植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定的引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是對植物土傳病害尖孢鐮刀菌的快速鑒定方法。本發(fā)明采用設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列、下游引物序列、土傳病害真菌的DNA稀釋液以及Taq Mix和ddH2O配制成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行常規(guī)PCR檢測。本發(fā)明打破了傳統(tǒng)的鑒定方法，使得鑒定過程相當(dāng)簡單，無需進(jìn)行測序，只需將常規(guī)PCR反應(yīng)液進(jìn)行DNA電泳后，觀察是否在1000bp左右有條帶即可確定是否為尖孢鐮刀菌。
【專利說明】 植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定的引物及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]尖孢鐮刀菌是一種世界性分布的土傳病原真菌，寄主范圍廣泛，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉、豆科及花丼等100多種植物枯萎病的發(fā)生。
[0003]現(xiàn)目前，從土傳病害中鑒定尖孢鐮刀菌需要首先將感病植株的根部組織進(jìn)行消毒處理和病原菌分離，在獲得純化菌株后，再進(jìn)行室內(nèi)離體培養(yǎng)和形態(tài)鑒定；在不產(chǎn)孢或無法確定時(shí)，還需要將分離菌株進(jìn)行測序、比對，才能夠鑒定出尖孢鐮刀菌，其操作方法復(fù)雜，準(zhǔn)確性不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的主要是提供一種快速鑒定尖孢鐮刀菌的方法，解決了現(xiàn)有鑒定方法操作復(fù)雜，準(zhǔn)確性不高的問題。
[0005]本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定的引物，
其中，上游引物序列:5’-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3’ ；
下游引物序列:5’-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3’。
[0006]植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定方法，包括以下步驟:
(1)合成以下引物，
上游引物序列:5’-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3’ ；
下游引物序列:5’-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3’ ；
(2)制備土傳病害真菌的DNA稀釋液；
(3)配制PCR反應(yīng)體系；
(4)常規(guī)PCR檢測。
[0007]進(jìn)一步地，步驟(I)中合成的引物的濃度均為10Mmol/l，步驟(2)中制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
[0008]再進(jìn)一步地，步驟(3)中所述的配制PCR反應(yīng)體系，包括以下組分:
Taq Mix10μ1
上游引物2μ1
下游引物2μ1
DNA稀釋液?μ?
ddH205μ1。
[0009]更進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，65 °C退火30s，72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C終止 1min0
[0010]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果: (I)本發(fā)明打破了傳統(tǒng)的鑒定方法，使得鑒定過程相當(dāng)簡單，無需進(jìn)行形態(tài)鑒定和DNA測序，即可確定尖孢鐮刀菌。
[0011](2)本發(fā)明擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明尖孢鐮刀菌特異引物PCR后特異條帶圖。
[0013]圖2為本發(fā)明采用三種不同引物PCR后的對比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。實(shí)施例
[0015]轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，在檢測pin II終止子與zm-hra gene相連位置核酸片段時(shí)，步驟如下:
植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定方法，包括以下步驟:
(I)合成以下引物，
上游引物序列:5’-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3’ ；
下游引物序列:5’-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3’。
[0016]本實(shí)施例引物的合成濃度均為10Mmol/l。
[0017]以上引物的核苷酸序列是針對尖孢鐮刀菌設(shè)計(jì)；通過該設(shè)計(jì)就可以精準(zhǔn)鑒定出尖孢鐮刀菌。
[0018](2)制備土傳病害真菌的DNA稀釋液；即采用常規(guī)的DNA提取手段，從土傳病害真菌中提取出濃度為50ng/^l的DNA稀釋液。
[0019](3)配制PCR反應(yīng)體系；即將制備好的DNA稀釋液加入20μ1反應(yīng)體系中即可。
[0020]以上20μ1反應(yīng)體系包括以下組分:
Taq Mix10μ1
上游引物2μ1
下游引物2μ1
DNA稀釋液?μ?
ddH205μ1。
[0021](4)常規(guī) PCR 檢測。
[0022]根據(jù)上述PCR反應(yīng)體系，在以下PCR反應(yīng)條件下對產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增并檢測，所述PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，65 °C退火30s，72 °C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C終止lOmin。本實(shí)施例中采用的是常規(guī)的B1-RAD PCR儀。
[0023]擴(kuò)增后電泳條帶為1080bp，序列如下: CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGGTCGATCTGGAGGTCGATTCTCCGGCTGGCGGATCTGACACTGTCGAAA
CGAGATGCGGGCGGTGTAGGGTAGGCTAGTTTCGTCCTCGCCAGGTTGCGATTTGGACGAGATATGTGGTCTAGGG
TATGCTCTAGGGTAAGTAGAATTCGAGTTCCGTCGCCGACAGTTTTCTGTGGGTGTATGGTAGGTACAGGGTAGGCA
GATCTCTCTCCGGCCAGTACTTGTCTGGTGGTCGTGAGTCGATTTTTTTGTTTTGCCATACTATTGAATTTTGCGGAAATTCAAAAGTGGCTCGGGAGTCCCGCCTGGCGTGCGTCCGACTCGAACATCGTCGGTGTACATATGAGAGGGAGTAATCCGGCCCGGTCGGGGCCCATCGCGAGCTGCCGGGTAGGTAAAAGTAAAAAAGTTGTTAAGAGGCGCGGTGTCGGCGTGCTTGTATTTGCGGGAGAGAATTATCTGGGGGTGCTGGGTAGCCGGGAAGACTTGGACGGATCTGGCCCGGGAATGGGTCTGGGCCTGGATTCTGGTGTGGTGTAGGGTAGGCGTAGATAGATGAGTGGTCTAGGGTAGATACAGGGTAGCCAGACGTCTGGTATATAGTATGGGGGT.GTAGGGTAGGTCTGGACACCGTTTTCCACTTCGCCCTTCCCTTTAGTCGAGGGAGGACGATCTTGGCTGGGACGGAGGTGTAGGGTAGGCTTAACTTACGATTACATGATCTGTGTCACTCTAGGGTAGGTGAAAATCCCATATATGTATGATCACATTTGGTGAAGAGGTGGTTTGGCTGGTGAGATGGACAAAAGTGCAATATAGAATTATATGTGATTTTGCAAAAGTGGGTGTGAAATTGGGAAATCGGTTTTCCCGCACAGATGAGAGCACGTTTGAGGTTCCATGAGATGCACCTCTCCGAGACGACCTCAACGGTACCACCCATGTGTTGGTCGGGCTCCTGTGCGGCCGTCCAGGGCGGGATAAGTAGAGAATGTGGTGGTGTAGGGTAGGTGACCAGGTCCAGGGTAGGTTCGCCAAATCCGTCAATCCGGCTTGA 。
[0024]如圖1 所示，從左至右依次為 Marker、2、3、4、5、l、plus2、plus4、9、Marker、19、23、24、25、26、27、28、31、Marker、33、GDC3、GS1、YB3、YB 1、GG2、GS2、GS3，Marker 條帶之上而下為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp。其中 5、plus2、plus4、19、28、GS1、GG2 為陽性，即為尖孢鐮刀菌。
[0025]對本發(fā)明的序列進(jìn)行試驗(yàn)對比:
發(fā)明人采用本發(fā)明的引物、FO-EFla引物、FO-RBPl引物對菌株中的尖孢鐮刀菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖2所示，圖2中左邊是采用本發(fā)明的引物PCR六個(gè)菌株，其中前三個(gè)和最后一個(gè)是尖孢，第4、5泳道是木賊、赤霉；圖2中間是采用FO-EFI a引物PCR八個(gè)菌株，其中前四個(gè)和最后一個(gè)是尖孢，第5、6、7道分別是腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌、赤霉鐮刀菌；圖2右邊采用FO-RBPl引物PCR八個(gè)菌株，其中前四個(gè)和最后一個(gè)是尖孢，第5、6、7分別是腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌、赤霉鐮刀菌。值得說明的是每組中間均留有一個(gè)泳道。
[0026]從圖中可以看出，用本發(fā)明的引物能特異性的從菌株中鑒定出尖孢鐮刀菌，特異性條帶在IlOObp左右；而FO-EFla引物PCR雖也能得到特異性條帶，但是該引物不能區(qū)分赤霉鐮刀菌和尖孢鐮刀菌，F(xiàn)O-RBPl則特異性更差。
[0027]由以上檢測結(jié)果可得知，本發(fā)明的擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)。
【權(quán)利要求】
1.植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定的引物，其特征在于， 上游引物序列:5’-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3’ ； 下游引物序列:5’ -GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3’。
2.植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)合成以下引物， 上游引物序列:5’-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3’ ； 下游引物序列:5’-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3’ ； (2)制備土傳病害真菌的DNA稀釋液； (3)配制PCR反應(yīng)體系； (4)常規(guī)PCR檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定方法，其特征在于，步驟(1)中合成的引物的濃度均為10Mmol/l，步驟(2)中制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定方法，其特征在于，步驟(3)中所述的配制PCR反應(yīng)體系，包括以下組分: Taq MixΙΟμΙ上游引物2μ1下游引物2μ1DNA稀釋液?μ?ddH205μ1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑒定方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C終止 lOmin。
【文檔編號】C12N15/11GK104450951SQ201510017831
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2015年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月14日
【發(fā)明者】伍文憲, 劉勇, 張蕾, 黃小琴, 尹全, 劉紅雨, 宋君, 王東, 周西全 申請人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 劉勇