本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)食品加工，具體涉及一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法。

背景技術(shù)：

1、蠶蛹是繅絲工業(yè)的寶貴副產(chǎn)品，由約60％的蛋白質(zhì)、30％的脂肪、5％的多糖和多種微量營養(yǎng)素組成。蠶蛹蛋白分離物因其獨(dú)特的生物活性和生物相容性而受到工業(yè)界的廣泛關(guān)注。

2、相比于動(dòng)、植物蛋白，蠶蛹蛋白中的一些氨基酸，如賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸等含量更豐富但不穩(wěn)定，其在蛋白質(zhì)提取或加工過程中易被降解或發(fā)生外消旋化而形成一種交聯(lián)氨基酸衍生物——賴丙氨酸。賴丙氨酸會(huì)通過降低蛋白質(zhì)的生物利用度和消化率來破壞其營養(yǎng)價(jià)值，并可能引起腎臟器官病變，危害人體健康。因此，迫切需要尋求一種有效的技術(shù)來最大程度地抑制賴丙氨酸的形成以解決蠶蛹蛋白生產(chǎn)過程中所面臨的營養(yǎng)和安全問題。

3、賴丙氨酸的形成過程可歸結(jié)為兩個(gè)階段：(1)首先一些蛋白質(zhì)氨基酸殘基(半胱氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等)經(jīng)外消旋化和β消除反應(yīng)后，形成中間產(chǎn)物脫氫丙氨酸；(2)脫氫丙氨酸共軛雙鍵與蛋白質(zhì)中賴氨酸、精氨酸殘基的ε-nh2發(fā)生親核加成反應(yīng)，最終形成賴丙氨酸。基于賴丙氨酸的形成機(jī)理，抑制賴丙氨酸生成的手段包括：(1)減少由外消旋化和β消除反應(yīng)發(fā)生導(dǎo)致的蛋白質(zhì)氨基酸殘基的降解和脫氫丙氨酸的生成；(2)降低脫氫丙氨酸的含量；(3)降低來自賴氨酸、精氨酸殘基的ε-nh2以減少加成反應(yīng)的發(fā)生。

4、目前，已報(bào)道的抑制賴丙氨酸生成的方法主要為化學(xué)修飾法，如添加巰基化合物、有機(jī)酸類或金屬鹽類等，但是這些化合物的添加會(huì)影響食品的感官、風(fēng)味和安全性。蛋白-糖類相互作用是一種綠色高效的化學(xué)修飾技術(shù)，已被廣泛用于增強(qiáng)蛋白質(zhì)的功能特性。然而，目前關(guān)于碳水化合物在抑制蛋白質(zhì)中賴丙氨酸生成的研究較少，僅限于具有簡單分子結(jié)構(gòu)的單糖或二糖，如木糖、葡萄糖和乳糖，而多糖對(duì)賴丙氨酸的抑制作用未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，通過對(duì)比驗(yàn)證聯(lián)合處理技術(shù)相比于單獨(dú)糖基化處理或單獨(dú)超聲處理對(duì)抑制賴丙氨酸生成的優(yōu)勢(shì)。該方法操作簡單、成本較低，可以應(yīng)用于其它蛋白質(zhì)原料或食品的實(shí)際生產(chǎn)和加工中，有效解決由氨基酸降解或外消旋化引起的蛋白營養(yǎng)安全性降低的問題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，包括如下具體步驟：

4、(1)脫脂蠶蛹粉制備：將干蠶蛹粉碎后，得到粉末與石油醚混合，經(jīng)水浴反應(yīng)后脫去油脂，水浴反應(yīng)后再經(jīng)離心和烘干，所得的產(chǎn)物過篩后，得到顆粒均勻的脫脂蠶蛹粉；

5、(2)蠶蛹蛋白制備：將步驟(1)中得到的脫脂蠶蛹粉與水混合，并調(diào)節(jié)所得混合液的ph，攪拌一段時(shí)間后，經(jīng)離心得到的上清液即為蛋白提取液，再次調(diào)節(jié)ph，后經(jīng)離心收集沉淀，即為蠶蛹蛋白；

6、(3)海藻酸鈉處理：首先將步驟(2)中得到的蠶蛹蛋白分散在水中，然后再加入海藻酸鈉，得到蠶蛹蛋白-海藻酸鈉混合液；

7、(4)超聲波處理：將步驟(3)制備的蠶蛹蛋白-海藻酸鈉混合液進(jìn)行ph調(diào)節(jié)，然后將調(diào)整ph后的混合液進(jìn)行超聲處理，處理后的混合液進(jìn)行水浴攪拌反應(yīng)；反應(yīng)后冷卻至室溫，經(jīng)離心取上清液，并再次調(diào)節(jié)ph，最后經(jīng)凍干，得到凍干粉末，實(shí)現(xiàn)抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的目的。

8、進(jìn)一步，步驟(1)中所述粉末與石油醚的用量關(guān)系為1g：5ml；所述水浴反應(yīng)的溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為3h；所述過篩的目數(shù)為40目。

9、進(jìn)一步，步驟(2)中脫脂蠶蛹粉與水的用量關(guān)系為1g：30ml；所述調(diào)節(jié)所得混合液的ph是用2m氫氧化鈉溶液將混合液ph調(diào)整至10.0；所述攪拌一段時(shí)間為1h，所述再次調(diào)節(jié)ph是用1m鹽酸溶液調(diào)整其ph至4.2。

10、進(jìn)一步，步驟(3)所述蠶蛹蛋白、海藻酸鈉與水的用量關(guān)系為5g：0.5-2g：100ml。

11、進(jìn)一步，步驟(4)中，調(diào)節(jié)ph所用的試劑為1m氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)ph至12.5；所述水浴攪拌反應(yīng)的溫度為80℃，時(shí)間為100min；所述再次調(diào)節(jié)ph至7.0，所用的試劑是1m鹽酸溶液。

12、進(jìn)一步，步驟(4)中的超聲處理?xiàng)l件：超聲頻率為20khz和40khz同步處理，功率均為240w，時(shí)間為20min，超聲溫度為80℃，超聲間歇為啟動(dòng)10s，關(guān)閉5s關(guān)，然后再次開啟10s，如此循環(huán)進(jìn)行。

13、進(jìn)一步，步驟(1)～(2)和(4)中的離心條件均為：溫度4℃，轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間20min。

14、本發(fā)明的有益效果：

15、(1)海藻酸鈉是從褐藻或馬尾藻中提取的一種天然多糖物質(zhì)，是綠色、安全、高效的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾方法，具有高穩(wěn)定性、增稠性、良好的凝膠性、固化性和防止食品干燥的能力。而且其還原性較弱，具有較強(qiáng)的分子立體阻礙作用，可通過共價(jià)/非共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)相互作用，引起蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)修飾，并通過限制氨基酸的交聯(lián)抑制賴丙氨酸生成。蠶蛹蛋白和特定用量的海藻酸鈉通過接枝反應(yīng)復(fù)合，接枝度為26.69％～28.63％，賴丙氨酸生成量降低35.70％～38.96％。

16、(2)超聲波是綠色、經(jīng)濟(jì)、簡便的蛋白質(zhì)物理加工方法；單獨(dú)超聲處理也可以抑制蠶蛹蛋白中的賴丙氨酸的生成，但是沒有單獨(dú)海藻酸鈉處理的抑制效果好，賴丙氨酸生成量僅降低26.11％。

17、(3)超聲波是一種非熱物理修飾技術(shù)，不僅被用于改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性，還可以改變蛋白質(zhì)的粒徑、構(gòu)象特征及分子間或分子內(nèi)交聯(lián)，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)食品中交聯(lián)氨基酸衍生物的形成。此外，超聲波處理還能促進(jìn)蛋白質(zhì)與多糖之間的接枝反應(yīng)，其通過空化和機(jī)械作用使大分子蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)展開，提高蛋白質(zhì)氨基與糖類羰基之間的碰撞效率，從而加速蛋白質(zhì)與碳水化合物之間的美拉德反應(yīng)。超聲波處理可以促進(jìn)蠶蛹蛋白與海藻酸鈉的糖基化復(fù)合，接枝度達(dá)27.72％～30.00％。更重要的，通過超聲波輔助海藻酸鈉糖基化處理后，蠶蛹蛋白中的賴丙氨酸生成量降低46.36％～49.58％，取得了意想不到的顯著效果。

18、(4)超聲輔助海藻酸鈉糖基化處理誘導(dǎo)蠶蛹蛋白的共價(jià)/非共價(jià)交聯(lián)，zeta電位、分子間化學(xué)相互作用、二硫鍵構(gòu)象分布、微觀形態(tài)和顆粒粗糙度等有不同程度的變化；因此，為降低蠶蛹蛋白在提取和加工過程中有害產(chǎn)物賴丙氨酸的生成，本發(fā)明將海藻酸鈉糖基化修飾和超聲波處理技術(shù)相結(jié)合，通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)/非共價(jià)交聯(lián)和增加基團(tuán)位阻效應(yīng)來抑制賴丙氨酸交聯(lián)的發(fā)生，該研究目前未見國內(nèi)外報(bào)道，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，按照下述步驟進(jìn)行：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，步驟(1)中所述粉末與石油醚的用量關(guān)系為1g：5ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，步驟(1)中所述水浴反應(yīng)的溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為3h；所述過篩的目數(shù)為40目。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，步驟(2)中脫脂蠶蛹粉與水的用量關(guān)系為1g：30ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，步驟(2)中所述調(diào)節(jié)所得混合液的ph是用2m氫氧化鈉溶液將混合液ph調(diào)整至10.0；所述攪拌一段時(shí)間為1h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，步驟(2)中所述再次調(diào)節(jié)ph是用1m鹽酸溶液調(diào)整其ph至4.2。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，步驟(3)所述蠶蛹蛋白、海藻酸鈉與水的用量關(guān)系為5g：0.5-2g：100ml。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，步驟(4)中，調(diào)節(jié)ph所用的試劑為1m氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)ph至12.5；所述水浴攪拌反應(yīng)的溫度為80℃，時(shí)間為100min；所述再次調(diào)節(jié)ph至7.0，所用的試劑是1m鹽酸溶液。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，步驟(4)中的超聲處理?xiàng)l件：超聲頻率為20khz和40khz同步處理，功率均為240w，時(shí)間為20min，超聲溫度為80℃，超聲間歇為啟動(dòng)10s，關(guān)閉5s關(guān)，然后再次開啟10s，如此循環(huán)進(jìn)行。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法，其特征在于，步驟(1)～(2)和(4)中的離心條件均為：溫度4℃，轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間20min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種超聲波輔助海藻酸鈉糖基化抑制蠶蛹蛋白中賴丙氨酸生成的方法。首先將干蠶蛹粉碎后，得到粉末與石油醚混合，經(jīng)水浴反應(yīng)、離心、烘干、過篩后，得到顆粒均勻的脫脂蠶蛹粉；再與水混合，調(diào)節(jié)pH，經(jīng)攪拌、離心得到蛋白提取液，再次調(diào)節(jié)pH后經(jīng)離心收集沉淀，得到蠶蛹蛋白；將其分散在水中，并加入海藻酸鈉，得到蠶蛹蛋白?海藻酸鈉混合液，調(diào)節(jié)pH至12.5后進(jìn)行超聲處理，然后經(jīng)水浴反應(yīng)、離心取上清液，并再次調(diào)節(jié)pH至7.0，最后經(jīng)凍干，得到凍干粉末。本發(fā)明將海藻酸鈉糖基化修飾和超聲波處理技術(shù)相結(jié)合，可以有效抑制蠶蛹蛋白生產(chǎn)和加工過程中有害產(chǎn)物賴丙氨酸的生成，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)研發(fā)人員：何榮海,許海寧,潘佳音,皇圓圓,代春華,黃六容,馬海樂
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10