(zhuǎn)化體特異性事件的引物和探針分別進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA擴(kuò)增曲 線圖如圖 13 ?18,熱圖反應(yīng)如圖 49 中的 Panell3-S13、Panell4-S14、Panell5-S15、 Panel 19-S19、Panel20-S20、Panel21-S21，均可以觀察到在每個(gè)微流體面板上擴(kuò)增曲線完 好，Ct值集中在20-35之間，且每個(gè)面板上有信號(hào)的反應(yīng)室的數(shù)量集中在的476-495之間， 平均值為484. 2,檢測(cè)到的目標(biāo)分子數(shù)平均值為764. 0,如表I ; M0N810轉(zhuǎn)化體特異性事件 擴(kuò)增曲線如圖19?24,熱圖反應(yīng)如圖49中的Panell6-S16、Panell7-S17、Panell8-S18、 Panel22-S22、Panel23-S23、Panel24-S24,均可以觀察到在每個(gè)微流體面板上擴(kuò)增曲線完 好，Ct值集中在20-35之間，且每個(gè)面板上有信號(hào)的反應(yīng)室的數(shù)量集中在的456-483之間， 平均值為468. 7,檢測(cè)到的目標(biāo)分子數(shù)平均值為723. 5,如表1。M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件和 玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間有重疊，結(jié)果符合遺傳規(guī)律，可判 定為純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米M0N810。
[0021] 以DNA量為6ng的雜合型M0N810為模板，采用玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA和M0N810轉(zhuǎn) 化體特異性事件的引物和探針分別進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA擴(kuò)增曲線圖如 圖 25 ?30,熱圖反應(yīng)如圖 49 中的 Panel25-S25、Panel26-S26、Panel27-S27、Panel31-S31、 Panel32-S32、Panel33-S33,均可以觀察到在每個(gè)微流體面板上擴(kuò)增曲線完好，Ct值集中在 20-35之間，且每個(gè)面板上有信號(hào)的反應(yīng)室的數(shù)量集中在的338-372之間，平均值為347. 7， 檢測(cè)到的目標(biāo)分子數(shù)平均值為463. 2,如表I ; M0N810轉(zhuǎn)化體特異性事件擴(kuò)增曲線如圖 7 ?12,熱圖反應(yīng)如圖 49 中的 Panel28-S28、Panel29-S29、Panel30-S30、Panel34-S34、 Panel35-S35、Panel36-S36,均可以觀察到在每個(gè)微流體面板上擴(kuò)增曲線完好，Ct值集中在 20-35之間，且每個(gè)面板上有信號(hào)的反應(yīng)室的數(shù)量集中在的194-214之間，平均值為200. 3， 檢測(cè)到的目標(biāo)分子數(shù)平均值為232. 3,如表1。M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的 95%置信區(qū)間的二倍和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間有重疊，結(jié) 果符合遺傳規(guī)律，可判定為雜合型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米M0N810。
[0022] 以DNA量為9. 6ng的雜合型M0N810為模板，采用玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA和M0N810 轉(zhuǎn)化體特異性事件的引物和探針分別進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA擴(kuò)增曲 線圖如圖 37 ?42,熱圖反應(yīng)如圖 49 中的 Panel37-S37、Panel38-S38、Panel39-S39、 Panel43-S43、Panel44-S44、Panel45-S45,均可以觀察到在每個(gè)微流體面板上擴(kuò)增曲線完 好，Ct值集中在20-35之間，且每個(gè)面板上有信號(hào)的反應(yīng)室的數(shù)量集中在的475-501之間， 平均值為489. 3,檢測(cè)到的目標(biāo)分子數(shù)平均值為778. 7,如表I ; M0N810轉(zhuǎn)化體特異性事件 擴(kuò)增曲線如圖43?48,熱圖反應(yīng)如圖49中的Panel40-S40、Panel41-S41、Panel42-S42、 Panel46-S46、Panel47-S47、Panel48-S48,均可以觀察到在每個(gè)微流體面板上擴(kuò)增曲線完 好，Ct值集中在20-35之間，且每個(gè)面板上有信號(hào)的反應(yīng)室的數(shù)量集中在的285-358之間， 平均值為318. 3,檢測(cè)到的目標(biāo)分子數(shù)平均值為412. 3,如表1。M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件目 標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間的二倍和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95% 置信區(qū)間有重疊，結(jié)果符合遺傳規(guī)律，可判定為雜合型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米M0N810。
[0023] 以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系M0N810純合度鑒定提供了一 種基于數(shù)字PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確、可靠的絕對(duì)定量測(cè)定方法，可以鑒定出純合型或雜合型的轉(zhuǎn) 基因抗蟲玉米品系M0N810。本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因品種的鑒定和控制提供了必要的手段。
[0024] 表1玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA和M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件目標(biāo)分子數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析表

【權(quán)利要求】
1. 一種基于數(shù)字PCR鑒定純合型或雜合型M0N810的方法，其特征在于： ① 收集 采用歐盟經(jīng)過驗(yàn)證的M0N810特異性轉(zhuǎn)化事件以及玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA定量檢測(cè)方 法， M0N810引物序列： M0N810F :5, -TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3，， M0N810R:5' -GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3' ； M0N810探針序列： M0N810P ：5, -FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-TAMRA-3,； 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA引物序列： hmgAF :5' -TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'， hmgAR:5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3' ； 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA探針序列： hmgAP :5' -FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-TAMRA-3' ； ② 數(shù)字PCR擴(kuò)增 以M0N810的DNA為研究模板，分別利用上述引物探針組合進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增，將 M0N810用水稀釋至5ng/ ill或8ng/ ill的濃度，在48. 770的數(shù)字芯片上分別對(duì)兩個(gè)參數(shù)進(jìn) 行數(shù)字PCR擴(kuò)增，并收集目標(biāo)分子熒光信號(hào)； ③ 數(shù)據(jù)分析 利用數(shù)字PCR儀數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別計(jì)算M0N810特異性轉(zhuǎn)化事 件和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間；如果M0N810品系中特異性 轉(zhuǎn)化事件和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間有重疊，判定為純合型 M0N810 ;如果M0N810品系中特異性轉(zhuǎn)化事件目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間的二倍和玉 米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 hmgA目標(biāo)分子數(shù)計(jì)算值的95%置信區(qū)間有重疊，則判定為雜合型M0N810 ; 所述的M0N810是轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品種。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104480218SQ201510003973
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2015年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月6日
【發(fā)明者】李允靜, 吳剛, 李曉飛, 武玉花, 李飛武 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所