專(zhuān)利名稱(chēng)：以微粒為媒介的大豆植物和品系的轉(zhuǎn)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物及其相關(guān)物質(zhì)的基因工程的一般領(lǐng)域，具體的是涉及通過(guò)以微粒為媒介的轉(zhuǎn)化方法，將基因物質(zhì)以物理方法引進(jìn)到大豆植物的可再生的組織中而將外源基因物質(zhì)轉(zhuǎn)化到大豆植物品系的種系中。
關(guān)于植物品種的基因轉(zhuǎn)化，目前人們已作了很多努力及研究，人們相信，可將外來(lái)基因轉(zhuǎn)化到植物種系中的有效的方法的發(fā)展將得到試圖擴(kuò)大的商業(yè)上重要的作物品種的多種基因原種，并可得到一些可選擇性地引入作物品種中的特別令人感興趣的功能基因。有關(guān)于人們對(duì)植物品種的轉(zhuǎn)化或基因工程的努力和研究迄今為止已成功地得到了結(jié)果，它們根據(jù)植物的品種而顯著地變化。
在此以前已經(jīng)應(yīng)用的將外源基因引入植物的主要機(jī)理是采用單個(gè)植物細(xì)胞，如原生質(zhì)體或在一未分化的組織群中，已知的如在胼胝中開(kāi)始轉(zhuǎn)化的。在植物細(xì)胞中起作用的嵌合基因已通過(guò)電處理(electroporation)和微量注射引入到單細(xì)胞植物的原生質(zhì)體中。但是，迄今為止應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)利用了植物病原菌根癌土壤桿菌的自然特性，它具有將一部分包含在Ti(腫瘤誘導(dǎo))質(zhì)粒中的部分DNA轉(zhuǎn)移到受感染的植物細(xì)胞中的遺傳能力。通過(guò)將外來(lái)基因插入到帶有某些Ti質(zhì)粒順序的土壤桿菌的質(zhì)粒中，細(xì)菌的轉(zhuǎn)化特性可用于將外來(lái)基因輸送到受感染的植物細(xì)胞的基因組中。已發(fā)現(xiàn)，以土壤桿菌為媒介的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用在很多類(lèi)型的作物品種，如煙草，牽?；ê秃}卜中可以進(jìn)行得相當(dāng)好，但是，它受到幾個(gè)顯著的限制。第一個(gè)限制是轉(zhuǎn)化只能在組織培養(yǎng)水平上進(jìn)行，較典型的是采用體細(xì)胞組織進(jìn)行，然后，必須將它人為地再生成整株植物。這就限制了以土壤桿菌為媒介的基因轉(zhuǎn)化到一些作物品種的適用范圍，而這些作物可以容易地從一些可被土壤桿菌感染的典型的組織中再生。這個(gè)限制可能使以土壤桿菌為媒介的轉(zhuǎn)化成為一個(gè)費(fèi)力的過(guò)程，因?yàn)橐恍┲参锏脑偕M管是可能的，但可能是一個(gè)需要很多操作和一些通常的已有技術(shù)的費(fèi)力的、精細(xì)的過(guò)程。第二個(gè)限制是土壤桿菌的自然宿主范圍只包括雙子葉植物和有限量的百合科(Liliaceae)的單子葉品種。因此，以土壤桿菌為媒介的轉(zhuǎn)化不被認(rèn)為是商業(yè)上感興趣的單子葉品種，如谷類(lèi)作物的有效的“工具”。用以土壤桿菌為媒介的轉(zhuǎn)化的另一個(gè)困難是在組織培養(yǎng)基的植物組織中會(huì)自發(fā)地產(chǎn)生一些克隆變異體，這樣，就使轉(zhuǎn)化體的鑒別變得復(fù)雜化了。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，至少一些嵌合基因結(jié)構(gòu)對(duì)于在很多普通作物的植物細(xì)胞中的外來(lái)基因的表達(dá)是有效的。這些嵌合基因在單子葉及雙子葉中的功能已經(jīng)通過(guò)諸如電處理這樣的技術(shù)，在培養(yǎng)基中進(jìn)行玉米和大豆原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化而得到了演示，如Christou等，《Proc.Natl.Acad.SciUSA》843962-3966(1987)中揭示的。但是，尚未有從相應(yīng)的原生質(zhì)體中再生完整的大豆植物或其它幾個(gè)重要作物品種的整株能生育的植物方法存在。例如，非整株的、完整的轉(zhuǎn)化大豆植物已知可從原生質(zhì)體中再生了。但是，大豆品系其它作物品種的基因轉(zhuǎn)化是一個(gè)所期望的目標(biāo)，因?yàn)槠胀ㄗ魑镏参锏霓r(nóng)業(yè)價(jià)值和改善它們的價(jià)值和產(chǎn)率的能力是所希望的。
實(shí)質(zhì)上，大多數(shù)指導(dǎo)植物系的基因工程的策略都包括通?？梢钥紤]的兩個(gè)互補(bǔ)過(guò)程。第一個(gè)過(guò)程包括一個(gè)或多個(gè)具有特定性質(zhì)類(lèi)型的植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過(guò)程通常定義為將一外來(lái)基因，通常為一嵌合基因引入單個(gè)植物細(xì)胞的基因組中，如較典型的發(fā)生于以土壤桿菌為媒介的轉(zhuǎn)化中。第二個(gè)過(guò)程包括將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞再生或培養(yǎng)為完整有性的感受態(tài)植物。整個(gè)策略的每一方面都不可能100%，或接近100%地成功，但是在每一方面均須具有相當(dāng)?shù)目煽慷群驮佻F(xiàn)性以致可以回收到一定數(shù)量的轉(zhuǎn)化植物株。
上述兩種過(guò)程，轉(zhuǎn)化和再生必須是互補(bǔ)的。很明顯，它們可以將一些現(xiàn)有技術(shù)尚不能再生的組織或細(xì)胞類(lèi)轉(zhuǎn)化到整株植物中。例如，使用電處理(electroporation)技術(shù)在具有外來(lái)基因體外轉(zhuǎn)化大豆原生質(zhì)體細(xì)胞是很容易的和可能的。但是，大豆原生質(zhì)體不能再生。將現(xiàn)有技術(shù)尚不能成功地、遺傳地轉(zhuǎn)化的一定量不同組織和細(xì)胞類(lèi)進(jìn)行植物組織再生也是可能的。然而，整個(gè)過(guò)程的兩個(gè)分開(kāi)過(guò)程的互補(bǔ)性一定是這樣的通過(guò)轉(zhuǎn)化過(guò)程可成功地、遺傳地轉(zhuǎn)化的組織一定是同一種類(lèi)型和同一種性狀的，而且必須是足夠健康的、能感受的和有活力的。因此，它們可以成功地再生進(jìn)能生育的整株植物中或可用于成功地產(chǎn)生胚芽系原生質(zhì)，從而能產(chǎn)生含有外表基因的整株完整的能生育的植物。
先前曾有人努力使人們可以在使用根癌病土壤桿菌的培養(yǎng)基中直接進(jìn)行大豆細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化。例如，在Owens等，《PlantPhysiology》77，87～94(1985)中報(bào)導(dǎo)了大豆細(xì)胞對(duì)于根癌土壤桿菌感染的影響，而在Facciotti等，《Bio/Technology》3∶241-246(1985)中報(bào)導(dǎo)了用根癌病土桿菌轉(zhuǎn)化的大豆根癌培養(yǎng)物中嵌合基因的表達(dá)。其它一些類(lèi)似的報(bào)導(dǎo)認(rèn)為可以用致癌的根癌病土壤桿菌轉(zhuǎn)化大豆組織，盡管通常人們公認(rèn)這樣的組織被認(rèn)為是無(wú)再生能力的。
大量的成就指導(dǎo)了從各種組織類(lèi)型中進(jìn)行大豆植物的再生。用于植物，如大豆的再生技術(shù)使用各種組織或細(xì)胞類(lèi)型作為起始物質(zhì)。尤其對(duì)于大豆來(lái)說(shuō)，再生過(guò)程已經(jīng)發(fā)展到采用一些分化的組織類(lèi)型，如分生組織[(Cartha等，《Can.J.Bot.》591671-1679(1981)]、胚軸部分[(Cameya等，《PlantScienceLetters》21289-294(1981)]和莖節(jié)切片[Saka等，《PlantScienceLetters》19193-201(1980)和Cheng等，《PlantScienceLetters》，1991-99(1980)]開(kāi)始。Ranch等，《InVitroCellular&DevelopmentalBiology》2111，653～658(1985)中也報(bào)導(dǎo)了從未成熟大豆胚芽的外植體中產(chǎn)生的體細(xì)胞胚使整株有性成熟大豆植物的再生。最近的一些報(bào)導(dǎo)也描述了通過(guò)器官發(fā)生和胚胎發(fā)生從細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行成熟大豆植物的再生，如Barwale等，《Planta》167，473-481(1986)和Wright等，《PlantCellReports》5，150-154(1986)。
有一個(gè)報(bào)導(dǎo)是關(guān)于通過(guò)一彈槍加速DNA覆蓋的鎢彈以得到在完整的Alliumcepa(洋蔥)的表皮細(xì)胞中外來(lái)DNA的瞬時(shí)表達(dá)，但該方法中沒(méi)有報(bào)導(dǎo)植物工程，見(jiàn)Klein等，《Nature》32770-73(1987)。
本發(fā)明可概括為一種制備可遺傳轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法，它包括如下步驟制備包括編碼區(qū)和可在大豆細(xì)胞中有效地表達(dá)編碼區(qū)的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序的外來(lái)基因的拷貝;將外來(lái)基因拷貝與生物惰性的載體顆粒相結(jié)合;將可再生的大豆細(xì)胞放置于“靶”表面上，用物理方法加速在“靶”表面上攜帶有外來(lái)基因拷貝的微粒，以這種方式即有一些微?？梢再A留于至少是一部分的大豆組織的細(xì)胞的內(nèi)部;將處理后的細(xì)胞再生成整株有性成熟大豆植物;和驗(yàn)證在再生植物組織中存在外來(lái)基因。
本發(fā)明也可概括為在它們的基因組中攜帶有大豆植物細(xì)胞中能表達(dá)外來(lái)基因的大豆植物和它們的種子的獲得。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種將大豆植物及其品系進(jìn)行遺傳工程的有效的和可重復(fù)的方法。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)質(zhì)方面是廣范圍的大豆組織類(lèi)型可用于該方法中以成功地獲得轉(zhuǎn)化的大豆植物。
本發(fā)明的其它一些目的、優(yōu)點(diǎn)和實(shí)質(zhì)將從下列詳細(xì)說(shuō)明中變得更明顯。


圖1是適用于本發(fā)明的微粒加速器的一個(gè)具體例的部件剖面分解圖。
圖2是適用于本發(fā)明的微粒加速器另一個(gè)具體例的部分剖面分解圖。
圖3是圖2所示的加速器的發(fā)射室的頂端平面圖。
圖4是可用于圖1和圖2所示的微粒加速器的電子發(fā)射線路的電路圖。
圖5是用于構(gòu)造植物表達(dá)載體pCMC1208的質(zhì)粒操縱系列的流程圖。
圖6是用于構(gòu)造植物表達(dá)載體pCMC1022的質(zhì)粒操縱的附加系列的流程圖。
圖7是用于構(gòu)造植物表達(dá)載體pAMVFF所必須的質(zhì)粒操縱的流程圖。
圖8是用于構(gòu)造植物表達(dá)載體pCMC1100所必須的(質(zhì)粒)操縱的流程圖。
在按本發(fā)明實(shí)施例的植物基因轉(zhuǎn)化的實(shí)踐中，DNA以物理方式引入到分生組織或者大豆細(xì)胞胚胎的內(nèi)部，DNA被帶入到單個(gè)細(xì)胞中，而既不毀壞細(xì)胞的組織，也不使細(xì)胞失去能力。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，以這一種方式引入到大豆細(xì)胞中的DNA可以穩(wěn)定在并入到所得到的植物和植物系的基因遺傳物中。
有幾種因素可以影響這種方式成功地實(shí)施大豆細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。使基因插入的組織必須是能夠被再生成整個(gè)性成熟植物。把DNA帶入到細(xì)胞中的方式是通過(guò)將其裝載在微粒上，以仔細(xì)安排的方式使微粒加速，以致載有DNA的單個(gè)微粒均具有合適的動(dòng)量和速度，并且均處于較均勻的形式中，以致以接觸植物組織時(shí)，微粒深入至大量活細(xì)胞的內(nèi)部，并沒(méi)有在生物學(xué)上使它們失去能力。因此，微粒上的DNA應(yīng)當(dāng)能使大豆細(xì)胞轉(zhuǎn)化和表達(dá)植物細(xì)胞中的所要求的特征。此外，DNA本身可含有一種可供選擇或者可篩選的標(biāo)記物，該標(biāo)記物可在已推定轉(zhuǎn)化了的植物組織、種子或者植物苗中被測(cè)到，以便證明該特定植物組織已發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。如果轉(zhuǎn)化頻率足夠高，那么這種可選擇的標(biāo)記物就不需要采用，因?yàn)榇嬖诘囊隓NA通?？捎缮锘瘜W(xué)分析法測(cè)得。
可以預(yù)見(jiàn)到的加速生物學(xué)上惰性的小載體微粒的機(jī)械系統(tǒng)有多種類(lèi)型，可能的裝置可包括微粒的彈道式爆炸加速、微粒的離心加速、微粒的靜電加速或者能夠給小惰性微粒提供動(dòng)量和速度的任何其他類(lèi)似的系統(tǒng)。圖1和圖2-3以圖解方式說(shuō)明了申請(qǐng)人采用的兩種新的機(jī)械裝置。其中每種裝置均采用高壓放電產(chǎn)生的沖擊波。在圖1中且通常以10表示的是用所說(shuō)的方法加速惰性微粒用的加速器。圖2-3中所示的是第二種加速器，以110表示。在每幅圖中，以22表示的是帶靶細(xì)胞的靶子表面。
加速器10是由幾部分組成?；鸹ǚ烹娛?2設(shè)有一對(duì)伸入到其內(nèi)部的電極14，火花放電室12的幾何形狀是圓筒狀的。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，以?xún)?nèi)徑為13毫米的聚氯乙烯塑料管的一段用作火花放電區(qū)12是滿(mǎn)意的。電極14以相對(duì)的兩側(cè)延伸到管的內(nèi)部，設(shè)置在低于火花室12的頂部大約5毫米處。電極14本身由帶螺紋的螺栓構(gòu)成，延伸到在火花室12壁本身的內(nèi)側(cè)壁表面中形成的合適的螺紋中。構(gòu)成電極14的帶螺紋的螺栓的端部均用高壓繼電器上斷開(kāi)的觸點(diǎn)的耐電弧合金保護(hù)，其尺寸為大約2毫米×2毫米×3毫米，并且焊接在帶螺紋的螺栓的端部。通過(guò)適當(dāng)?shù)匕崖菟ㄐM(jìn)或旋出火花室12，可調(diào)整電極14之間的間隙。電極端部之間的放電電壓大約為15千伏時(shí)的最佳間隙為1～1.5毫米。電極14本身的制作和安裝的方法顯然有多種方式，盡管優(yōu)先采用的電極是相當(dāng)耐用的，電極之間的放電間隙的距離要易于調(diào)整。
火花室12上面設(shè)有間隔圈16。間隔圈16可以由與火花室12相同的PVC管構(gòu)成。最好切割成垂直長(zhǎng)度為6毫米。在用于單一作物品種轉(zhuǎn)化的固定裝置中，間隔圈16應(yīng)當(dāng)僅被構(gòu)成火花放電室12的垂直延伸部分，雖然可移動(dòng)的和可替換的間隔圈16可調(diào)節(jié)火花放電到承載板的可變動(dòng)的距離，使微粒的加速力可以按條件或者處理的品種來(lái)加以改變。如果采用大的承載板18，則可以使間隔圈16在頂上開(kāi)口，但也可以方便地通過(guò)適當(dāng)?shù)拿芊庖圆糠值叵拗祈敳康拈_(kāi)口以形成一個(gè)大約9毫米×13毫米的長(zhǎng)方形孔。在間隔圈16頂上放置的是承載板18。承載板是一塊具有合適尺寸的輕的平板，放置在間隔圈16的頂上。承載板18是由柔韌的生物學(xué)上惰性的薄片材料構(gòu)成，能夠在其上裝載生物學(xué)上惰性的微粒。承載板18的作用是把由火花放電發(fā)生的沖擊波的力傳遞到加速的載體微粒上。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，承載板18是由1密爾或0.5密爾涂復(fù)浸鋁的聚酯薄膜的米粒(聚酯薄膜)構(gòu)成，最好采用0.5毫米板，因?yàn)樵趯?shí)踐中這種板具有較好的使微粒透入植物細(xì)胞內(nèi)的性能。根據(jù)通常的實(shí)踐，承載板18的實(shí)際表面積越小，載體微粒進(jìn)入植物細(xì)胞的穿透性越好。關(guān)于穿透性的這種看法由需要具有的承載板的尺寸來(lái)權(quán)衡，所說(shuō)的板要易于處理且在足夠大的范圍內(nèi)提供能夠沖擊待處理組織中的大量植物細(xì)胞的沖擊形式。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，18×18毫米的承載板是一種較好的尺寸，它能以微粒在植物組織靶上的要求的沖擊形式提供良好的穿透性。
承載板的作用還在于安排微粒的圖式，當(dāng)它們接觸靶子表面時(shí)。為了保證靶子上的許多細(xì)胞盡可能地被沖擊，對(duì)微粒的圖式的均勻性要求就相當(dāng)高，以便使轉(zhuǎn)化體的收率達(dá)到最大。未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以與可由被載體微粒造成部分地變?nèi)醯霓D(zhuǎn)化體一起處于競(jìng)爭(zhēng)的有利地位。故而，要求盡可能以接近100%穿透靶子細(xì)胞，而承載板18上微粒的均勻?qū)雍蛨D式有助于這個(gè)目的。
至于載體微粒本身，任何生物學(xué)上惰性的高密度材料均可用作本發(fā)明范圍內(nèi)的DNA載體微粒。最好采用金屬材料，例如鎢和金，其比重為19。銥也可優(yōu)先采用，其比重為22，但申請(qǐng)人尚未用過(guò)，因?yàn)橥ǔＫ灰踪I(mǎi)到較粗的粉末。與金相比，鎢也可能較金為差，因?yàn)樗诰哂袠O低溫度的空氣中就會(huì)氧化。載體微粒上的這種氧化層會(huì)使微粒結(jié)合在一起，當(dāng)微粒聚集在一起時(shí)會(huì)引起平均粒度顯著增大。以不規(guī)則聚集成塊的顆粒對(duì)實(shí)施本發(fā)明是不適宜的，因?yàn)檫@種聚集將使其質(zhì)量和大小有很大的意義，因此難以獲得有規(guī)律的重演性的結(jié)果。其他高密度非金屬材料也可用作微粒。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，金是用作本發(fā)明的微粒的一種最佳材料，因?yàn)樗哂懈叩谋戎?，?duì)生物物質(zhì)和氧化均是較惰性的，并且對(duì)實(shí)施本發(fā)明特別適合的尺寸，即具有1-3微米直徑的球狀體也容易從市場(chǎng)上買(mǎi)到?？梢园押线m的DNA順序施加到金微粒上，再把金微粒以將在下文詳細(xì)討論的方式施加到承載板上。
放在承載板18上面的是保持篩20。保持篩20是一種100目不銹鋼篩，以物理方式設(shè)置在位于間隔圈16上面大約20毫米的塑料支架中。保持篩20的作用是把載體板18限制到它不能打到靶子上。
靶子表面22是一塊平板，能夠懸浮可再生的大豆組織的靶子，例如其上的胚軸、分割的分生組織、未成熟胚中的子葉或子葉節(jié)、或者上胚軸片段。實(shí)踐中業(yè)已發(fā)現(xiàn)，易于采用的靶子是一種陪替氏培養(yǎng)皿，尺寸為60毫米×15毫米，倒置在固定保持篩的組合件的頂上。從保持篩20到靶子表面22上的靶細(xì)胞的間距最好為大約5-10毫米。在下述的電壓和壓力的條件下，間距大于15毫米會(huì)降低載體微粒進(jìn)入植物細(xì)胞的深入性能，而間隙小于5毫米，會(huì)導(dǎo)致壓碎細(xì)胞，結(jié)果使保持篩20在沖擊波的力作用下變形。
圖2-3中所示的為微粒加速器110的另一種經(jīng)改進(jìn)的具體裝置。在加速器110中，有一個(gè)放電室112，兩根電極114延伸到其中。電極114為帶單螺紋的鋼質(zhì)螺栓，端部無(wú)合金，電極之間的間隙為約2毫米，其中跨接一滴大約6微升的水滴124。然而，放電室112本身在幾何尺寸上與放電室12明顯不同。放電室112由隔板113分隔成兩個(gè)小室115和117。電極114在其中延伸的小室115是實(shí)際產(chǎn)生電火花放電的地方。小室115有一個(gè)可移動(dòng)的通道蓋119和一個(gè)包括許多梯級(jí)121的底表面以及一個(gè)與垂直方向成大約20°角且向小室117偏斜的偏斜表面。小室117的頂系由承載板18蓋住，它與圖1的實(shí)施例中所述的一樣，并且具有一個(gè)偏斜底表面125，與垂直方向成45°角，形成許多它的底表面。加速器110底部的螺紋孔127可由帶螺紋的螺栓129使其固定在安裝板131上。保持篩20和靶子表面22與圖1的加速器10中所用的一樣，小室117的頂部和篩20之間的最佳間隙約為20毫米，而篩20距靶子22約為5-10毫米。近來(lái)，試驗(yàn)揭示了梯級(jí)121和偏斜表面125可能是不必要的，放電室112內(nèi)部為簡(jiǎn)單盒狀結(jié)構(gòu)。
加速器110以與加速器10相似的方式工作。加速器110意在使對(duì)欲轉(zhuǎn)化的植物組織的沖擊的沖擊波減至最小。由電極114放電產(chǎn)生的沖擊波在慣性上受通道蓋119限制和反射。隔板113把承載板18和靶子22與直接的沖擊波隔開(kāi)或者把沖擊波與火花放電隔開(kāi)。而由放電產(chǎn)生的沖擊波以與偏斜表面125成45°角向上反射到承載板18，從而以垂直沖擊板18，使其與直接沖擊波隔開(kāi)。小室117的頂部到保持篩20的最佳間隙約為20毫米，承載板18有機(jī)會(huì)充分地加速。
圖4中所示的為加速器10或者110用于建立放電所用的電路。接交流電源24的是可調(diào)變壓器26的一只線圈?？烧{(diào)變壓器的輸出端接在升壓高壓變壓器28的輸入端。變壓器28的高壓輸出端通過(guò)高壓硅整流器30施加直流電壓到被接在高壓的2微法電容器32上。電壓表34被接在電容器的兩端，以監(jiān)控其電壓。開(kāi)關(guān)36通過(guò)電極14接在電容器32的輸出端。利用可調(diào)變壓器26使電容器32上所積聚的直流電壓按要求調(diào)整，以改變電極14或者114之間的爆炸力。
當(dāng)將可再生的大豆組織(包括胚軸、切碎的或完整的分生組織、子葉節(jié)、腋芽、上胚軸片段、或者相似的組織)用作靶細(xì)胞時(shí)，組織必須用物理方法固定在靶子上，靶子可以顛倒放置，使能保持組織并使組織能保持成活的方式被固定在靶子上。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在靶子表面上有其有8%蒼耳烷膠的瓊脂培養(yǎng)基可以有效地固定欲受轉(zhuǎn)化的靶組織。
對(duì)于經(jīng)處理后的大豆組織，將其迅速地轉(zhuǎn)換到再生介質(zhì)上，在靶子表面上可以用單純的1%-5%水-瓊脂介質(zhì)。在小的陪替氏培養(yǎng)皿的底部可以涂敷瓊脂制劑，然后使其硬化。欲轉(zhuǎn)化的組織可以放在瓊脂制劑上，它將作為靶子表面。
微粒加速器10或110和靶表面22的整個(gè)組合件可以被部分地抽成真空，以防大氣的阻礙而使微粒和(或)承載板18減速。真空應(yīng)當(dāng)僅僅是部分真空，因?yàn)楦哒婵諘?huì)使靶植物組織干燥，從而使它們不能存活。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，足夠且有利的真空度約為500mmHg。把氦氣引入到真空室中也是有利的，因?yàn)楹馐堑兔芏鹊?，它在很大程度上不帶由放電產(chǎn)生的沖擊波，這樣減少了沖擊波危及植物組織或者靶子。由于微粒加速器10或110在大氣中組裝，然后抽真空充氦氣，所以空氣將在放電室12或112中存在，把由放電產(chǎn)生的沖擊波有效地帶到承載體18，而氦氣將存在于真空室。在承載板下放置一層水膜有助于使其附著在室上，以致使空氣保持在放電室12或112中。
最簡(jiǎn)單地說(shuō)明圖1裝置的操作，使加速器10或110點(diǎn)火的方法以在電極14或114之間放置一滴蒸餾水或者無(wú)離子水24或124開(kāi)始。水量必須加以選擇，不使在電極之間出現(xiàn)的電弧減弱，但還是要有足夠的水量，以便在出現(xiàn)放電時(shí)在火花室12或112的內(nèi)部形成沖擊波。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，優(yōu)先采用的水量約為2-6微升，加速器110中優(yōu)先采用的約為6微升。水量可用移液管使其懸掛在電極14或114的端部之間來(lái)施加。水滴24將跨接在電極之間的間隙中并保持在位置中。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在施加水滴24之前，使在電極的尖端涂一層輕質(zhì)油，有助于減少電極的剝蝕和提高放電的效率。
然后，把承載板18放置在間隔圈16的頂上或者在小室115的頂上。保持篩20設(shè)置在承載板18上面大約20毫米處，由倒置陪替氏培養(yǎng)皿組成的靶表面22放置在安裝保持篩20的上面。然后，把這套裝置抽真空到大約500mmHg。
交流電源電壓接在圖4的電路中，在電容器32上產(chǎn)生直流高電壓。電壓可以略有變化，由可調(diào)變壓器24，根據(jù)組織類(lèi)型和所采用間隙進(jìn)行調(diào)節(jié)。這種電壓的可變性要考慮放電的力，即施加于承載板18上的力要按靶組織的品種和組織類(lèi)型的要求調(diào)整或者調(diào)準(zhǔn)。10，000～30，000伏的電壓證明使用圖1-3中的裝置最成功。故而，微法電容器32上施加了高的直流電壓。然后，通過(guò)轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)36，把電容器32上的高壓電施加在電極14或114之間。
當(dāng)施加電壓時(shí)，放電電弧在兩根電極14或114之間跳躍。電弧立刻使在電極之間延伸的小水滴24或124汽化。來(lái)自水滴的爆炸式汽化的沖擊波經(jīng)整個(gè)火花室12或112的內(nèi)部傳播。當(dāng)沖擊波到達(dá)承載板18時(shí)，承載板18被垂直升起脫離加速器并加速地朝向保持篩20。當(dāng)承載板18打到保持篩20時(shí)，承載板18被約束在原位上，在承載板18上所帶的微粒離開(kāi)承載板，自由地飛越一段距離到達(dá)并停留在靶表面22的細(xì)胞上。如果該裝置結(jié)構(gòu)和調(diào)整合適且工藝合理，則有很大百分比的載體微粒將以正確的速度達(dá)到靶子，深入到靶表面22上所帶的細(xì)胞，而不破壞大量的細(xì)胞。故而，該方法的這部分得出經(jīng)分化的可復(fù)制的植物組織，其中許多組織細(xì)胞業(yè)已被插入其內(nèi)帶有外來(lái)種DNA的至少一個(gè)微粒。
然后，必須把該組織再生成整株植物。如果轉(zhuǎn)化方法中用未成熟的切除的胚組織作靶子，則通過(guò)胚胎發(fā)生或者器官發(fā)生可以實(shí)現(xiàn)再生成整株植物。實(shí)施這兩種方法的技術(shù)已在現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)Barwhale等人，《Planta》，67473-481(1986);Wright等人，《PlantCellReports》，5∶150-154(1986)。切除的分生組織也可容易地通過(guò)器官發(fā)生采用相同的技術(shù)再生。如果把上述的瓊脂制劑用于靶表面，該組織可以被轉(zhuǎn)化成單獨(dú)培養(yǎng)的平板，再生方法始于含有適量激素的瓊脂制劑。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，特別有利的靶組織是自成熟的或未熟的與種子離異的切除胚軸。在有或者沒(méi)有其上保持一部分子葉組織的情況下，只要分生組織作為靶子暴露，可以采用整個(gè)完整的胚軸。由這種軸來(lái)的經(jīng)培養(yǎng)的分生組織可以被培養(yǎng)，以得出一些或部分可以部分或者完全被轉(zhuǎn)化的多苗。
然而，如果目的在于把異種基因引入到植物系中，則再生的整個(gè)性成熟的植物將不以此方法為終止。以這種方式再生的植物將是典型的嵌合。而這里說(shuō)明將使異種基因經(jīng)歷至少一些性成熟植物的后代，因?yàn)橛梢赃@種方式生成的再生植物來(lái)的僅一部分嵌合的后代，將帶有轉(zhuǎn)化體DNA。因此，再生植物的后代可能需要篩選或者選擇外來(lái)DNA遺傳。可以通過(guò)DNA雜交驗(yàn)定、表達(dá)產(chǎn)物的生化驗(yàn)定或者存在的引入了基因的表達(dá)產(chǎn)物的植物表型特性的篩選來(lái)篩選外來(lái)DNA。然后，帶有外來(lái)基因的后代將通過(guò)正常的孟德?tīng)柺竭z傳把該特性遺傳給它們的后代。最初的試驗(yàn)指出，引入基因的穩(wěn)定整合將以比具有要求外來(lái)基因表達(dá)的穩(wěn)定整合高得多的頻率出現(xiàn)。通常還達(dá)到外來(lái)基因的暫時(shí)的或短期的表達(dá)。故而，即使基因結(jié)構(gòu)可易在大豆中表達(dá)，但可要求達(dá)到穩(wěn)定整合的許多次再生達(dá)到將把整合基因傳給其后代的一種穩(wěn)定表達(dá)植物。
在本發(fā)明的最佳方法中，把DNA順序施加于微粒的方法、把微粒作為一層敷設(shè)在承載板上的方法以及制備植物轉(zhuǎn)化用的DNA的方法都可要求特別注意。這些細(xì)節(jié)將一一進(jìn)行討論。
DNA順序包括以適合于植物轉(zhuǎn)化的形式制備的外來(lái)基因，可簡(jiǎn)單地在裸露金或者鎢丸上干燥。其他的金屬材料或它們的合金也可應(yīng)用?？梢愿哌_(dá)(或超過(guò))每毫克金小球含有30微克DNA的任何比例把DNA涂載在微粒上。必須將100微克DNA和30毫克1-3微米金球，連續(xù)地加至5微升10mMNa2HPO4中，然后是5微升10mMCaCl2，當(dāng)溶液干燥時(shí)形成細(xì)的CaHPO4沉淀物，。該淀沉物把與它一起的DNA帶到小球上。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在一些情況下，把EDTA加入懸浮液中是有利的，但其原因尚未完全弄清。一旦小球和磷酸鹽和氯化鈣的溶液與DNA混合，則懸浮液在氮?dú)饬髦胁粩鄶嚢柘赂稍?。一旦干燥，片狀沉淀物立刻再懸浮?00%乙醇中，作為把微粒放置在承載板上的方法。
在把微粒施加到承載板中時(shí)，作為這種工藝的成功的操作，最好是在承載板上形成均勻且可再現(xiàn)的載體微粒層。為此，微粒不能簡(jiǎn)單地撒在承載板上，因?yàn)樗鼈儠?huì)聚集，從而以不可再現(xiàn)的方式不均勻地分布在板上。具體地說(shuō)，板上水份或者水份含量將破壞微粒應(yīng)用到板上并導(dǎo)致不希望的聚集。把含有DNA鏈沉淀涂層的載體微粒懸浮在100%乙醇中，再施加到承載板上。以合適的均勻和可再現(xiàn)的方式成功地把乙醇與載體微粒的經(jīng)充分?jǐn)嚢璧膽腋∫阂埔旱骄埘ケ∧ぐ迳?。然后，使這種懸浮液的吸移部分安置在封閉的陪替氏培養(yǎng)皿中至少30秒鐘。陪替氏培養(yǎng)皿必須密閉，以防室內(nèi)空氣流和從快速蒸發(fā)而引起的渦流，這種渦流可能會(huì)引起微粒過(guò)分偏移，致使微粒在板上呈不均勻分布。在放置期之后，無(wú)液而被破壞，排除多余的乙醇。在局部打開(kāi)的陪替氏培養(yǎng)皿中蒸發(fā)去除殘存的乙醇。
這種方法旨在把含有DNA鏈的沉淀涂覆的載體微粒放置在聚酯薄膜承載板上。本發(fā)明中成功地發(fā)現(xiàn)，正好中間的速度約為在每平方厘米承載板施加0.1毫克帶沉淀DNA的載體微粒。承載板上用這種密度的載體微粒可使得處理組織很好地存活，還可使加速微粒具有高的組織細(xì)胞的穿透性。微粒對(duì)細(xì)胞的實(shí)際加速和穿透力二者將隨欲處理的組織而變化，顯然可以改變載體微粒數(shù)目，按需要給靶細(xì)胞的每個(gè)橫截面積多少微粒。
在本發(fā)明中所用的DNA通常被構(gòu)成一個(gè)適合表達(dá)大豆的或者本發(fā)明中用的其他植物的細(xì)胞中的外生或異種基因產(chǎn)物的載體之中。在由來(lái)自不同機(jī)體的DNA順序構(gòu)成的意義上，DNA順序可以是嵌合的，但也可以采用來(lái)自其他植物種或相同種系的完全完整的非嵌合基因。適合于植物中表達(dá)的載體，除所要求的外生或異種基因的編碼順序之外，一般來(lái)說(shuō)必須包括合適的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序，例如能夠促進(jìn)在植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的合適的啟動(dòng)子，能夠使轉(zhuǎn)錄末端發(fā)出轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的信號(hào)。以及如果要求蛋白合成時(shí)適合于終止信使翻譯的翻譯終止區(qū)。蛋白質(zhì)合成并非是始終要調(diào)節(jié)植物中的表型變化的條件。詳見(jiàn)McCormick等人的EPO.Appl.022399。上面業(yè)已說(shuō)明，在典型的種中能夠引起編碼順序轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的一般植物基因啟動(dòng)子在大多數(shù)植物中也是有效的。Fromm等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》，825824-5828，1985年9月。這種啟動(dòng)子包括來(lái)自植物病原體根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的藍(lán)曙紅合成酶啟動(dòng)子和由花椰菜鑲嵌病毒順序衍生的CaMV35s啟動(dòng)子。植物中起作用的合適的終止順序是來(lái)自根癌土壤桿菌藍(lán)曙紅合成酶基因的多腺苷酸順序。植物表達(dá)載體也可含有在植物細(xì)胞中起作用的用于選擇轉(zhuǎn)化突變型植物的可選擇標(biāo)記物?？蛇x擇的標(biāo)記物可以決定可作生化上測(cè)定的特征或者可在后代植物中可以觀察到的表型特征。顯然，如果本發(fā)明采用來(lái)自相同或者別的植物且具有側(cè)翼調(diào)節(jié)順序的非嵌合整體基因，則嵌合啟動(dòng)子或者控制順序并非必要而可用具有其天然順序的基因。
因?yàn)椴⒎撬械闹参锛?xì)胞均有插入它們中的載體微粒，還因?yàn)椴⒎撬械闹参锛?xì)胞或者后代細(xì)胞均將吸收DNA進(jìn)入它們的基因組中，故而必需在某些階段篩選后代植物，以選擇轉(zhuǎn)化突變型。如果要求把特定的外來(lái)基因轉(zhuǎn)入一種植物中，則可把該基因插入嵌合的表達(dá)載體中。然后，應(yīng)把嵌合的表達(dá)載體與可選擇的標(biāo)記物質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，例如下文所述的pCMC1022。兩種載體(外來(lái)基因和可選擇的標(biāo)記物)連接在一起制成一個(gè)質(zhì)粒，或者可以分別克隆兩種載體，然后一起施加于相同的載體微粒上。在上述任何一種情況下，產(chǎn)生的后代均要按標(biāo)記物篩選，以選擇已轉(zhuǎn)化的后代。雖然在某些情況下應(yīng)用這種可選擇的標(biāo)記物是需要的，但如果有一種可用于合適的形態(tài)鑒別或生化試驗(yàn)，篩選已轉(zhuǎn)化的后代，則可以省略。形態(tài)學(xué)篩選試驗(yàn)可在后代中的重要表觀特性中檢查，合適的生化篩選試驗(yàn)應(yīng)是一種所謂“Southern”斑點(diǎn)雜交法，用于探測(cè)后代植物的基因組中轉(zhuǎn)化DNA本身的存在。如果植物轉(zhuǎn)化的頻率是足夠高，如本文所揭示的那樣，檢驗(yàn)可以轉(zhuǎn)化的組織中存在外來(lái)基因?qū)嶋H上可以通過(guò)這種生化分析，或者通過(guò)一種用于探測(cè)基因本身存在的探針來(lái)完成，而不需要可選擇的或者可篩選的標(biāo)記物。
檢驗(yàn)植物轉(zhuǎn)化和表達(dá)的有用的典型模型基因包括作為氨基糖苷-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(APH3′II)(還被稱(chēng)之新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)的基因和來(lái)自E.col.的大腸桿菌β-葡糖苷酸酶(gus)基因。APH3′Ⅱ基因決定了諸如卡那霉素的氨基糖苷抗生素抗性。gus基因?yàn)槊妇幋a，在一種組織-分解特性中，這樣的名稱(chēng)的酶將轉(zhuǎn)為一底物，靛藍(lán)一葡糖苷酸或者5-溴代-4-氯代-3-吲哚基葡糖苷酸，在植物組織原位中呈藍(lán)色。
大豆的許多轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)已證明，可以以大大高于穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)化的頻率的一頻率達(dá)到非表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。因?yàn)榻Y(jié)果尚未表明實(shí)際的抗生素抗性選擇技術(shù)在大豆中證明是有效的，生化檢驗(yàn)，例如酶分析或者Southern斑點(diǎn)法，可以被要求來(lái)檢驗(yàn)表達(dá)和轉(zhuǎn)化。由于所要求的一些情況可能是低頻率的并且校正這些情況的檢驗(yàn)可能是較麻煩的，故而就要研究一些極大地提高在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá)頻率的技術(shù)。本文中所用的一種技術(shù)首先在于建立經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆原生質(zhì)體，它們或者通過(guò)電處理(electroporation)或者通過(guò)微粒加速轉(zhuǎn)化。采用APH3′Ⅱ基因可以較迅速地完成，因?yàn)榇罅吭|(zhì)體可被篩選以及因?yàn)榭梢砸钥敲顾乜剐赃x擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的大豆原生質(zhì)體，但尚沒(méi)有一種技術(shù)表明在經(jīng)分化的組織中是有效的。然后，可以使經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和表達(dá)大豆的原生質(zhì)體形成愈傷組織培養(yǎng)而成多個(gè)它們的組織體。爾后，可提取、消化自這種胼胝質(zhì)中的DNA以及把它轉(zhuǎn)化成可再生的大豆組織。這種技術(shù)已導(dǎo)致完整的經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的和表達(dá)成熟的多產(chǎn)的大豆植物。
實(shí)例1載體的構(gòu)造A.耐抗生素性合適的植物表達(dá)載體的構(gòu)造在圖5和圖6的流程中已列舉了。圖5以流程的形式列舉了植物表達(dá)載體pCMC1208的構(gòu)造，而圖6則列舉了載體pCMC1022的構(gòu)造。質(zhì)粒pCMC1208的構(gòu)造是采用限制性核酸內(nèi)切酶TaqⅠ消化質(zhì)粒pBR325[Bolivar，F(xiàn).《Gene》4121-136(1978)]而開(kāi)始的。質(zhì)粒pBR325含有編碼耐抗生素基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的順序，它從被TaqⅠ消化后的質(zhì)粒殘余物中被切出。在pBR325被消化后，片段在瓊脂糖凝膠上電泳而分離，含有CAT基因的片段被切出。然后將CAT片斷連接到已經(jīng)用限制酶AccⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pUC9中[Viera&Messing，《Gene》19259-268(1982)]。在該情況下由TaqⅠ和AccⅠ產(chǎn)生的片段的末端是互補(bǔ)的，所以，鏈可以直接地連接。所得到的質(zhì)粒在圖5中指定為pUC-CAT，它含有位于pUC9聚合銜接物的一部分側(cè)翼的CAT編碼順序。用PstⅠ和BamHⅠ消化該質(zhì)粒后，通過(guò)凝膠電泳將兩個(gè)片段中較小的一個(gè)分離出來(lái)。然后將該片段連接到事先已經(jīng)用PstⅠ和BamHⅠ消化過(guò)了的中間植物表達(dá)載體pCMC66中，形成CAT表達(dá)質(zhì)粒pCMC1205。質(zhì)粒pCMC66含有根癌病土壤桿菌的藍(lán)曙紅合成酶啟動(dòng)區(qū)(NosPr)和同樣的生物體中的藍(lán)曙紅合成酶多聚腺苷酸順序(PolyA)，后者包括6個(gè)單一性質(zhì)粒限制位點(diǎn)。質(zhì)粒pCMC66還含有在細(xì)菌中表達(dá)耐受抗生素氨芐青霉素性的β-內(nèi)酰胺酶基因(bla)的譯本，因此，耐氨芐青霉素性可用作在大腸桿菌中進(jìn)行以后的重組時(shí)的選擇性標(biāo)記。
用StuⅠ消化質(zhì)粒pCaMV10[Gardner等，《Nucl.Acids.Res.》92871-2888(1981)]，含有花椰菜嵌合體病毒35啟動(dòng)區(qū)(CaMV35s)的片段被結(jié)合到合成的XhoⅠ寡核苷酸銜接物中。然后，用HphⅠ消化該片段，用DNA聚合酶處理它而產(chǎn)生飩端，然后，聯(lián)接到合成HindⅢ寡聚核苷酸銜接物中。用XhoⅠ和HindⅢ消化該片斷得到一個(gè)含有CaMV35s啟動(dòng)區(qū)和其鈍端被加入的限制位點(diǎn)順序修飾的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的片段。
通過(guò)用XhoⅠ和HindⅢ消化質(zhì)粒而從pCMC1205中切出藍(lán)曙紅合成酶啟動(dòng)區(qū)。用CaMV35s啟動(dòng)區(qū)片段連接所得到的兩個(gè)片斷中大的一個(gè)而得到pCMC1208，它是一個(gè)依次具有CaMV35s啟動(dòng)區(qū)、CAT編碼順序和藍(lán)曙紅合成酶多聚腺苷酸順序的植物表達(dá)載體。CaMV35s啟動(dòng)區(qū)和藍(lán)曙紅合成酶多聚腺苷酸順序可作為CAT編碼順序的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序。
質(zhì)粒pCMC1205和pCMC1208通過(guò)電處理到原生質(zhì)體中而在玉米和大豆中進(jìn)行活性檢驗(yàn)，然后測(cè)定CAT活性。兩種構(gòu)造在玉米細(xì)胞中都確證表示出活性，但pCMC1208所表示出的活性水平明顯地較高，因此，它被選用于植物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。但是，已經(jīng)確定可選擇的標(biāo)記APH3′Ⅱ提供了更有前途的轉(zhuǎn)化突變型選擇，因此，pCMC1208不用于大豆細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
質(zhì)粒pCMC1021含有藍(lán)曙紅合成酶啟動(dòng)區(qū)和位于編碼酶-氨基糖苷-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(APH3′Ⅱ)的區(qū)域側(cè)翼的藍(lán)曙紅合成酶多腺苷酸順序，APH3′Ⅱ決定了它可耐氨基糖苷類(lèi)抗生素，如卡那霉素。因?yàn)殡娞幚韺?shí)驗(yàn)顯示出在植物細(xì)胞中CaMV35s要比NosPr(藍(lán)曙紅合成酶啟動(dòng)區(qū))有效得多，所以決定將CaMV35s啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)移到pCMC1021中。如圖3所列舉的從pCMC1208中得到的CaMV35s通過(guò)XhoⅠ和HinⅢ消化而被分離，分離是通過(guò)電泳進(jìn)行的。質(zhì)粒pCMC1021也用XhoⅠ和HindⅢ消化，分離出較大的片段，并將它與CaMV35s片段相連接而得到pCMC1022。在質(zhì)粒pCMC1022中，APH3′Ⅱ編碼順序位于調(diào)節(jié)CaMV35s和藍(lán)曙紅合成酶多聚腺苷酸順序的側(cè)翼。
通過(guò)電處理轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)分析表明質(zhì)粒pCMC1022對(duì)于在各種植物品種的單個(gè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)是有效的。在具有APH3′Ⅱ的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞已顯示出可用于幾個(gè)品種，包括大豆中耐卡那霉素的品種。
A.蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記在生物樣品中蟲(chóng)熒光素酶的存在可以通過(guò)它的反應(yīng)產(chǎn)物是發(fā)光的特征來(lái)檢驗(yàn)。編碼熒火蟲(chóng)熒光素酶的基因是非常有效的，這里它被用作pDO432的檢測(cè)物，如Ow等，《Science》234856-859(1986)中描述的。該質(zhì)粒是含有由花椰菜鑲嵌體病毒的35s啟動(dòng)區(qū)的5′到3′順序所組成的可表達(dá)植物的嵌合基因、編碼未轉(zhuǎn)譯熒光蟲(chóng)熒光素酶mRNA片段的約85個(gè)堿基對(duì)順序、熒火蟲(chóng)熒光素酶的氨基酸編碼區(qū)、編碼3′未轉(zhuǎn)譯mRNA的熒光蟲(chóng)基因組DNA區(qū)、熒火蟲(chóng)熒光素酶基因的多聚腺苷酸順序、編碼羧基末端的DNA順序和藍(lán)曙紅合成酶基因的多聚腺苷酸區(qū)的質(zhì)粒載體pUC19的構(gòu)造物。
在圖7所列舉的方法中所使用的制備熒光素表達(dá)質(zhì)粒pAMVFF的另一個(gè)質(zhì)粒是質(zhì)粒pAMVBTS。質(zhì)粒pAMVBTS在ATCC的保藏號(hào)為53637，它含有包括(順序的5′到3′)35s花椰菜鑲嵌體病毒啟動(dòng)區(qū)、編碼苜?；ㄈ~病毒(AMV)被膜蛋白質(zhì)mRNA5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)的合成DNA片段、編碼蘇云金桿菌Δ-內(nèi)毒素的氨基末端部分的DNA片段和編碼根癌土壤桿菌菌株A208的藍(lán)曙紅合成酶基因的多腺苷酸區(qū)的片段的可表達(dá)植物的嵌合基因。
質(zhì)粒pAMVFF是由三個(gè)DNA片段所組成的結(jié)構(gòu)(1)從pAMVBTS得到的無(wú)毒素編碼區(qū)的載體，(2)與熒火蟲(chóng)熒光素酶基因的氨基末端相對(duì)應(yīng)的合成寡核苷酸，和(3)從pDO432中得到的蟲(chóng)熒光素酶編碼區(qū)的主要部分。
用限制酶NcoⅠ和XcyⅠ消化質(zhì)粒pAMVBTS而從載體中分離BT編碼區(qū)。NcoⅠ在這個(gè)質(zhì)粒上，在苜?；ㄈ~病毒5′頂端和在NcoⅠ識(shí)別順序內(nèi)的啟動(dòng)密碼子(ATG)之間切割一次。XcyⅠ在與位于BT毒素編碼區(qū)的末端和多聚腺苷酸區(qū)的連接位置上的SmaⅠ相同的識(shí)別位點(diǎn)上切開(kāi)，該位點(diǎn)也是該質(zhì)粒上的唯一的位點(diǎn)。消化后的DNA采用瓊脂糖凝膠電泳分離。從用溴化3，8，-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶鎓染色的1.8kb(千堿基對(duì))BT毒素編區(qū)中純化得到2.5kb的載體，切出染色的載體帶，并電洗脫。結(jié)果是一個(gè)具有NcoⅠ和XcyⅠ粘性末端的純化的AMV載體。
質(zhì)粒pDO432中，在熒火蟲(chóng)熒光素酶多腺苷酸區(qū)的后面有一個(gè)XcyⅠ(或SmaⅠ)位點(diǎn)，該位點(diǎn)適用于分離編碼區(qū)的3′末端。但是，啟動(dòng)順序不易受NcoⅠ消化的影響，因此用XcyⅠ和XbaⅠ消化的質(zhì)粒pDO432就從編碼區(qū)的氨基末端切出48個(gè)核苷酸。1761個(gè)堿基對(duì)的片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離出來(lái)，切割并電洗脫。
編碼區(qū)漏失的堿基對(duì)可由具有NcoⅠ和XbaⅠ粘性末端的合成寡核苷酸提供。合成的雙鏈寡核苷酸如下NcoⅠXbaⅠ5′-CATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCT-3′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′3′-CTTCTGCGGTTTTTGTATTTCTTTCCGGGCCGCGGTAAGATAGGAGATC-5′密碼子1234567891011121314151617將三種片段等摩爾量結(jié)合并連接。連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株MM294中并用氨芐青霉素選擇。用限制酶圖解小型制備的DNA并使合成的寡核苷酸順序化證實(shí)了預(yù)見(jiàn)的順序的秩序。
最終的pAMVFF是一種在大腸桿菌中可以復(fù)制的耐氨芐青霉素質(zhì)粒，它含有包括(依照從5′到3′的順序)CaMV的35s單位的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)、編碼AMV5′未轉(zhuǎn)譯頂端順序的合成DNA、從熒火蟲(chóng)熒光素酶中得到的完全編碼區(qū)和多腺苷酸區(qū)和土壤桿菌中的藍(lán)曙紅合成酶基因的多腺苷酸區(qū)的可表達(dá)植物的基因。
C.葡糖苷酸酶(Gus)基因質(zhì)粒pCMC1100被構(gòu)造以在植物細(xì)胞中指導(dǎo)β-葡糖苷酸酶(或稱(chēng)gus)的表達(dá)。如上所述，植物表達(dá)質(zhì)粒pCMC1100系從植物表達(dá)載體pAMVBts和載體pRAJ275中構(gòu)成。gus基因可廣泛地獲得，并由Dr.RichardJefferson以質(zhì)粒pRAJ275的形式提供。質(zhì)粒含有一個(gè)被修飾以在啟動(dòng)密碼子(ATG)處提供一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn)(即CCATGG)的gus編碼順序，并包括在gus編碼區(qū)的下游的一個(gè)單一的EcoⅠ位點(diǎn)。
為了從pRAJ275中制備pCMC1100，如圖8中所列舉的，可用EcoRⅠ消化質(zhì)粒pRAJ275，然后，在所有四種dNTP′s存在下，通過(guò)用T4DNA聚合酶將EcoRⅠ粘性末端進(jìn)行末端鈍化。然后，將合成PstⅠ銜接物連接到DNA的鈍端。而后用PstⅠ和NcoⅠ消化所得到的分子至完全，含有g(shù)us編碼區(qū)的片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。
通過(guò)NcoⅠ和PstⅠ消化而制備質(zhì)粒pAMVBts，片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離以純化較大的片斷。然后，在T4DNA連接酶存在下用gus編碼區(qū)片段將該片段連接起來(lái)，得到pCMC1100。所得到的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過(guò)限制性基因定位證實(shí)了修正質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了在大豆和煙草原生質(zhì)體中嵌合gus表達(dá)基因的活性。質(zhì)粒pCMC1100的樣品已保藏于ATCC中，保藏號(hào)為67641。
通過(guò)比色法和熒光法分析可分析出gus基因的存在。進(jìn)行比色分色分析時(shí)，組織或細(xì)胞首先用戊二醛固定，然后在含有1mM X-葡聚糖(Clontech實(shí)驗(yàn)室)、0.1M NaHPO4(PH-7.0)、0.5mM氰亞鐵酸鉀的溶液中浸漬。然后將組織在37℃培養(yǎng)24小時(shí)，在乳酸苯酚脂中沸騰凈化并檢驗(yàn)靛藍(lán)沉淀物。
實(shí)例2原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化從暖房里生長(zhǎng)的Williams82、MandarinOttawa和Hardin品種的大豆植物中切出4-8毫米合子的胚胎。
為了制備原生質(zhì)體，將胚切碎并進(jìn)行質(zhì)壁分離，然后于室溫下在纖維素酶混合物中培養(yǎng)4-5小時(shí)。將混合物通過(guò)54微米鋼絲篩網(wǎng)過(guò)篩，篩出物被清洗和重新懸浮。
在圖1所示設(shè)備中，用裝載pCMC1022的金球“轟擊”組織。70微克pCMC1022(在蒸餾水中為1mg/ml)被懸浮于3.5mg1-5微米的金球中(Alfa化學(xué)公司)并在N2氣流中干燥。干燥的涂覆的小球重新懸浮于100%的乙醇中。162微升金/DNA懸浮液鋪展在18mm×18mm涂覆鍍鋁聚酯薄膜的1/2密耳厚的莎綸上。最終的金密度為0.05-0.1mg/cm2。間隔圈16的高度為15mm，在它上方5mm處固定一個(gè)篩網(wǎng)20?！鞍凶印笔窃?%水瓊脂Petri培養(yǎng)皿中的胚胎組，培養(yǎng)皿倒置于篩網(wǎng)的上方。在放電前，裝置抽真空至500mm汞柱。
胚被“轟擊”，然后在一些復(fù)制物中原生質(zhì)體化，胚被部分原生質(zhì)體化，然后在其它復(fù)制物中被“轟擊”。在兩種情況下，對(duì)所得到的原生質(zhì)體均進(jìn)行金微粒存在的檢驗(yàn)，并將其鋪在卡那霉素選擇培養(yǎng)基(50mg/l卡那霉素)平板上。2-3星期出現(xiàn)最初的耐卡那霉素菌落，6-8星期時(shí)繼續(xù)出現(xiàn)。組織被放大至足夠進(jìn)行酶和基因雜交分析。
在所有菌落中都證實(shí)了酶活性和外來(lái)基因(APH3′Ⅱ)的存在，盡管酶表達(dá)的水平變化大于5倍。對(duì)被“猛烈轟擊”的部分原生質(zhì)體化的組織中得到的原生質(zhì)體進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)10個(gè)原生質(zhì)體中約有一個(gè)含有金球。被“轟擊”的組織作為胚，然后原生質(zhì)體化，每一千個(gè)原生質(zhì)體中有5個(gè)含有一個(gè)或多個(gè)金微粒。而用兩者中任何一個(gè)方法轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中，10個(gè)原生質(zhì)體中約1個(gè)產(chǎn)生了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化的耐卡那霉素胼胝。
實(shí)例3轉(zhuǎn)化合子胚胎一定量用作為載體微粒的1-3微米的金球通過(guò)在0.02%多聚賴(lài)氨酸中漂洗并空氣干燥而預(yù)覆蓋多聚賴(lài)氨酸。將225微克經(jīng)PvuⅠ消化而線性化的pCMC1022DNA置于已加入有35mg已涂覆的金球的水溶液中，然后連續(xù)加入22微升10mM Na2HPO4和22微升10mM CaCl2，在溶液中所形成的微細(xì)沉淀物在氮?dú)饬髦懈稍?。?jīng)干燥的沉淀物涂覆小球而后重新懸浮于100%的乙醇中，并沉積到2.0密耳的塑料涂覆鍍鋁聚酯薄膜板上，沉積層約9-11mm。在聚酯薄膜載體片上經(jīng)涂覆的金球的最終密度為0.2mg/cm2。
攜有經(jīng)涂覆的小球的載體板被安裝于圖2的設(shè)備的間隔圈16上。從MandarinOttawa、Williams和Hardin種系分離的合子胚胎的大豆組織從授粉后15-25天的未成熟大豆莢中切出。60mmPetri培養(yǎng)皿的底部填入1%水瓊脂的配方。對(duì)胚進(jìn)行表面消毒并鋪展于Petri培養(yǎng)皿的瓊脂的上面。在圖2的設(shè)備中，Petri培養(yǎng)皿被用作為“靶子”的表面22。
向裝配設(shè)備提供500mmHg的真空度。通過(guò)電極114從2微法電容器中釋放出24KV的放電量，它可加速在“靶子”表面22上的大豆胚中的經(jīng)涂覆的微粒。
制備小球和胚胎以及“引爆”圖2的設(shè)備的過(guò)程重復(fù)數(shù)次，直到累積了足量的處理的胚為止。從瓊脂表面移出胚并置于平板上進(jìn)行器官發(fā)生的操作。所用的技術(shù)是如Barwhale等，《Planta》176473-481(1986)中所描述的。未選擇所用壓力。
將這種方法所得到的小植株分成四組，每組25株植物，其中二組植物進(jìn)行APH-3′Ⅱ活性分析。犧牲該二組中每一組的植物，所有的植物組織集中起來(lái)以得到足夠的分析用的組織。要集中后的樣品的兩組中均檢測(cè)到弱的APH-3′Ⅱ陽(yáng)性信號(hào)，這表明至少有一部分小植株轉(zhuǎn)化了和表達(dá)了引入DNA。
一個(gè)月后，對(duì)從該兩組小植株中分離出來(lái)的DNA的pCMC1022順序的存在進(jìn)行了分析，采用Southern雜交技術(shù)。Southern，《J.Mol.Bio》98503-577(1975)。從對(duì)照的及測(cè)試的大豆組織的樣品中分離DNA并通過(guò)Taylor和Powell，《Focus》4∶4～6(1982)的鯨蠟基-三甲基溴化銨過(guò)程微修飾。每一DNA樣品中的10微克用限制酶AvaⅠ消化，在瓊酯糖凝膠上電泳分離，轉(zhuǎn)移到尼龍薄膜上，用一個(gè)與APH-3′Ⅱ編碼區(qū)的非編碼鏈相應(yīng)的32P-標(biāo)記探針與之雜交。洗滌過(guò)濾物后，通過(guò)放射性自顯影肉眼可看見(jiàn)雜交的DNA片段。兩組植物中的植物顯示出攜帶pCMC1022DNA。兩組小植株均呈現(xiàn)出表示出相似大小片斷的Southern斑點(diǎn)帶，盡管帶的強(qiáng)度在兩組之間有所不同。而未經(jīng)歷微粒加速的對(duì)照組織顯示出無(wú)APH-3′Ⅱ活性且無(wú)相應(yīng)的Southern斑點(diǎn)帶。
實(shí)施例4采用胚胎發(fā)生進(jìn)行再生采用由PvuⅠ線性化的APH-3′Ⅱ表達(dá)的質(zhì)粒pCMC1022和環(huán)熒光素酶表達(dá)的質(zhì)粒pAMVFF重復(fù)上述過(guò)程。為了進(jìn)行重復(fù)，將所切出的合子胚胎在轉(zhuǎn)化過(guò)程之前先在由Ranch等，《InVitroCellularandDevelopmentalBiology》2111，653-658(1985)描述的體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。加速器110在13KV的放電電壓下使用。每毫克金上載有的DNA量分別為10微克、0.1微克和0.0001微克。1密耳厚的載體每平方厘米上負(fù)載0.5毫克小球(帶有DNA)。植物通過(guò)胚胎發(fā)生和器官發(fā)生而再生。DNA從用pCM1022轉(zhuǎn)化的最終的完整的植物中抽提出來(lái)，并用Southern斑點(diǎn)法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外來(lái)DNA存在并并入到植物基因組。
實(shí)施例5采用熒光素酶的轉(zhuǎn)化從合子胚胎中解剖50個(gè)胚軸并采用熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pAMVFF，以實(shí)例2中描述的方法進(jìn)行以微粒為媒介的轉(zhuǎn)化。小植株通過(guò)器官發(fā)生而再生，并進(jìn)行熒光素酶的分解代射分析。熒光素酶的活性可采用光度計(jì)在轉(zhuǎn)化的組織中進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)例6胚分生組織的轉(zhuǎn)化栽培的Williams82的大豆外植體是從未成熟種子的胚軸中切出的分生組織中得到的。將初生葉移出，外植體鋪展于含有1%水瓊脂的靶平板上。
如實(shí)例3所述的，將pCMC1100DNA的1.0～0.001微克的量載于每毫克小球上而進(jìn)行外植體轉(zhuǎn)化。微粒加速器被在13-16KV下充電。每平方厘米的載體上載有0.05～0.40毫克負(fù)荷小球。較佳的載量水平為每平方厘米0.2毫克。
然后將外植體在黑暗中平鋪于采用Barwhale等，《Planta》167，473-481(1981)中所修飾的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基具有較高水平的細(xì)胞激動(dòng)素芐氨基嘌呤，即13.3微摩爾。然后在黑暗中培養(yǎng)1～2周，組織被轉(zhuǎn)移到較低細(xì)胞激動(dòng)素水平(1.7微摩爾)的同樣的培養(yǎng)基上以促進(jìn)芽伸長(zhǎng)。所得到的芽高度為0.5～1cm。在2～4個(gè)月內(nèi)，每株外植體上回收3～8株芽。
轉(zhuǎn)化所擬的方案的相應(yīng)的成功可以通過(guò)在每一階段中固定轉(zhuǎn)化的外植體以測(cè)定gus活性而得到證實(shí)。在DNA微粒注射后兩天，在每一外植體中可檢測(cè)到典型的12個(gè)gus活性細(xì)胞。但是，很多gus表達(dá)細(xì)胞不能分割或?qū)⑵涮匦再x予子細(xì)胞。6～8星期時(shí)，植物中可以進(jìn)行芽中的gus活性分析。100株植物中約有一株分析為陽(yáng)性，它至少有一個(gè)表明gus活性的藍(lán)色條紋。具有藍(lán)色條紋(即gus)的組織以及其他未轉(zhuǎn)化或未表達(dá)的組織的部份的大多數(shù)植物是嵌合的。
實(shí)例7胚分生組織的轉(zhuǎn)化Williams82品種在大豆外植體通過(guò)從未成熟種子中移出未成熟胚胎而產(chǎn)生。胚軸被鋪展并通過(guò)顆粒加速器，以上述實(shí)例6的方法，使用質(zhì)粒pAcX1100進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
質(zhì)粒pAcX1100是首先用XhoⅠ和Sal消化pCMC1100至完全并分離出含有嵌合的gus表達(dá)基因的片段而構(gòu)成的。然后，將該片段連接到pAC3上的XhoⅠ位點(diǎn)。質(zhì)粒pAc3是由N.Federoff提供的Ac轉(zhuǎn)座子的獨(dú)立分離體，它被假定與由Federoff等《Cell》35235-242(1983)中描述的質(zhì)粒pAc9相同。質(zhì)粒pAc3包括一個(gè)從玉米中分離出來(lái)的活性Ac元素的完整拷貝，在大腸桿菌載體中，它可進(jìn)行耐四環(huán)素的特性選擇。在pAc3中的XhoⅠ位點(diǎn)是在Ac元素內(nèi)部的。通過(guò)T4-DNA連接酶催化反應(yīng)可將gus基因結(jié)構(gòu)連接到pAc3中。所得到的指定為pAc×1100的質(zhì)粒的活性通過(guò)以微粒為媒介轉(zhuǎn)化到玉米和大豆胼胝中，隨后分析gus活性而證實(shí)。
在該轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒pAc3和pAc×1100兩者的DNA以0.01μg/mg的密度載于金球上。0.1微克的每一種質(zhì)粒加入到10mg金球中，然后在N2干燥前，加入2微升0.2MEDTA。然后，將干燥的小球重新懸浮于乙醇中，并加速射到分生組織鋪展的胚中。從所得的分生組織中生出的早期芽鋪展于高細(xì)胞激動(dòng)素培養(yǎng)基中并經(jīng)破壞以分析gus活性。這樣的20株芽中，一株是完全藍(lán)色的，表明在所有它的組織中的gus表達(dá)。因此，這株芽被視為完全轉(zhuǎn)化并不是嵌合的。
實(shí)例8成熟幼苗的轉(zhuǎn)化將Williams品種的大豆種子在加有羧芐青霉素(0.4g/l)、氨噻肟頭孢菌素(Cefotaxime)(0.1g/l)、Bravo(0.1g/l)、Benomyl(0.1g/l)、(Maneb(0.1g/l)和Captan(0.1g/l)的無(wú)菌蒸餾水中浸泡24小時(shí)。然后移去種子外殼和一個(gè)子葉以暴露胚軸，胚軸是與保留下來(lái)的子葉相連接的。解剖暴露的葉舌和初生葉并移去大部分保留下來(lái)的子葉(約75%)。然后，將組織置于“靶子”平板上，分生組織面向上，蒸餾水中采用8%蒼耳烷膠。
然后，通過(guò)將pCMC1100以1微克DNA/10毫克球的比率載于金球上，且涂覆后的球以0.1mg/cm2的量載于載體上的微粒加速而進(jìn)行組織轉(zhuǎn)化。
然后，進(jìn)行微粒注射，解剖出來(lái)的幼苗在無(wú)菌條件下出芽3天，然后，種植到暖房里。微粒注射后24天，對(duì)幼苗進(jìn)行g(shù)us活性分析。
在植物的部分細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)靛藍(lán)色表明幾株幼苗具有g(shù)us表達(dá)區(qū)。觀察到最多的是在每一末節(jié)終止的莖上的結(jié)節(jié)之間的區(qū)，但也發(fā)現(xiàn)了表達(dá)葉子區(qū)。所有表達(dá)的植物被觀察到均是嵌合的，所指的用于植物的“嵌合”意味在同一株植物中一些細(xì)胞和組織通常不同于另外的細(xì)胞和組織，如外來(lái)基因表達(dá)時(shí)所表明的。
這個(gè)實(shí)例表明在成熟幼苗中轉(zhuǎn)化的分生組織細(xì)胞可用作為轉(zhuǎn)化“靶子”，因此，已經(jīng)過(guò)分生組織這樣轉(zhuǎn)化的幼苗可以由通常的植物配偶載培為成熟植物，盡管它是嵌合的。
實(shí)例9分生組織的轉(zhuǎn)化和傳遞給后代Mandarin品種轉(zhuǎn)化的和表達(dá)大豆原生質(zhì)體是以實(shí)例2所述的方法，使用pCMC1022而得到的。從卡那霉素上衍生得具有一定量APH-3′Ⅱ表達(dá)組織的胼胝培養(yǎng)物，將組織破壞，并從胼胝細(xì)胞回收DNA。
從六個(gè)不同的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的胼胝培養(yǎng)物的每一個(gè)中可得到約10微克DNA。用BamHⅠ完全消化每一胼胝品系的總的基因DNA以確定DNA塊的大小。完全消化由微型凝膠驗(yàn)證。因?yàn)樵趐CMC1022中無(wú)BamHⅠ位點(diǎn)，所以可選擇限制酶BamHⅠ。然后用苯酚氯仿抽提樣品，并用乙酸銨和乙醇將樣品沉淀(二次)，在0.8%瓊脂糖電泳凝膠上劃分大小。然后根據(jù)由控制線所決定的大小將溴化3.8二氨基-5-乙基-6苯基菲啶鎓染色的凝膠切成塊。將3.5～10千堿基對(duì)和10～23千堿基對(duì)的兩部分收集，通過(guò)電洗脫將DNA從凝膠中洗脫出來(lái)。然后通過(guò)有機(jī)抽提以除去瓊脂糖而對(duì)每一樣品純化。在用乙酸銨和乙醇進(jìn)行二次沉淀后，制得可用于以微粒為媒介轉(zhuǎn)化的DNA。
大豆分生組織外植體被得到并以實(shí)例7的方法，通過(guò)DNA涂覆的微粒加速被轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化前先將分生組織在高細(xì)胞激動(dòng)素含量的培養(yǎng)基(Barwhale等，supra)中預(yù)培養(yǎng)。并除去子葉。
被認(rèn)定為轉(zhuǎn)化的分生組織鋪展于高細(xì)胞激動(dòng)素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于黑暗中維持1～2周。然后，將它們轉(zhuǎn)移到低細(xì)胞激動(dòng)素培養(yǎng)基中并在光照(16小時(shí)光周期)下培養(yǎng)。結(jié)果從每一分生組織中得到多枝芽。沒(méi)有進(jìn)行耐卡那霉素的選擇。
當(dāng)芽長(zhǎng)到0.5～1.0cm高時(shí)，將它們嫁接到出芽約10天齡的大豆幼苗的根部。在嫁接前，它們先在1/2MS培養(yǎng)基上鍛煉1周。一旦建立足夠的植物組織，組織馬上進(jìn)行APH-3′Ⅱ活性的分解分析。五十株植物中有二株顯示出APH-3′Ⅱ活性。Southern斑點(diǎn)分析表明拷貝數(shù)小于一個(gè)基因/一個(gè)細(xì)胞。故認(rèn)為兩個(gè)植物均是嵌合的。
其組織經(jīng)APH-3′Ⅱ分析呈陽(yáng)性的一株植物成功地生長(zhǎng)到成熟。自身授花粉的植物和37顆種子被回收。從這些種子衍生的十株幼苗中有三株具有APH-3′Ⅱ活性。從這些種子所產(chǎn)生的幼苗中有兩株不能成長(zhǎng)為植物。一株形態(tài)正常的后代植物被產(chǎn)生。它的葉子組織仍然對(duì)APH-3′Ⅱ的分析呈陽(yáng)性。Southern斑點(diǎn)分析表明了在植物的基因組中的APH-3′Ⅱ編碼區(qū)的幾個(gè)拷貝。
上述結(jié)果證實(shí)了通過(guò)以微粒為介質(zhì)的分生組織可以穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化和成功地獲得表達(dá)大豆植物。再生的植物是嵌合的這個(gè)事實(shí)不阻礙獲得植物種系的轉(zhuǎn)化，與植物一樣長(zhǎng)的種系是能育的且它的自授花粉的后代中可預(yù)先篩選到引入的外源基因的存在。當(dāng)然，非嵌合性的再生植物也期望能產(chǎn)生基因突變的后代。
實(shí)例10胚分生組織的轉(zhuǎn)化Williams 82品種的大豆外植體是通過(guò)從未成熟種子中再一次切出未成熟胚而分離出來(lái)的。胚軸再被鋪展并通過(guò)實(shí)例8中所述的微粒加速而轉(zhuǎn)化，但這次使用質(zhì)粒pTVGus。為進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，在用N2干燥前，采用2微升EDTA和1微升50%甘油將DNA以0.1微克DNA對(duì)10毫克金球的比例與之相結(jié)合。
質(zhì)粒pTVGus是通過(guò)用XhoⅠ消化質(zhì)粒PCMC1100使之首先線性化而制備的。然后，將完全線性的質(zhì)粒連接到質(zhì)粒pTV4的XhoⅠ位點(diǎn)，pTV4是用于以土壤桿菌為媒介的植物轉(zhuǎn)化的嵌合植物表達(dá)載體，且包括一個(gè)固定于合成土壤桿菌T-DNA左邊緣和右邊緣區(qū)之間的嵌合的APH-3′Ⅱ基因結(jié)構(gòu)。從該連接中所得到的質(zhì)粒定為pTVGus，它包括表達(dá)APH-3′Ⅱ和gus的基因結(jié)構(gòu)。
50株芽被回收，如實(shí)例8所述的方法嫁接，并長(zhǎng)成正常形態(tài)的成熟的植物的大小。所有50株植物進(jìn)行APH-3′Ⅱ和gus活性的分析。有一株植物分析呈陽(yáng)性。植物的葉盤(pán)分析顯示了在植物中表達(dá)和非表達(dá)組織中，表明了所希望的嵌合。植物進(jìn)行自花授精，回收種子，它們中有一些有希望長(zhǎng)成轉(zhuǎn)化的植物。
實(shí)例11具有其他基因的pCMC1022的使用為了轉(zhuǎn)化插入到大豆或其他植物中的其他基因，可以幾種方法中的任何一種使用質(zhì)粒pCMC1022。APH-3′Ⅱ編碼順序可以通過(guò)用HindⅢ和BamHⅠ消化pCMC1022而缺失，其它的用于制備合適末端的插入基因順序可以在它的位置上連接。如果插入的基因可合適地選擇或通過(guò)普通的分析檢測(cè)，則質(zhì)粒可直接用于轉(zhuǎn)化。如果插入的基因被制備成具有合適的調(diào)節(jié)順序，且需要一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記，則具有調(diào)節(jié)順序的插入基因可以插入于pCMC1022的CAMV35s的聚合銜接物上游的任意位置。使用pCMC1022可檢測(cè)標(biāo)記的另一個(gè)選擇是在pCMC1022或在任何其他的植物表達(dá)載體上制備插入的基因，將涂覆的pCMC1022和基因表達(dá)載體一起置于微粒載體上，如本文所揭示的，以轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞。
如此制備的DNA可以直接用于切出的分生組織的轉(zhuǎn)化，或可以通過(guò)首先轉(zhuǎn)化到原生質(zhì)體中并從中回收而得以制備。然后，DNA可以采用上面所揭示的方法，通過(guò)微粒加速而插入分生組織。完全成熟的，有性成熟的植物(盡管可能是嵌合的)可以通過(guò)轉(zhuǎn)化的分生組織而生長(zhǎng)?；蛘哌M(jìn)行成熟的分生組織或幼苗的栽培或者通過(guò)切下的分生組織的再生。在任何情況下，從轉(zhuǎn)化中產(chǎn)生的可能嵌合的植物隨后可自授花粉以產(chǎn)生能夠承受Mendellian遺傳的外來(lái)基因的外源特性的基因突變的非嵌合后代。如所列舉的，該方法是不依賴(lài)于特殊的外來(lái)基因和栽培品種的，因此，要克服一些存在于以土壤桿菌為媒介的植物轉(zhuǎn)化中的問(wèn)題。
在任何轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記可轉(zhuǎn)化到具有感興趣的基因的植物中。如這里所揭示的，用于表達(dá)APH-3′Ⅱ的基因結(jié)構(gòu)、熒火蟲(chóng)熒光素酶和gus均能表達(dá)并在基因突變大豆植物細(xì)胞中起作用。如此通過(guò)構(gòu)造一個(gè)具有一個(gè)這樣的可檢測(cè)標(biāo)記，或者多個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記的感興趣的新基因的銜接結(jié)構(gòu)，則穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物和后代的存在的檢測(cè)可以通過(guò)標(biāo)記的檢測(cè)而達(dá)到。因?yàn)檗D(zhuǎn)化頻率表現(xiàn)為足夠高，所以實(shí)際使用一個(gè)這種可檢測(cè)的標(biāo)記篩選對(duì)于檢測(cè)轉(zhuǎn)化突變型是可能的，可選擇的標(biāo)記，盡管可能是所希望的，但對(duì)于獲得轉(zhuǎn)化植物是不需要的。
下面的質(zhì)粒在美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(12301ParklawnDrive，Rockville，MD.U.S.A)和塞特斯控制培養(yǎng)物中心(Emeryville，CA)兩處保藏，為如下保藏號(hào)ATCCATCCCMCC質(zhì)粒保藏號(hào)保藏日期保藏號(hào)pCMC1022672691986，11，142902pAMVFF674511987，7，243157pCMC1100676411988，3，13290pAcX1100上述保藏物是根據(jù)ATCC和塞特斯公司(為本發(fā)明的轉(zhuǎn)讓權(quán)人的合伙人)之間的協(xié)議而進(jìn)行的。與ATCC的協(xié)議對(duì)公眾提供了這些細(xì)胞品系的永久有效性，根據(jù)描述和表達(dá)該保藏的美國(guó)專(zhuān)利的發(fā)行或公開(kāi)或?qū)τ谌魏蚊绹?guó)或外國(guó)的專(zhuān)利申請(qǐng)的公開(kāi)文本來(lái)說(shuō)，它是第一次出現(xiàn)，而且它對(duì)于由美國(guó)專(zhuān)利和商標(biāo)的專(zhuān)員所決定的細(xì)胞品系的后代也是有效的，并根據(jù)35USC122章和專(zhuān)員規(guī)則所建議的(包括37CFR1.14章，它對(duì)于886O.G.638可列為特殊參考)為其命名。本發(fā)明申請(qǐng)的轉(zhuǎn)讓人已同意如果在合適的條件下栽培時(shí)，保藏后的細(xì)胞品系死亡或丟失或遭破壞，他們將馬上根據(jù)通知替換一株同樣的細(xì)胞品系的活體培養(yǎng)物。
本發(fā)明并不局限于微生物保藏的范圍，因?yàn)楸２氐膶?shí)施例僅作為本發(fā)明的一個(gè)方面的一個(gè)例子，任何起同樣作用的微生物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除這里所顯示的和描述的之外的本發(fā)明的多種修改對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，根據(jù)先前的描述將變得很明顯，但它們將落入所附加的權(quán)項(xiàng)的范圍內(nèi)。
也可以理解，所有核苷酸的堿基對(duì)的大小是近似的，可用于描述的目的。
權(quán)利要求
1.一種制備可遺傳的轉(zhuǎn)化大豆植物的方法，其特征在于它包括如下步驟制備包括編碼區(qū)和可在大豆細(xì)胞中有效地表達(dá)編碼區(qū)的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序的外來(lái)基因的拷貝；將外來(lái)基因的拷貝與生物惰性的載體相結(jié)合；將可再生的大豆組織放置于“靶子”表面上；用物理方法加速在“靶子”表面上攜帶嵌合基因拷貝的微粒，以這種方式，一些微?？少A留在至少一部分大豆組織的細(xì)胞的內(nèi)部；將處理后的組織再生成整株有性的成熟大豆植物；和驗(yàn)證外來(lái)基因在再生后的植物的組織中存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物惰性的微粒是金屬的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述金屬微粒是金球。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述可再生的大豆組織是一個(gè)切出的合子胚。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述合子胚通過(guò)胚胎發(fā)生而再生。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述合子胚通過(guò)器官發(fā)生而再生。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述外來(lái)基因被制成一個(gè)可寄宿于細(xì)菌中的質(zhì)粒。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒是ATCC保藏號(hào)為67269的pCMC1022。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒是ATCC保藏號(hào)為67451的pAMVFF。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒是ATCC保藏號(hào)為67641的pCMC1100。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述可再生的大豆組織是切出的分生組織。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于處理后的分生組織通過(guò)器官發(fā)生而再生。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述可再生的大豆細(xì)胞通過(guò)將這樣的切出的組織鋪展在瓊脂培養(yǎng)基的層上而放于“靶子”表面上。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述驗(yàn)證外來(lái)基因存在是通過(guò)雜交分析外來(lái)DNA本身的存在而進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述驗(yàn)證外來(lái)基因的存在是通過(guò)分析外來(lái)基因的表達(dá)產(chǎn)品而進(jìn)行的。
16.一種大豆植物，其特征在于它通過(guò)權(quán)利要求1的方法而生產(chǎn)。
17.一種種子，其特征在于它從權(quán)利要求1所述的方法所生產(chǎn)的大豆植物產(chǎn)生。
18.一種制備大豆植物的可遺傳的轉(zhuǎn)化品系的方法，其特征在于它包括如下步驟制備包括編碼區(qū)和可在大豆細(xì)胞中有效地表達(dá)編碼區(qū)的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序的外來(lái)基因的拷貝;將外來(lái)基因的拷貝與基本上是生物惰性的載體相結(jié)合;將分生組織的大豆組織放置于“靶子”表面上;用物理方法加速在靶子表面上攜帶外來(lái)基因拷貝的微粒，以這種方式，一些微?？少A留于至少一部分大豆組織的細(xì)胞的內(nèi)部;將處理后的分生組織的大豆組織培養(yǎng)成完整的有性的成熟大豆植物;從有性成熟的再生植物中獲取自授花粉的種子;從種子長(zhǎng)成后代植物;和驗(yàn)證外來(lái)基因在至少一部分后代植物的組織中存在。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述生物惰性的微粒是金屬的。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述金屬微粒是金。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述分生組織的大豆組織是一個(gè)切出的合子胚。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述合子胚通過(guò)胚胎發(fā)生而再生。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述合子胚通過(guò)器官發(fā)生而再生。
24.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述可再生的大豆組織是一種切出的分生組織。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述處理后的分生組織通過(guò)器官發(fā)生而再生。
26.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述分生組織是大豆幼苗的分生組織。
27.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述的分生組織的大豆組織通過(guò)將這樣的切出的組織鋪展在瓊脂培養(yǎng)基層上而放于“靶子”表面上。
28.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于驗(yàn)證外來(lái)基因的存在是通過(guò)雜交分析外來(lái)基因DNA本身的存在而進(jìn)行的。
29.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于驗(yàn)證外來(lái)基因的存在是通過(guò)分析外來(lái)基因的表達(dá)產(chǎn)品而進(jìn)行的。
30.一種大豆植物，其特征在于它由權(quán)利要求18的方法生產(chǎn)。
31.一種種子，其特征在于它由權(quán)利要求18的方法所生產(chǎn)的大豆植物所產(chǎn)生。
32.一種大豆植物，其特征在于在它的基因組中包括一個(gè)外來(lái)基因的構(gòu)造以引起在至少一部分大豆植物的細(xì)胞中外源基因產(chǎn)品的表達(dá)。
33.如權(quán)利要求32所述的大豆植物，其特征在于所述外來(lái)基因產(chǎn)品是一種蛋白質(zhì)。
34.一種能經(jīng)培養(yǎng)成大豆植物的大豆種子，其特征在于在它的基因組中包括一個(gè)可有效地引起大豆植物的細(xì)胞中外來(lái)基因產(chǎn)品表達(dá)的外來(lái)基因。
35.如權(quán)利要求34所述的大豆植物，其特征在于所述外來(lái)基因產(chǎn)品是蛋白質(zhì)。
36.一種大豆植物，其特征在于在它的基因組中，包括一個(gè)在大豆植物的細(xì)胞中可表達(dá)的，且通過(guò)分析可檢測(cè)到的標(biāo)記基因產(chǎn)品的外源基因結(jié)構(gòu)。
37.如權(quán)利要求36所述的大豆植物，其特征在于所述可檢測(cè)的標(biāo)記物是一種催化反應(yīng)的酶，它可以通過(guò)熒光或比色分析而檢測(cè)到。
38.一種種子，其特征在于它由權(quán)利要求36所述的植物所生產(chǎn)。
39.一種可以再生的大豆組織，其特征在于它包括大豆細(xì)胞，在所述大豆細(xì)胞的基因組中包括一個(gè)外源基因。
40.如權(quán)利要求39所述的可以再生的大豆組織，其特征在于至少有一些大豆細(xì)胞攜帶被用于將外來(lái)基因攜帶入細(xì)胞的生物惰性材料的微粒。
41.如權(quán)利要求39所述的可再生的大豆組織，其特征在于所述的外源基因是可檢測(cè)的標(biāo)記。
42.一種制備可遺傳的轉(zhuǎn)化的植物品系的方法，其特征在于它包括如下步驟制備包括編碼區(qū)和可在植物細(xì)胞中有效地表達(dá)編碼區(qū)的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序的外來(lái)基因的拷貝;將外來(lái)基因的拷貝與惰性載體微粒相結(jié)合;將植物的分生組織放置于“靶子”表面上;以物理方法在靶子表面上加速攜帶外來(lái)基因拷貝的微粒，以這種方式，一些微?？少A留在至少一部分分生組織的細(xì)胞的內(nèi)部;將分生組織培養(yǎng)成完整的有性成熟植物;從成熟植物中獲取自授花粉的種子;從種子中栽培出后代植物;和分析后代植物中外來(lái)基因的存在。
全文摘要
本發(fā)明揭示了通過(guò)以微粒為媒介的轉(zhuǎn)化而遺傳地轉(zhuǎn)化大豆植物和植物品系的方法和設(shè)備。外來(lái)基因是通過(guò)被涂覆于載體微粒并被用物理方法加速進(jìn)入植物組織而引入至可再生的大豆組織中。然后，將處理后的植物組織回收并再生為完整的有性成熟植物。后代從由這些植物產(chǎn)生的種子中回收，且一部分這種后代，在它們的基因的組中含有外來(lái)基因。該工藝可用于生產(chǎn)新的遺傳工程的大豆植物及其品系。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1030940SQ8810476
公開(kāi)日1989年2月8日 申請(qǐng)日期1988年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1987年7月29日
發(fā)明者保羅·克里斯托, 丹尼斯·麥凱布, 威廉F·斯溫, 肯尼思A·巴頓 申請(qǐng)人:阿格拉塞特斯公司