用于檢測(cè)人類egfr基因突變的引物、探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物、探針及試劑盒。本發(fā)明的探針和引物共有7組，其可以準(zhǔn)確檢測(cè)人類EGFR基因上的29種常見突變。采用本發(fā)明引物和探針的試劑盒，其靈敏度高，在20ng野生型人類基因組的背景下可以檢出1％的微量突變模板，減少了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。另外，所述試劑盒操作簡便，可控性強(qiáng)，可進(jìn)行大批量樣品的檢測(cè)，有利于臨床操作。
【專利說明】用于檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物、探針及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[OOOU 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物、 探針及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[000引 人類表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR)基因位于人 類7號(hào)染色體短臂7pl2?14區(qū)，由28個(gè)外顯子組成，該蛋白屬于受體酪氨酸激酶（TKI) 家族，存在于所有正常上皮和部分間葉來源的細(xì)胞。EGFR可W激活酪氨酸激酶，從而打開下 游信號(hào)通路最終介導(dǎo)細(xì)胞分化、生存、遷移、侵襲、黏附和細(xì)胞損傷修復(fù)等一系列過程，在 腫瘤惡性生長中發(fā)揮重要作用。因此，EGFR成為腫瘤祀向治療研究的一個(gè)重要祀點(diǎn)。
[000引 目前，臨床上EGFR的祀向治療主要基于小分子酪氨酸激酶抑制劑巧GFR-TU)和 單克隆抗體兩種機(jī)制。其中，基于EGFR-TKI機(jī)制的吉非替巧（Gefitinib，商品名易瑞沙） 和厄洛替巧巧rlotin化，商品名特羅凱），是目前腫瘤患者最有效的祀向藥物。但該些祀向 藥物并非對(duì)所有患者有效，EGFR敏感突變是藥物有效的前提。臨床研究結(jié)果表明，吉非替 巧對(duì)EGFR外顯子18、19或21發(fā)生突變的患者，有效率可達(dá)80%，而對(duì)野生型患者基本無 效。此外，研究表明部分EGFR-TKI類藥物初始治療有效的患者在后期會(huì)發(fā)生耐藥反應(yīng)，該 與EGFR20號(hào)外顯子的突變密切相關(guān)，其中50%的EGFR-TKI耐藥由外顯子20的T790M點(diǎn)突 變所致。
[0004]文獻(xiàn)報(bào)道（Chan SK，et al，Eur J Cancer, 2006,42(1) ; 17-23)，EGFR 基因的酪氨 酸激酶區(qū)存在多種突變，其中29種為常見突變（見表1)，主要集中在外顯子18-21上，其中 約90%存在于外顯子19和21上，包括外顯子19上747-750位氨基酸之間的19種常見缺 失突變約占突變的45%;外顯子21上的L858點(diǎn)突變約占突變的40-45%，該些位點(diǎn)也是中 國人EGFR基因的熱點(diǎn)突變（韓宇等，中華腫瘤學(xué)雜志，2007,29(4) ;278-282 ;郭健等，中國 肺癌雜志，2007，10化）；504-507)。
[000引由于EGFR-TKI類的祀向藥物的價(jià)格昂貴，如果病人不攜帶EGFR突變而服用此類 藥物，不僅耽誤病情還造成巨額藥費(fèi)的浪費(fèi)。因此，在用藥前篩查腫瘤患者是否攜帶EGFR 突變顯得尤為重要，也是未來腫瘤個(gè)體化治療的發(fā)展方向。
[0006] 目前，檢測(cè)腫瘤組織中的EGFR突變的方法很多，其中，國內(nèi)外主要采用的是基因 測(cè)序技術(shù)。該法費(fèi)用較低，但操作耗時(shí)長，并且它有兩個(gè)明顯的缺點(diǎn)；一是靈敏度低，一般需 要突變基因豐度達(dá)到10% W上才能準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)于低于10%的樣品出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。二 是由于后續(xù)需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，容易出現(xiàn)污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。
[0007] 因此，臨床迫切需要開發(fā)一種快速準(zhǔn)確、操作簡便、靈敏度高和避免交叉污染的檢 測(cè)EGFR基因突變的試劑盒，滿足臨床用藥和檢測(cè)診斷的時(shí)效性要求。
[0008] 突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractoiy mutation system,ARM巧也叫等 位基因特異性PCR,該法是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而成的，是一種直接用于點(diǎn)突變分析的PCR技 術(shù)。由于PCR過程中引物延伸是3'端開始的，所W 3'末端的堿基對(duì)引物的延伸來說處于至 關(guān)重要的位置。根據(jù)該個(gè)原理，將突變與正常等位基因所不同的那個(gè)堿基安排在引物3'最 末端，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，如果引物3'末端堿基與模板DNA序列匹配則可W擴(kuò)增，如果不匹配， 則鏈延伸反應(yīng)就會(huì)因3'，5' -磯酸二醋鍵形成障礙而受阻，從而達(dá)到區(qū)分檢測(cè)等位基因的 目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物及探針，其包 含下列7組引物和探針中的任意一組或多組，具體為：
[0010] (1)正向引物；5，一CAAAAAGATCAAAGTGCTGAC-3，
[001U 正向引物；5 ' 一 CAAAAAGATCAAAGTGCTGA- 3，
[0012]正向引物；5，一 CAAAAAGATCAAAGTGCCGT- 3 '
[001 引 反向引物；5' 一ACAGCTTGCAAGGACTCTGG-3，
[0014]探針；5' 一FAM/CCGGTGCGTTCGGCACGGTGTAT/B冊(cè) 1-3,；
[00巧](2)正向引物；5' 一CACTGGGCAGCATGTGGC-3，
[0016] 反向引物；5 ' 一 CAGCTGCCAGACATGAGAAA- 3，
[0017] 探針；5' 一FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/B冊(cè) 1-3，
[001引阻斷核酸序列：
[0019] 5' 一CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-P04-3' ；
[0020] (3)正向引物；5' 一CAGCGTGGCCAGCGTG-3，
[002U 正向引物；5 ' 一 TGATGGCCAGCGTGGACG- 3，
[0022] 正向引物；5，一TGATGGCCAGCGTGGACG-3，
[0023] 反向引物；5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC-3，
[0024] 探針；5，一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/B冊(cè) 1-3,；
[00巧](4)正向引物；5' 一GGAAGCCTACGTGATGGCCAT-3，
[0026] 反向引物；5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC-3，
[0027] 探針；5，一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/B冊(cè) 1-3,；
[0028] (5)正向引物；5' 一CTCCACCGTGCAGCTCATCAT-3，
[0029] 反向引物；5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC-3，
[0030] 探針；5，一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/B冊(cè) 1-3,；
[0031] (6)正向引物；5' 一GTCAAGATCACAGATTTTGGGCG-3，
[0032] 反向引物；5' 一AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG-3，
[0033] 探針；5，一FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/B冊(cè) 1-3,；
[0034] (7)正向引物；5' 一GATTTTGGGCTGGCCAAACA-3，
[00巧]反向引物；5' 一AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG-3，
[0036] 探針；5，一FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/B冊(cè) 1-3，。
[0037] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒，其由上述引物和探 針、PCR混合反應(yīng)液、1對(duì)質(zhì)控引物、探針和內(nèi)控系統(tǒng)組成。
[003引在本發(fā)明進(jìn)一步地實(shí)施方案中，所述PCR混合反應(yīng)液包括；雙組分熱啟動(dòng)DNA聚 合酶（化學(xué)修飾的化tStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶）、PCR Buffer、dNTPs、PCR增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑、UNG酶等。
[0039] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種用于檢測(cè)EGFR基因19號(hào)外顯子的19種缺失突變的 引物和探針，即化qman探針結(jié)合阻斷核酸序列的real-time PCR技術(shù)，所述引物和探針為：
[0040] 正向引物；5' 一CACTGGGCAGCATGTGGC-3，
[004U 反向引物；5 ' 一 CAGCTGCCAGACATGAGAAA- 3，
[0042] 探針；5，一FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/B冊(cè) 1-3，
[0043] 阻斷核酸序列；5，一CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-P04-3，。
[0044] 在本發(fā)明進(jìn)一步地實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種包含上述引物和探針的用于檢 巧。EGFR基因19號(hào)外顯子的19種缺失突變的試劑盒，其由上述引物和探針、PCR混合反應(yīng) 液、1對(duì)質(zhì)控引物、探針和內(nèi)控系統(tǒng)組成。
[0045] 本發(fā)明利用一對(duì)通用引物對(duì)EGFR基因19號(hào)外顯子缺失突變區(qū)域序列進(jìn)行特異性 擴(kuò)增，同時(shí)利用阻斷核酸序列與待測(cè)樣品中野生型DNA模板的特異結(jié)合，抑制該野生型DNA 模板與引物探針的結(jié)合，僅實(shí)現(xiàn)缺失突變的特異性擴(kuò)增，從而達(dá)到一次檢測(cè)反應(yīng)可檢出19 種缺失突變的一種或幾種突變的效果。
[0046] 上述發(fā)明均可使各位點(diǎn)的檢測(cè)靈敏度達(dá)到1%。
[0047] 本發(fā)明與現(xiàn)有的測(cè)序技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)：
[0048] (1)靈敏度更高，在20ng野生型人類基因組的背景下可W檢出1%的微量突變模 板，減少了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。
[0049] (2)全封閉反應(yīng)，無需PCR產(chǎn)物后處理，避免了 PCR產(chǎn)物的污染，減少了假陽性結(jié)果 的出現(xiàn)，且避免了 PCR反應(yīng)液對(duì)操作員和環(huán)境的危害。
[0050] (3)檢測(cè)速度快，從標(biāo)本送檢到出結(jié)果可在3個(gè)小時(shí)W內(nèi)即可完成。
[0051] (4)結(jié)果判讀明確、客觀；若需要亦可對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。
[0化2] (5)操作簡便，可控性強(qiáng)，可進(jìn)行大批量樣品的檢測(cè)，有利于臨床操作。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0化3] 圖1本發(fā)明試劑盒對(duì)E746-A750del (2)突變型石蠟樣本檢測(cè)結(jié)果（突變檢測(cè)管和 質(zhì)控管FAM信號(hào)），突變檢測(cè)管CT值23. 27,質(zhì)控管CT值16. 78。
[0化4] 圖2本發(fā)明試劑盒對(duì)E746-A750del (2)突變型石蠟樣本檢測(cè)結(jié)果（其余6管與質(zhì) 控管FAM信號(hào)），其余6管CT值none,質(zhì)控管CT值16. 78。
[0化5] 圖3本發(fā)明試劑盒對(duì)E746-A750del (2)突變型石蠟樣本檢測(cè)結(jié)果（突變檢測(cè)管 肥X信號(hào)（內(nèi)控）），突變檢測(cè)管肥X信號(hào)的CT值18. 13,其余6管肥X信號(hào)與此結(jié)果幾乎一 致。
[0化6] 圖4E746-A750del (2)突變型石蠟樣本的測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果。 具體實(shí)施方案
[0057] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，W下結(jié)合 附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用 W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0化引本發(fā)明共包含8個(gè)PCR反應(yīng)，將EGFR的4個(gè)外顯子的29種突變分為7管進(jìn)行檢 ，其中18號(hào)外顯子的3種點(diǎn)突變?cè)谝还苤袡z測(cè)，19號(hào)外顯子的19種缺失突變?cè)谝还苤袡z 巧Ij，20號(hào)外顯子的3種插入突變?cè)谝还苤袡z測(cè)，20號(hào)外顯子的S768I和T790M各自一管進(jìn) 行檢測(cè)，21號(hào)外顯子的L858R和L861Q各自一管進(jìn)行檢測(cè)。第8管為質(zhì)控反應(yīng)管。
[0化9] 本發(fā)明除19號(hào)外顯子中含有一條阻滯核酸序列外，7個(gè)反應(yīng)管中均包含PCR混合 反應(yīng)液 SuperReal PreMix(Probe)，包括雙組分熱啟動(dòng) DNA 聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、PCR 增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑、UNG酶等，另外，特異性上下游引物、特異性化qMan探針、內(nèi)控上下游引物， 內(nèi)控^gMan探針等組分。
[0060] 實(shí)施例1本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的臨床應(yīng)用
[0061] 1、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建；本發(fā)明構(gòu)建了 EGFR基因29種突變型和野生型的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn) 品，作為陽性質(zhì)控，并用于前期PCR體系的構(gòu)建。
[006引 2、配制PCR反應(yīng)體系；
[0063] 各反應(yīng)管組分含量及終濃度如下：
[0064] 7支突變檢測(cè)管； 「00 化 1

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物及探針，其包含下列7組引物和探針中的任 意一組或多組，具體為： (1) 正向引物：5' 一CAAAAAGATCAAAGTGCTGAC-3' 正向引物：5 ' 一CAAAAAGATCAAAGTGCTGA- 3 ' 正向引物：5 ' 一CAAAAAGATCAAAGTGCCGT- 3 ' 反向引物：5' 一ACAGCTTGCAAGGACTCTGG- 3' 探針：5' 一FAM/CCGGTGCGTTCGGCACGGTGTAT/BHQ1-3' ； (2) 正向引物：5' 一CACTGGGCAGCATGTGGC- 3' 反向引物：5 '一CAGCTGCCAGACATGAGAAA- 3 ' 探針：5' 一FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/BHQ1-3' 阻斷核酸序列： 5' 一CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-P04-3' ； (3) 正向引物：5'一CAGCGTGGCCAGCGTG- 3' 正向引物：5 ' 一TGATGGCCAGCGTGGACG- 3 ' 正向引物：5 ' 一TGATGGCCAGCGTGGACG- 3 ' 反向引物：5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC- 3' 探針：5' 一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1-3' ； (4) 正向引物：5'一GGAAGCCTACGTGATGGCCAT- 3' 反向引物：5'一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC- 3' 探針：5' 一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1-3' ； (5) 正向引物：5' 一CTCCACCGTGCAGCTCATCAT- 3' 反向引物：5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC- 3' 探針：5' 一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1-3' ； (6) 正向引物：5' 一GTCAAGATCACAGAmTGGGCG- 3' 反向引物：5' 一AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG- 3' 探針：5' 一FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/BHQ1-3' ； (7) 正向引物：5' 一GAmTGGGCTGGCCAAACA- 3' 反向引物：5' 一AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG- 3' 探針：5 ' 一FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/BHQ1-3 '。
2. -種EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒，其由權(quán)利要求1所述的引物和探針、PCR混合反應(yīng) 液、1對(duì)質(zhì)控引物、探針和內(nèi)控系統(tǒng)組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR混合反應(yīng) 液包括：雙組分熱啟動(dòng)DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTPs、PCR增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑、UNG酶。
4. 一種用于檢測(cè)EGFR基因19號(hào)外顯子的19種缺失突變的引物和探針，所述引物和探 針為： 正向引物：5 ' 一CACTGGGCAGCATGTGGC- 3 ' 反向引物：5 ' 一CAGCTGCCAGACATGAGAAA- 3 ' 探針：5' 一FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/BHQ1-3' 阻斷核酸序列：5'一CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-P04-3'。
5. -種用于檢測(cè)EGFR基因19號(hào)外顯子的19種缺失突變的試劑盒，其由權(quán)利要求4所 述的引物和探針、PCR混合反應(yīng)液、1對(duì)質(zhì)控引物、探針和內(nèi)控系統(tǒng)組成。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104513864SQ201510031716
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2015年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月21日
【發(fā)明者】陳英, 孫秀蓮, 王春苗, 孫利, 李欣 申請(qǐng)人:山東維真生物科技有限公司