專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法
一種檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物中檢測(cè)細(xì)胞活性方法的技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法。
背景技術(shù)：
黃連(Coptis Chinensis Franch)是一味常用中藥,黃連中主要含有的生物堿有小檗堿、黃連堿、藥根堿、巴馬汀等。近年來(lái)研究表明，小檗堿、黃連堿等具有一定的抗腫瘤作用，可抑制和殺傷多種癌細(xì)胞，如肝癌H印G2細(xì)胞、肺癌GLC-82細(xì)胞、胃癌MGC-803細(xì)胞等。尋找具有抗腫瘤活性的中藥單體受到越來(lái)越多的關(guān)注，評(píng)價(jià)各種中藥單體是否具有滅殺腫瘤細(xì)胞的作用，則要依靠對(duì)其抗腫瘤活性的檢測(cè)來(lái)判斷。目前，這種在體外檢測(cè)中藥單體抗腫瘤實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)的斷點(diǎn)檢測(cè)方法為主，如MTT法、熒光染色法、3H-Tdr (3H-Thymidine, 三氫胸腺嘧啶核苷)摻入法等。這些方法以給藥前后細(xì)胞增殖和存活能力變化作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，需要進(jìn)行特定的標(biāo)記和處理，操作繁瑣，靈敏性較差且只能局限于特定時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察，無(wú)法得到藥物作用的直觀(guān)動(dòng)態(tài)過(guò)程。發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)黃連生物堿單體抗腫瘤活性的方法，該方法可實(shí)時(shí)反映給藥前后的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷的生長(zhǎng)、伸展、形態(tài)變化、死亡生理狀態(tài)，具有高度的靈敏性和可重復(fù)性，無(wú)需標(biāo)記，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、精確。
實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案是，本發(fā)明設(shè)計(jì)的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤作用的方法，包括以下步驟，(I)分別制備不同濃度的腫瘤細(xì)胞懸液、黃連生物堿單體藥液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃度腫瘤細(xì)胞懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定檢測(cè)黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞作用時(shí)，所使用的腫瘤細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加藥液的最佳`給藥時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)給藥前后的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值判斷藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。
所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2 的體積濃度為5%，溫度為37°C 設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀未有腫瘤細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)分別將100 μ I 不同細(xì)胞濃度的腫瘤細(xì)胞懸液加入每個(gè)檢測(cè)板板孔中的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/5min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀有腫瘤細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)分析比較不同濃度腫瘤懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，選擇腫瘤細(xì)胞加入到腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液后最快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且當(dāng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)時(shí)間到IOOh時(shí)腫瘤細(xì)胞仍能處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所對(duì)應(yīng)的腫瘤細(xì)胞懸液細(xì)胞濃度，即為用于確定檢測(cè)黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞作用時(shí)，所使用的腫瘤細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度；⑤分析④步確定的最佳細(xì)胞濃度的腫瘤懸液所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，即為添加黃連生物`堿單體藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)。步驟④分析比較不同濃度腫瘤懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)時(shí)，不同濃度腫瘤懸液的腫瘤細(xì)胞濃度為2X104、4X104、5X104、8X104的細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)做分析比較，上述腫瘤細(xì)胞濃度的單位為個(gè)/ml。步驟④確定的用于檢測(cè)黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的腫瘤細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度為4X IO4個(gè)/ml。確定用于實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)時(shí)的細(xì)胞懸液濃度依據(jù)是細(xì)胞添加到培養(yǎng)液中能較快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)結(jié)束時(shí)細(xì)胞仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。依據(jù)腫瘤細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期作為判斷細(xì)胞懸浮液濃度指標(biāo)的原因是，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是細(xì)胞活力最好時(shí)期，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)期，細(xì)胞濃度過(guò)小則細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的潛伏期才能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，導(dǎo)致試驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)；細(xì)胞濃度過(guò)大則營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快，且細(xì)胞易粘連、疊加，則細(xì)胞很快經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并開(kāi)始脫落、死亡。在選擇用于檢測(cè)的最佳細(xì)胞濃度時(shí)，一般選擇腫瘤細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1/3 2/3細(xì)胞的生長(zhǎng)率顯著增高的時(shí)段，同時(shí)為了方便后續(xù)不同濃度黃連生物堿單體藥液添加到腫瘤細(xì)胞懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)好擬合對(duì)t匕，綜合考察，一般細(xì)胞指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，為最佳的給藥時(shí)間。所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)未有腫瘤細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)將步驟(2)確定的最佳細(xì)胞濃度的腫瘤細(xì)胞懸液100 μ I加入到每個(gè)檢測(cè)板板孔的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)培養(yǎng)液中腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；③待細(xì)胞生長(zhǎng)到步驟(2)確定的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)時(shí)，吸棄檢測(cè)板板孔中的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，再向每個(gè)板孔中加入200 μ I不同濃度的黃連生物堿單體藥液，另設(shè)置2個(gè)板孔，添加200 μ I腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，即為空白對(duì)照板孔設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/min，細(xì)胞實(shí)時(shí)分析儀監(jiān)測(cè)黃連生物堿單體藥液中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。步驟①中基準(zhǔn)的測(cè)定是為了扣除細(xì)胞培養(yǎng)液本身所帶電荷可·能產(chǎn)生的背景數(shù)值，有效保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。本發(fā)明中的黃連生物堿單體藥液的配制方法是，黃連生物堿單體用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液超聲溶解10 20min，再用孔徑為0.2 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌得到母液，用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液將母液稀釋?zhuān)玫讲煌瑵舛鹊狞S連生物堿單體藥液。利用培養(yǎng)液作為黃連生物堿單體的溶劑，防止其它化學(xué)試劑破壞細(xì)胞的黏性、彈性，避免了細(xì)胞破裂、聚堆不好觀(guān)察現(xiàn)象的發(fā)生。上述的黃連生物堿單體為小檗堿、巴馬汀或非洲防己堿、黃連堿、藥根堿或表小檗堿。本發(fā)明檢測(cè)黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，采用的是DP型實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀。DP型號(hào)是羅氏公司推出的最新型號(hào)的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀，新的DP型實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀利用無(wú)標(biāo)記、非侵入性電極阻抗測(cè)量得出細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，提供了實(shí)時(shí)的細(xì)胞分析，并對(duì)平行進(jìn)行短期和長(zhǎng)期的分析研究者來(lái)說(shuō)具有高度的靈活性，DP型的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板共3塊16個(gè)孔板，可由三個(gè)不同的用戶(hù)同時(shí)操作，由于其體積小，檢測(cè)板可放入標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)箱中，輕松實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的培養(yǎng)的條件。
本發(fā)明檢測(cè)黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，具體的是對(duì)肝癌IfepG2細(xì)胞做進(jìn)行的檢測(cè)。綜上，本發(fā)明利用實(shí)時(shí)細(xì)胞儀檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法有益效果是，1、在本發(fā)明中所使用的方法能夠?qū)⑺幬飳?duì)細(xì)胞作用的全過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)，無(wú)需標(biāo)記、靈敏專(zhuān)屬、而且能節(jié)約大量的人力物力；
2、通過(guò)對(duì)不同濃度細(xì)胞懸液中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)比不同濃度下的腫瘤細(xì)胞增殖曲線(xiàn)，能夠篩選出檢測(cè)時(shí)所使用的腫瘤細(xì)胞的最佳濃度和給藥時(shí)間；
3、對(duì)本發(fā)明方法所得到的圖譜及數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，能夠得到各種生物堿單體、不同濃度的一個(gè)生物堿單體滅殺腫瘤細(xì)胞數(shù)值一半的時(shí)間，進(jìn)而得到各種單體、不同濃度一個(gè)生物堿單體的作用強(qiáng)弱順序；
4、通過(guò)對(duì)比不同藥物的圖譜之間的差異也能對(duì)其作用機(jī)制研究提供支持；
5、本發(fā)明的技術(shù)方案具有定性定量、簡(jiǎn)便快捷、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)的不同濃度小檗堿藥液中肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值譜圖，該譜圖以時(shí)間橫軸，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)Cl值為縱軸；
圖2為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)的不同濃度黃連堿藥液中肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值譜圖，該譜圖以時(shí)間橫軸，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)Cl值為縱軸；
圖3為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)的不同濃度巴馬汀藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值譜圖，該譜圖以時(shí)間橫軸，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)Cl值為縱軸； 其中，曲線(xiàn)I為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)小檗堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2的作用情況時(shí)，設(shè)置的空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)；
曲線(xiàn)2為質(zhì)量濃度250ug/ml的小檗堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)3為質(zhì)量濃度120ug/ml的小檗堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)4為質(zhì)量濃度85ug/ml的小檗堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)5為質(zhì)量濃度65ug/ml的小檗堿藥液中肝癌細(xì)胞ItepG2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)6為質(zhì)量濃度55ug/ml的小檗堿藥液中肝癌細(xì)胞IfepG2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)7為質(zhì)量濃度45ug/ml的小檗堿藥液中肝癌細(xì)胞IfepG2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)8為質(zhì)量濃度40ug/ml的小檗堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)9為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)黃連堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的作用情況時(shí)，設(shè)置的空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)；
曲線(xiàn)10為質(zhì)量濃度60ug/ml的黃連堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)11為質(zhì)量濃度50ug/ml的黃連堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)12為質(zhì)量濃度40ug/ml的黃連堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)13為質(zhì)量濃度30ug/ml的黃連堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)14為質(zhì)量濃度20ug/ml的黃連堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)15為質(zhì)量濃度10ug/ml的黃連堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)16為質(zhì)量濃度5ug/ml的黃連堿藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線(xiàn)17為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)巴馬汀藥液對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2的作用情況時(shí)，設(shè)置的空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)；曲線(xiàn)18為質(zhì)量濃度500ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；曲線(xiàn)19為質(zhì)量濃度450ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；曲線(xiàn)20為質(zhì)量濃度400ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；曲線(xiàn)21為質(zhì)量濃度350ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；曲線(xiàn)22為質(zhì)量濃度300ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；曲線(xiàn)24為質(zhì)量濃度200ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明發(fā)明內(nèi)容。
實(shí)施例一:本發(fā)明利用實(shí)時(shí)細(xì)胞儀檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法， 腫瘤細(xì)胞具體的為肝癌細(xì)胞IfepG2;黃連生物單堿體常見(jiàn)的有小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿、黃連堿、藥根堿、表小檗堿，本發(fā)明方法可同時(shí)對(duì)不同濃度、各種生物堿單體對(duì)肝癌細(xì)胞 H印G2的作用進(jìn)行監(jiān)測(cè)，實(shí)施例一列舉的是對(duì)于不同濃度的小檗堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 的作用情況，本實(shí)施例中用到的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀均是DP型實(shí)施細(xì)胞分析儀。
1、試驗(yàn)中所用到的儀器:RTCA DP (德國(guó)Roche公司)；E_Plate 16檢測(cè)板(6x6 plates,德國(guó)Roche公司);恒溫培養(yǎng)箱(5410型，美國(guó)Napco公司);冷凍離心機(jī)(HC-3018R 型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);電子天平(AL-204型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);吉爾森移液器(P100型、PlOOO型，法國(guó)GILSON公司);微孔濾膜(0.20 ym，美國(guó) Millipore 公司);培養(yǎng)瓶(25cm、75cm,美國(guó) Corning 公司);離心管(2mL、5mL、IOmL>5OmL,美國(guó)Corning公司)。
2、供試藥液:小檗堿(純度均大于98%)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；3、檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法步驟為，(I)分別制備不同濃度的肝癌細(xì)胞HepG2懸液、小檗堿藥液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃度肝癌細(xì)胞HepG2懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定檢測(cè)小檗堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2作用時(shí)，所使用的肝癌細(xì)胞HepG2懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)給藥前后的肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值判斷藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。
步驟(I)中制備不同濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液時(shí)，利用現(xiàn)有的方法對(duì)肝癌H印G2 細(xì)胞培養(yǎng)，肝癌細(xì)胞株H印G2用的培養(yǎng)液是含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用體積濃度為5%C02，溫度為37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備腫瘤細(xì)胞懸液的具體步驟為選取在!fepG2 細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶-EDTA消化，加入 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化、吹打初步得到細(xì)胞懸液，再轉(zhuǎn)移至離心管離心5min，離心后加入H印G2細(xì)胞培養(yǎng)液并吹勻，此時(shí)得到的H印G2細(xì)胞懸液中的細(xì)胞呈分散的單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。 根據(jù)加入的ifepG2細(xì)胞培養(yǎng)液的量，分別制備肝癌細(xì)胞H印G2濃度為5 X 103、5 X 104、2 X 10- 4、4Χ104、8Χ104、1.6Χ105、3.2Χ105、6.4Χ IO5 個(gè)/ml 的肝癌細(xì)胞 H印G2 懸液。
上述步驟(I)中制備不同濃度的小檗堿藥液的具體操作步驟是:精密稱(chēng)取小檗堿粉末，加入腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，超聲溶解15 min，用0.20 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌得到含250 μ g/ml小檗堿母液，取母液，用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液依次稀釋成以下6個(gè)濃度:120、85、65、55、45、40 μ g/ml，本步驟所用的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液就是肝癌細(xì)胞株HepG2的培養(yǎng)液。
所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C 設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀未有肝癌細(xì)胞H印G2時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)分別將100 μ I不同細(xì)胞濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液加入每個(gè)檢測(cè)板板孔中的肝癌細(xì)胞 H印G2培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/5min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀有肝癌細(xì)胞H印G2 時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)分析比較不同濃度肝癌細(xì)胞HepG2懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，選擇肝癌細(xì)胞H印G2加入到肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液后最快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 且當(dāng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)時(shí)間到IOOh時(shí)腫瘤細(xì)胞仍能處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所對(duì)應(yīng)的肝癌細(xì)胞 HepG2懸液細(xì)胞濃度，即為用于確定檢測(cè)小檗堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2作用時(shí)，所使用的肝癌細(xì)胞H印G2懸液的最佳細(xì)胞濃度； 分析④步確定的最佳細(xì)胞濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，即為添加小檗堿藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)。
根據(jù)步驟(2)的方法，經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)表明，用于確定檢測(cè)小檗堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞 HepG2作用時(shí)，所使用的肝癌細(xì)胞IfepG2懸液的最佳細(xì)胞濃度一般在2 X IO4 8 X IO4個(gè)/ ml范圍內(nèi)選取，最佳的細(xì)胞濃度為4X IO4個(gè)/ml，最佳給藥時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞在肝癌細(xì)胞HepG2 培養(yǎng)液生長(zhǎng)24h時(shí)。
所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)未有肝癌細(xì)胞H印G2時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)；②將步驟(2)確定的最佳細(xì)胞濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液100 μ I加入到每個(gè)檢測(cè)板板孔的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)培養(yǎng)液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；③待細(xì)胞生長(zhǎng)到步驟(2)確定的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)時(shí)， 吸棄檢測(cè)板板孔中的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，再向每個(gè)板孔中加入200μ I不同濃度的小檗堿，另設(shè)置2個(gè)板孔，添加200 μ I肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，即為空白對(duì)照板孔；④設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/min，細(xì)胞實(shí)時(shí)分析儀監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞在小檗堿藥液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。
本發(fā)明選用的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀，實(shí)際上就是一種細(xì)胞實(shí)時(shí)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)技術(shù)，是近年研制成功的一種建立在阻抗基礎(chǔ)上的瞬時(shí)細(xì)胞電感應(yīng)連續(xù)記錄系統(tǒng)，這種分析儀器的核心是把微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞貼附與生長(zhǎng)的細(xì)胞檢測(cè)板的底部。微電子芯片測(cè)定的電阻抗反映了細(xì)胞生長(zhǎng)、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態(tài)。 通過(guò)檢測(cè)板板孔底下的微陣列的電極設(shè)計(jì)，該技術(shù)能全面實(shí)時(shí)的監(jiān)控細(xì)胞群落的變化，并具有高度的靈敏性性和可重復(fù)性，無(wú)需標(biāo)記，其檢測(cè)結(jié)果被證明與其他傳統(tǒng)分析得到結(jié)果 —致。
向檢測(cè)板的板孔中加入黃連生物堿單體藥液和腫瘤細(xì)胞懸液，檢測(cè)板底部的微陣列電極會(huì)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)的電極阻抗，根據(jù)電極阻抗機(jī)器內(nèi)部通過(guò)計(jì)算公式計(jì)算細(xì)胞生 長(zhǎng)指數(shù)值，直接在生成的細(xì)胞生長(zhǎng)圖譜上顯示出來(lái)，所用到的計(jì)算公式如下:Cl= ma>: —§—■ -1 %6j) _
其中，i為信號(hào)采樣頻率數(shù)，Rrell(fi)的檢測(cè)板板孔中腫瘤細(xì)胞接種到藥液后的電極阻抗，Rb (A)是檢測(cè)板板孔中未有腫瘤細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的電極阻抗，也作為基準(zhǔn)阻抗，Cl是細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值。在沒(méi)有腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液中，檢測(cè)板孔底部排列的微電極陣列的阻抗分布近似均勻，我們所檢測(cè)到的基準(zhǔn)電極阻抗為零，Cl值為零。當(dāng)檢測(cè)板板孔中是腫瘤細(xì)胞接種到藥液中時(shí)，細(xì)胞接觸板孔的電極表面開(kāi)始貼附、生長(zhǎng)，電極阻抗值升高，DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀系統(tǒng)所響應(yīng)的Cl值開(kāi)始增加；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋度達(dá)到100%后，由于板孔面積的局限、細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等有限及細(xì)胞間的相互接觸抑制，或者對(duì)細(xì)胞給予一定藥物刺激后，細(xì)胞開(kāi)始死亡，電極阻抗開(kāi)始減小，DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀系統(tǒng)所響應(yīng)的Cl值也開(kāi)始減小，如果時(shí)間足夠長(zhǎng)，細(xì)胞將全部死亡，阻抗值不斷減小直至為零，DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀所響應(yīng)的Cl值也將減小至零，所以，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值判斷黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用情況時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值越小，說(shuō)明作用越強(qiáng)。如圖1所示的在250、120、86、65、55、45、40 μ g/ml六個(gè)濃度下小檗堿藥液對(duì)HepG2細(xì)胞作用的情況，可以看出前期未用藥時(shí)細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，用藥后藥液的濃度越高，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值越小，因此對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用越強(qiáng)。實(shí)施例二:本實(shí)施例列舉的是不同濃度下黃連堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞IfepG2的作用情況，所用的試驗(yàn)儀器同實(shí)施例一，黃連堿對(duì)照品(純度大于98%)，購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司。檢測(cè)不同濃度下黃連堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2作用的方法步驟為，(I)分別制備不同濃度的肝癌細(xì)胞HepG2懸液、黃連堿藥液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃度肝癌細(xì)胞H印G2懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定檢測(cè)黃連堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2作用時(shí)，所使用的肝癌細(xì)胞HepG2懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)給藥前后的肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值判斷藥液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的作用。步驟(I)中制備不同濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液時(shí)，利用現(xiàn)有的方法對(duì)肝癌H印G2細(xì)胞培養(yǎng)，肝癌細(xì)胞株HepG2用的培養(yǎng)液是含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，用體積濃度為5%C02，溫度為37 °C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備腫瘤細(xì)胞懸液的具體步驟為選取在!fepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶-EDTA消化，加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化、吹打初步得到細(xì)胞懸液，再轉(zhuǎn)移至離心管離心5min，離心后加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液并吹勻，此時(shí)得到的HepG2細(xì)胞懸液中的細(xì)胞呈分散的單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。根據(jù)加入的ifepG2細(xì)胞培養(yǎng)液的量，分別制備腫瘤細(xì)胞濃度為5X103、5X104、2X104、4X 104、8Χ 104、1.6X 105、3.2Χ 105、6.4Χ IO5 個(gè) /ml 的腫瘤細(xì)胞懸液。上述步驟(I)中制備不同濃度的黃連堿藥液的具體操作步驟是:精密稱(chēng)取黃連堿粉末，加入肝癌H印 G2細(xì)胞培養(yǎng)液中，超聲溶解15 !1^11，用0.20 ym微孔濾膜過(guò)濾除菌得到含100 μ g/ml黃連堿母液，取母液，用肝癌IfepG2細(xì)胞培培養(yǎng)液依次稀釋成以下7個(gè)濃度:60、50、40、30、20、10、5 μ g/ml。
所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C 設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀未有肝癌細(xì)胞H印G2時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)分別將100 μ I不同細(xì)胞濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液加入每個(gè)檢測(cè)板板孔中的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/5min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀有肝癌細(xì)胞H印G2時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)分析比較不同濃度肝癌細(xì)胞H印G2懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，選擇肝癌細(xì)胞HepG2加入到肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)液后最快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且當(dāng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)時(shí)間到IOOh時(shí)肝癌細(xì)胞H印G2仍能處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所對(duì)應(yīng)的肝癌細(xì)胞 HepG2懸液細(xì)胞濃度，即為用于確定檢測(cè)黃連堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2作用時(shí)，所使用的肝癌細(xì)胞H印G2懸液的最佳細(xì)胞濃度； 分析④步確定的最佳細(xì)胞濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，即為添加黃連堿藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)。
根據(jù)步驟(2)的方法，經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)表明，用于確定檢測(cè)黃連堿藥液對(duì)肝癌細(xì)胞 HepG2作用時(shí)，所使用的肝癌細(xì)胞IfepG2懸液的細(xì)胞濃度一般在2 X IO4 8 X IO4個(gè)/ml均可，最佳的細(xì)胞濃度為4X IO4個(gè)/ml，最佳給藥時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞在肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)液生長(zhǎng) 24h 時(shí)。
所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)未有肝癌細(xì)胞H印G2時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)；②將步驟(2)確定的最佳細(xì)胞濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液100 μ I加入到每個(gè)檢測(cè)板板孔的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)培養(yǎng)液中肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；③待細(xì)胞生長(zhǎng)到步驟(2)確定的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)時(shí)， 吸棄檢測(cè)板板孔中的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，再向每個(gè)板孔中加入200μ1不同濃度的黃連堿藥液，另設(shè)置2個(gè)板孔，添加200 μ I肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，即為空白對(duì)照板孔；④設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/min，細(xì)胞實(shí)時(shí)分析儀監(jiān)測(cè)黃連堿藥液中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。
監(jiān)測(cè)結(jié)束后，將結(jié)果倒入到實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀Softwarel.2.1中進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用 0rigin8.5作圖，得到黃連堿藥液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞作用的實(shí)時(shí)在線(xiàn)圖譜，見(jiàn)圖2。由圖中可知，前期細(xì)胞迅速生長(zhǎng)時(shí)期為未用藥的階段，曲線(xiàn)9 16為用藥后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
實(shí)施例三:本實(shí)施例列舉的是不同濃度下巴馬汀藥液對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2的作用情況，所用的試驗(yàn)儀器同實(shí)施例一，巴馬汀對(duì)照品(純度大于98%)，購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司。
檢測(cè)不同濃度下巴馬汀藥液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2作用的方法步驟為，(I)分別制備不同濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液、巴馬汀藥液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃巴馬汀懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定檢測(cè)巴馬汀藥液對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2作用時(shí)，所使用的肝癌細(xì)胞HepG2懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)給藥前后的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值判斷藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞 的作用。
步驟(I)中制備不同濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液時(shí)，利用現(xiàn)有的方法對(duì)肝癌H印G2細(xì)胞培養(yǎng)，肝癌細(xì)胞株HepG2用的培養(yǎng)液是含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，用體積濃度為5%C02，溫度為37 °C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備腫瘤細(xì)胞懸液的具體步驟為選取在!fepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶-EDTA消化，加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化、吹打初步得到細(xì)胞懸液，再轉(zhuǎn)移至離心管離心5min，離心后加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液并吹勻，此時(shí)得到的HepG2細(xì)胞懸液中的細(xì)胞呈分散的單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。根據(jù)加入的ifepG2細(xì)胞培養(yǎng)液的量，分別制備腫瘤細(xì)胞濃度為5X103、5X104、2X104、4X 104、8Χ 104、1.6X 105、3.2Χ 105、6.4Χ IO5 個(gè) /ml 的腫瘤細(xì)胞懸液。上述步驟(I)中制備不同濃度的巴馬汀藥液的具體操作步驟是:精密稱(chēng)取巴馬汀粉末，加入肝癌H印G2細(xì)胞培養(yǎng)液中，超聲溶解15 min，用0.20 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌得到含500 μ g/ml巴馬汀母液，取母液，用肝癌H印G2細(xì)胞培養(yǎng)液依次稀釋成以下6個(gè)濃度:450、400、350、300、250、200μ g/ml。所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C 設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀未有肝癌細(xì)胞H印G2時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)分別將100 μ I不同細(xì)胞濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液加入每個(gè)檢測(cè)板板孔中的肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/5min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀有肝癌細(xì)胞H印G2時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)分析比較不同濃度肝癌細(xì)胞H印G2懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，選擇肝癌細(xì)胞H印G2加入到肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液后最快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且當(dāng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)時(shí)間到IOOh時(shí)腫瘤細(xì)胞仍能處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所對(duì)應(yīng)的肝癌細(xì)胞HepG2懸液細(xì)胞濃度，即為用于確定檢測(cè)巴馬汀藥液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2作用時(shí)，所使用的肝癌細(xì)胞H印G2懸液的最佳細(xì)胞濃度； 分析④步確定的最佳細(xì)胞濃度的肝癌細(xì)胞H印G2懸液所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，即為添加巴馬汀藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)。

根據(jù)步驟(2)的方法，經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)表明，用于確定檢測(cè)巴馬汀藥液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2作用時(shí)，所使用的肝癌細(xì)胞IfepG2懸液的細(xì)胞濃度一般在2 X IO4 8 X IO4個(gè)/ml均可，最佳的細(xì)胞濃度為4X IO4個(gè)/ml，最佳給藥時(shí)間點(diǎn)為細(xì)胞在肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)液生長(zhǎng)24h 時(shí)。所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)未有肝癌細(xì)胞H印G2時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)；②將步驟(2)確定的最佳細(xì)胞濃度的肝癌細(xì)胞HepG2懸液100 μ I加入到每個(gè)檢測(cè)板板孔的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)培養(yǎng)液中肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；③待細(xì)胞生長(zhǎng)到步驟(2)確定的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)時(shí)，吸棄檢測(cè)板板孔中的肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，再向每個(gè)板孔中加入200 μ I不同濃度的巴馬汀藥液，另設(shè)置2個(gè)板孔，添加200 μ I肝癌細(xì)胞H印G2培養(yǎng)液，即為空白對(duì)照板孔；④設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/min，細(xì)胞實(shí)時(shí)分析儀監(jiān)測(cè)巴馬汀藥液中的肝癌細(xì)胞H印G2生長(zhǎng)指數(shù)。
監(jiān)測(cè)結(jié)束后，將結(jié)果倒入到實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀Softwarel.2.1中進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用0rigin8.5作圖，得到巴馬汀藥液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞作用的實(shí)時(shí)在線(xiàn)圖譜，見(jiàn)圖3。由圖中可知，肝癌細(xì)胞H印G2不斷生長(zhǎng)期時(shí)是未用藥的情況，曲線(xiàn)17 24為用藥后細(xì)胞受到藥的作用后的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)。利用DP型實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)非洲防己堿、藥根堿、表小檗堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞作用的方法同上述實(shí)施例，本發(fā)明的方法還可用于監(jiān)測(cè)同一濃度下、不同種類(lèi)的黃連生物堿單體對(duì)肝癌H印G2細(xì)胞作用，還可用于不同濃度、不同種類(lèi)的黃連生物堿單體對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞作用，以上僅為說(shuō)明發(fā)明內(nèi)容所列舉出的幾個(gè)實(shí)施例而已，一切基于本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容所做出成份、數(shù)量等·簡(jiǎn)單的變化，均應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟，(I)分別制備不同濃度的腫瘤細(xì)胞懸液、黃連生物堿單體藥液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃度腫瘤細(xì)胞懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定檢測(cè)黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞作用時(shí)，所使用的腫瘤細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)給藥前后的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值判斷藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入 100 μ I的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C 設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀未有腫瘤細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)分別將100 μ I不同細(xì)胞濃度的腫瘤細(xì)胞懸液加入每個(gè)檢測(cè)板板孔中的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為 I次/5min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀有腫瘤細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)分析比較不同濃度腫瘤懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，選擇腫瘤細(xì)胞加入到腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液后最快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且當(dāng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)時(shí)間到IOOh時(shí)腫瘤細(xì)胞仍能處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所對(duì)應(yīng)的腫瘤細(xì)胞懸液細(xì)胞濃度，即為用于確定檢測(cè)黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞作用時(shí)，所使用的腫瘤細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度；⑤分析④步確定的最佳細(xì)胞濃度的腫瘤懸液所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，即為添加黃連生物堿單體藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于， 步驟④分析比較不同濃度腫瘤懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線(xiàn)時(shí)，不同濃度腫瘤細(xì)胞懸液的腫瘤細(xì)胞濃度為2X104、4X104、5X104、8X104的細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)做分析比較，上述腫瘤細(xì)胞濃度的單位為個(gè)/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于，步驟④確定的用于檢測(cè)黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的腫瘤細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度為4X IO4個(gè)/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于，所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入 100 μ I的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)未有腫瘤細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)將步驟(2)確定的最佳細(xì)胞濃度的腫瘤細(xì)胞懸液100 μ I加入到每個(gè)檢測(cè)板板孔的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)培養(yǎng)液中腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；③待細(xì)胞生長(zhǎng)到步驟(2)確定的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)時(shí)，吸棄檢測(cè)板板孔中的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，再向每個(gè)板孔中加入200 μ I不同濃度的黃連生物堿單體藥液，另設(shè)置2個(gè)板孔，添加 200 μ I腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，即為空白對(duì)照板孔；@設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/min，細(xì)胞實(shí)時(shí)分析儀監(jiān)測(cè)黃連生物堿單體藥液中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于，所述黃連生物堿單體藥液的配制方法是，黃連生物堿單體用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液超聲溶解10 20min，再用孔徑為O. 2 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌得到母液，用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液將母液稀釋?zhuān)玫讲煌瑵舛鹊狞S連生物堿單體藥液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于，所述的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀為DP型實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞為肝癌HepG2細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液為質(zhì)量濃度10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液或質(zhì)量濃度10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，其特征在于，所述黃連生物堿單體為小檗堿、巴馬汀或非洲防己堿、黃連堿、藥根堿或表小檗堿。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)的一種檢測(cè)黃連生物堿單體對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的方法，包括以下步驟，(1)分別制備不同濃度的腫瘤細(xì)胞懸液、黃連生物堿單體藥液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃度腫瘤細(xì)胞懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定檢測(cè)黃連生物堿單體藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞作用時(shí)，所使用的腫瘤細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加藥液的最佳給藥時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)給藥前后的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值。判斷藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，該方法可實(shí)時(shí)反映給藥前后的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷的生長(zhǎng)、伸展、形態(tài)變化、死亡生理狀態(tài)，具有高度的靈敏性和可重復(fù)性，無(wú)需標(biāo)記，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、精確。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK103255196SQ20131021006
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月31日
發(fā)明者鄢丹, 張樂(lè)樂(lè), 馬麗娜, 章從恩, 熊呤, 肖小河 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院