專利名稱：抗生素a80577及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的多醚類抗生素A80577及其產(chǎn)生這一抗生素的新菌株Actinomadura屬Verrucosospora種。A80577的結(jié)構(gòu)如式Ⅰ所示
本發(fā)明還涉及A80577的酰酯和烷醚衍生物，以及A80577和這些衍生物的鹽。
本發(fā)明的另一方面是抗生素A80577的生產(chǎn)方法。該方法是在浸水需氧發(fā)酵條件下，在含有同源碳，氮，和無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)Actinomadura屬Verrucosospora種，或產(chǎn)生A80577的變種，突變體或重組體，直到產(chǎn)生抗生素A80577為止。從發(fā)酵肉湯和帶有機(jī)溶劑的菌絲體中提取A85077。通過(guò)諸如柱層析的技術(shù)分離A80577，并進(jìn)一步純化之。
由于Actinomadura屬Verrucosospora種是新發(fā)現(xiàn)的菌株，所以本發(fā)明還提供了產(chǎn)生抗生素A80577的微生物或其變種，突變體或重組體的純生物學(xué)培養(yǎng)方法。
A80577是有用的抗菌劑。它改善反芻動(dòng)物的進(jìn)食利用率，并可用作反芻動(dòng)物和單胃動(dòng)物助長(zhǎng)劑。另外，A80577具有殺寄生蟲(chóng)作用，并可用作離子載體抗生素。因此，本發(fā)明還涉及用于增加反芻動(dòng)物進(jìn)食利用率的一種食用組合物，該組合物包括;動(dòng)物飼料和有效量的抗生素A80577及其酰酯或烷醚衍生物，或A80577的鹽，或這些衍生物的鹽;本發(fā)明還涉及增加進(jìn)食利用率的方法，該方法包括給動(dòng)物口服有效量的前述化合物。
下圖是在氯仿中的紅外吸收?qǐng)D譜

圖1A80577(鈉鹽)圖2A80577(鉀鹽)就獸醫(yī)領(lǐng)域而言，一直需要先進(jìn)的抗生素。提高動(dòng)物的助長(zhǎng)作用是這類抗生素的理想特點(diǎn)之一。通過(guò)減少疾病以及增加進(jìn)食利用率，可以收到助長(zhǎng)效果。反芻動(dòng)物(如牛)的助長(zhǎng)具有特殊的意義。
反芻動(dòng)物飼料中主要營(yíng)養(yǎng)物(碳水化合物)的利用機(jī)理是眾所周知的。在動(dòng)物瘤胃中的微生物降解碳水化合物，產(chǎn)生單糖，然后再把這些單糖轉(zhuǎn)化成丙酸酯化合物。丙酸酯化合物經(jīng)微生物學(xué)途徑代謝，形成乙酸酯，丁酸酯或丙酸酯類，統(tǒng)稱為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)。
VFA的相對(duì)利用效率與總體效率有關(guān)。因此，盡管采用乙酸酯和丁酸酯，但丙酸酯的利用率更高。產(chǎn)生丙酸酯的發(fā)酵率也大于丁酸酯或乙酸酯的發(fā)醇率。這就是額外利用率。因此，有益的化合物是通過(guò)刺激動(dòng)物從代謝碳水化合物中產(chǎn)生更高比例的丙酸酯類，由此增加碳水化合物的利用率。
A80577是多醚抗生素族中的一個(gè)新成員。Westley已經(jīng)把現(xiàn)有的多醚分門(mén)別類(JohnW.Westley“多醚抗生素天然存在的酸離子載體，Vol.2.Chemistry，”MarcelDekker，NewYork，1983;JournalofNaturalProducts，49(1)，35〔1986〕)。采用Westley系統(tǒng)，A80577是多醚族第四類新成員。該族包括在“J.Antibiotics，142(1982)”中介紹的tetronomycin，“J.Chem.Soc.，Chem.Comm.，1073(1981)”和美國(guó)專利4，279，849中介紹的M139603。
A80577(鈉鹽)具有有下列特征收態(tài)白色結(jié)晶體(由丙酮-水結(jié)晶)mp(鈉鹽)276-278℃(鉀鹽)270-272℃分子量782〔質(zhì)譜場(chǎng)解吸(FDMS)〕;760(酸式)。
〔α〕25D-89.03(C5，MeOH)非滴定基團(tuán)(66%DMF)實(shí)驗(yàn)分子式C42H63O12NaUVmax中性乙醇253nm(ε＝17，735)，289nm(ε＝10，003)酸式250nm(ε＝14，715)，298nm(ε＝7，971)堿式208nm(ε＝192，222)，248nm(ε＝15，968)，286nm(ε＝9，665)IR(鈉鹽，CHCl3)3018，2966，2931，1750，1611，1453，1439，1219，1022，1012cm-1(見(jiàn)圖1)IR(鉀鹽，CHCl3)3023，3019，2967，2964，2930，2974，1750，1650，1451，1437，1224，1214，1210，1079，1059，1022，1012cm-1(1見(jiàn)圖2)。
溶解度略溶于水;溶于下列溶劑二甲亞砜，二甲基甲酰胺，低級(jí)醇類(如甲醇)酮類(如丙酮)，酯類(如乙酸乙酯)，囟代烷烴類(如氯仿)，烷烴類(如乙醚，苯，甲苯和溫?zé)岬募和?。
根據(jù)其物理特征，可以確認(rèn)A80577具有式Ⅰ所示的結(jié)構(gòu)。正如其結(jié)構(gòu)所示，A80577是帶電荷的分子，并可以形成鹽。A80577還有可至四個(gè)可酯化或可形成醚衍生物的羥基。A80577的酰酯和烷醚衍生物，以及A80577和上述衍生物的藥物上可以接受的鹽也可用作抗生素以及用作增加進(jìn)食利用率的藥物。
本文所采用的“A80577化合物”一詞意指抗生素A80577(式Ⅰ)，抗菌素A80577的酰酯或烷醚衍生物，或者是抗生素A80577的藥物上可以接受的鹽或其酰酯或烷醚衍生物。
按本文所述，通過(guò)培養(yǎng)Actinomadura屬Verrucosospora種的產(chǎn)A80577菌株，制得抗生素A80577。在適宜的培養(yǎng)基中，于浸水需氧條件下產(chǎn)生該抗生素;可通過(guò)采用本領(lǐng)域公知的各種分離和純化方法，從所述培養(yǎng)基中回收該抗生素。
產(chǎn)A80577生物的培養(yǎng)基已有保藏，并已成為下述機(jī)構(gòu)保藏培養(yǎng)基中的一部分MidwestAreaNorthernRegionalResearchCenter，AgriculturalResearchService，U.S.DepartmentofAgriculture，1815NorthUnuversityStreet，Peoria，Illinois61604，按照登記號(hào)NRRL18236，公眾可以容易地從該機(jī)構(gòu)中得到它。
Lilly研究實(shí)驗(yàn)室的FrederickP.Mertz對(duì)這一生物體進(jìn)行了分類學(xué)研究。根據(jù)這些研究，該生物體屬于Actinomadura屬〔Lechevalier和Lechevalier，1970，InProuser，H.(ed)“放射線菌素”VEBGustavFischerVerlag，Jena，PP.393-405〕。
本文所遵循的是用于鑒定鏈霉菌屬的國(guó)際鏈霉菌屬工程(ISP)所推薦的方法〔E.B.Shirling和D.Gottlieb，“鏈霉菌屬鑒定方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.16(3)，313-340(1966)〕。
用ISPNo.1(酵母胰胨肉湯)，ISPNo.6(酵母胨鐵瓊脂)，ISPNo.7(酪氨酸瓊脂)測(cè)定了黑色素產(chǎn)物。
在ISPNo.4(無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂)平皿上用碘試驗(yàn)所存在的淀粉，由此測(cè)定淀粉水解。
用光學(xué)顯微來(lái)研究形態(tài)。采用電子掃描顯微鏡(SEM)研究芽飽表面修飾。
ICSS-NBS短心顏色曲線圖，標(biāo)準(zhǔn)樣品No.2106(NationalBureauofStandards，1958，U.S.DepartmentofCommerce.Washington.D.C.)和色澤協(xié)調(diào)手冊(cè)(4thed.，ColorStandardsDepartment，ContainerCorporationofAmerica，Chicago，Illinios，1958)用來(lái)分別確定反面和氣孢團(tuán)顏色的名稱。
采用Becker等人的層析法確定整體細(xì)胞水解產(chǎn)物中的二氨基庚二酸(DAP)異構(gòu)體和碳水化合物。該方法見(jiàn)〔B.Becker，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon，和H.A.Lechevalier，“用整體細(xì)胞水解產(chǎn)物紙色譜法快速鑒定放射線菌屬和鏈霉菌屬”，Appl.Microniol，12，421-423(1964)〕和Lechevalier的〔M.P.Lechevalier，和H.Lechevalier“厭氧鏈霉菌屬分類中的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)組份”，Int.J.Sust.Bacteriol.20，435-443(1970)〕。
將抗生素敏感圓面襯墊在接過(guò)種的ISPNo.2瓊脂平板上，由此來(lái)測(cè)定對(duì)抗生素的耐藥性。
培養(yǎng)特征A80577培養(yǎng)在復(fù)合的和限定的培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好。氣孢塊緩慢形成，其為白色。反面由黃白色變?yōu)榈S色。未觀察到明顯的色素，除了在幾個(gè)介質(zhì)上有淺的黃褐色色素外，未觀察到可溶色素。表Ⅰ給出了上述培養(yǎng)特征。
表ⅠA80577的培養(yǎng)特征，30℃，保溫18天。
G(生長(zhǎng))豐富G中等ISPR(反面)88.d.y.Czapek瓊脂R92.y白色No.2C(空白)痕跡a白色Am(氣菌絲體)中等a白色Sp(可溶色素)無(wú)至1.yBrSp無(wú)G中等G差I(lǐng)SPR92.y白色番茄醬燕麥R88.d.y.
No.3Am中等a白色片瓊脂Am差a白色Sp無(wú)Sp無(wú)G良好G良好ISPR92.y白色土豆蘿卜R89.p.Y.
No.4Am良好a白色瓊脂Am良好a白色Sp無(wú)Sp無(wú)G豐富G差I(lǐng)SPR89.p.YJensenR92.y白色No.5Am良好a白色瓊脂Am差a白色Sp無(wú)Sp無(wú)G良好G良好ISPR90.gp.Y葡萄糖R89.p.Y.
No.7Am無(wú)天門(mén)冬酰氨Am良好a白色Sp無(wú)Sp無(wú)
G良好G只有痕跡R89.p.Y甘油甘氨酸R-No.172Am良好a白色Am-Sp無(wú)Sp無(wú)G無(wú)生長(zhǎng)G豐富自來(lái)水R-酵母葡萄糖R87.m.Y.
瓊脂Am-瓊脂Am中等a白色Sp-Sp無(wú)至1.yBrG豐富EmersonR87.m.Y2脂Am痕跡a白色Sp無(wú)至1.yBr形態(tài)學(xué)特征培養(yǎng)A80577產(chǎn)生大量的基質(zhì)菌絲體。緩慢形成的需氧菌絲產(chǎn)生許多由緊密包裹的短鏈組成的群集體，并按照Rectus-flexibilis(RF)形態(tài)學(xué)排例。這種形態(tài)是典型的Actinomadura屬。芽孢的形狀呈球形，平均大小為0.8μm，并且芽孢表面具有獨(dú)特的顆粒外觀。每個(gè)孢子鏈所含孢子數(shù)少于10。
生理學(xué)特征水解后的整體細(xì)胞經(jīng)分析表明有新-二氨基庚二酸存在。在該整體細(xì)胞提取物中檢測(cè)出了Madurose。還檢測(cè)出了半乳糖，葡萄糖，甘露糖和核糖。細(xì)胞壁為Ⅲ型，糖式為B型。半乳糖是不典型的B糖式。
培養(yǎng)物A80577利用了下列碳水化合物核糖醇，D-和L-阿拉伯糖，纖維素二糖，半乳糖醇，乙醇，i-赤蘚醇，D-果糖，D-半乳糖，葡萄糖，甘油，糖原，i-肌醇，D-甘露糖醇，D-甘露糖，D-松三糖，D-密二糖，L-鼠李糖，D-核糖，蔗糖，D-海藻糖，D-木糖和丁酸鈉。而不能利用的有纖維素，糊精，菊粉，D-乳糖，D-麥芽糖，α-甲基-D-糖苷，D-棉子糖，水楊苷，山梨醇，L-山梨糖，木糖醇。不加碳水化合物的對(duì)照平皿維持最低生長(zhǎng)。
A80577培養(yǎng)物在15-45℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，顯然，最佳生長(zhǎng)溫度在30和37℃之間。A80577耐受NaCl的濃度高達(dá)4%，產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶并還原硝酸鹽。它不能水解淀粉。
A80577對(duì)下述抗生素有抗性桿菌肽10單位，頭孢菌素I30μg，林可霉素2μg，竹桃霉素15μg，青霉素G10單位，利福平5μg，四環(huán)素30μg。它對(duì)下列抗生素敏感慶大霉素10μg，新霉素30μg，鏈霉素10μg，托普霉素10μg，萬(wàn)古霉素30μg。
A80577的化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)和綜合培養(yǎng)及形態(tài)特征均支持該菌株屬于Actinomadura屬Verrucosospora種。因此，把這一菌株分類為Actinomadura屬Verrucosospora種A80577。
與其他生物體一樣，產(chǎn)生A80577的培養(yǎng)物Actinomadura屬Verrucosospora種的特征也要發(fā)生改變。采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)可以獲得該菌株的重組體，突變體和變種。例如，通過(guò)用各種已知的物理和化學(xué)致變物(如紫外光，X射線，γ射線，化學(xué)物質(zhì)，如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍)處理，可以得到突變體。持有產(chǎn)A80577特征的該Actinomadura屬Verrucosospora種菌株的所有天然和誘發(fā)變體，突變體和重組體均屬于本發(fā)明的內(nèi)容。
用于培植Actinomadura屬Verrucosospora種的培養(yǎng)基可以是為數(shù)眾多的培養(yǎng)基中的任何一個(gè)。但是為使生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)，收率高，易于分離產(chǎn)品，最好選擇某些培養(yǎng)基。例如，雖然也可使用赤糖糊糖漿(blackstrapmolasses)，淀粉等類似的糖，但大規(guī)模發(fā)酵中的優(yōu)選碳水化合物源是葡萄糖。
盡管也可以使用其他氮源，但最好的氮源是酶水解的酪蛋白。
摻入培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)性無(wú)機(jī)鹽最好是慣用的、可得到下列離子的可溶性鹽Zn++，Na+，Mg++，Ca++，NH+，Cl-，CO＝2，SO＝4，NO-3和其他類似的離子。
培養(yǎng)基中還應(yīng)該包括對(duì)生物體生長(zhǎng)發(fā)育所必須的主要微量元素。這些微量元素通常以?shī)A雜物的形式出現(xiàn)在培養(yǎng)基的其他取代成份當(dāng)中，其含量足以滿足該生物體的生長(zhǎng)需要。如果出現(xiàn)泡沫問(wèn)題，可按照需要，在大規(guī)模發(fā)酵基中加入少量的(即0.2ml/L)抗發(fā)泡劑(如聚乙二醇)。
為了大量生產(chǎn)抗生素A80577，選用罐內(nèi)浸氧發(fā)酵法。搖瓶培養(yǎng)可得到少量的A80577。
由于用生物孢子進(jìn)行大罐接種，在抗生素生產(chǎn)中經(jīng)常出現(xiàn)時(shí)間遲滯，因此，最好采用營(yíng)養(yǎng)接種物。通過(guò)在少量的培養(yǎng)基上接種生物芽孢或菌絲體片斷，得到新鮮的生長(zhǎng)活躍的生物培養(yǎng)體，由此制得營(yíng)養(yǎng)接種物。然后將該營(yíng)養(yǎng)接種物移至大罐中。該營(yíng)養(yǎng)接種物基質(zhì)可以采用與大規(guī)模發(fā)酵相同的基質(zhì)，但也可以采用其他適宜的介質(zhì)。
當(dāng)生長(zhǎng)溫度約為25℃至37℃時(shí)，Actinomadura屬產(chǎn)生A80577。生產(chǎn)A80577的最好溫度似乎是約30℃。
按照常規(guī)的浸水需氧培養(yǎng)方法，將無(wú)菌空氣從反應(yīng)器底部通入反應(yīng)器，同時(shí)用慣用的渦輪式攪拌葉輪攪拌該基質(zhì)。一般吹氣速率和攪拌速率應(yīng)維持溶解氧在30%的飽和水平或更高。
在發(fā)酵期間檢測(cè)肉湯樣品對(duì)某些已知敏感于該抗生素的生物之抗菌作用，可跟蹤抗生素A80577的生產(chǎn)情況。一種用于檢測(cè)A80577的試驗(yàn)生物體是枯草桿菌ATCC6633。用瓊脂平板測(cè)試法可以方便地進(jìn)行該生物測(cè)試。
按照該浸水需氧發(fā)酵條件下的生產(chǎn)方法，采用發(fā)酵領(lǐng)域中所使用的方法，可以從發(fā)酵基質(zhì)中回收A80577。產(chǎn)A80577生物體在發(fā)酵期間所產(chǎn)生的抗菌活性存在于菌絲體和肉湯中。因此，通過(guò)最初將基質(zhì)過(guò)濾，把肉湯與菌絲體塊分開(kāi)，可達(dá)到A80577的最大回收。分別將經(jīng)過(guò)濾的肉湯和菌絲體塊進(jìn)一步純化，得到各自的A80577部份。可采用各種技術(shù)進(jìn)行這一純化。
用于純化過(guò)濾肉湯的優(yōu)選技術(shù)是將其調(diào)至約pH9，然后用適宜的溶劑，如，乙酸乙酯提取之。然后減壓下蒸掉提取溶劑，得到肉湯部分的A80577。
純化菌絲體塊的優(yōu)選方法是用適宜的溶劑(例如丙酮)，抽提分離后的菌絲體濾塊。減壓蒸掉提取溶劑，得到濃縮水溶液。將該水溶液調(diào)至約pH9，用適宜的溶劑，如，乙酸乙酯，提取之。然后將提取溶劑減壓濃縮，得到菌絲體部分的A80577。
用類似的方法進(jìn)一步純化肉湯部分和菌絲體部分A80577的混合物。優(yōu)選的方法包括硅膠色譜法。
采用薄層色譜(TLC)或高效液相色譜(HPLC)法，可以完成抗生素A80577的分離。適宜的硅膠TLC溶劑體系是乙酸乙酯，乙酯乙酯∶乙腈∶氫氧化銨和甲苯∶乙腈∶乙酸。優(yōu)選的硅膠溶劑體系是乙酸乙酯∶乙腈∶氨(90∶9∶1)，和甲苯∶乙腈∶乙酸(40∶59∶1)。使用聚酰胺板也很方便，其溶劑系統(tǒng)是丙酮∶水∶氨，優(yōu)選比例為30∶69∶1。用枯草桿菌的生物自顯影法或其他方法(如香草醛-硫酸噴灑劑)可以檢測(cè)該抗生素。
另外，培養(yǎng)固體，包括基質(zhì)組份和菌絲體都可不經(jīng)提取或分離而作為A80577的來(lái)源使用，但最好先除去水。例如，A80577產(chǎn)生后，可以通過(guò)凍干，滾筒干燥，或共沸蒸餾及干燥法將整個(gè)發(fā)酵肉湯干燥。然后將經(jīng)干燥的肉湯直接混入進(jìn)食預(yù)混物。
A80577的鹽以及其衍生物的鹽可用來(lái)分離和純化該抗生素。藥物上可以接受的鹽尤其有用。這些鹽的例子是A80577及其衍生物的堿金屬和堿土金屬鹽。
具有代表性的、適宜的A80577的堿金屬和堿土金屬鹽包括鈉鹽，鉀鹽，鋰鹽，銫鹽，銣鹽，鋇鹽，鈣鹽，鎂鹽。
就獸藥領(lǐng)域而言，眾所周知的是在用該抗生素治療動(dòng)物時(shí)，抗菌素的劑型一般并不十分重要。在多數(shù)情況下動(dòng)物的體內(nèi)因素使原服用藥物的形式發(fā)生改變。因此，以鹽的形式服用并不種匾５淺鲇誥?，藩?jiǎng)?，毒芯壞X潁梢匝≡裱蔚男問(wèn)健 按照制備陽(yáng)離子鹽所采用的一般方法，可制得A80577的堿金屬和堿土金屬陽(yáng)離子鹽。例如，將A80577的游離溶解在適宜的溶劑(如丙酮)中，加入藥1/2體積的水，用所期望的陽(yáng)離子鹽的堿(如NaOH，KOH)將該溶液調(diào)至約pH9至10。采用慣用方法(如過(guò)濾或蒸發(fā)溶劑)，可分離由此形成的鹽。
形成鹽的優(yōu)選方法是將A80577(酸式)溶解在溶劑(如四氫呋喃)中;加入等量的水;用相應(yīng)的陽(yáng)離子堿(如NaOH，KOH等)將該混合物調(diào)至pH10;然后用與水不混溶的溶劑(如乙醚或乙酸乙酯)提取即得。用水洗滌分離后的有機(jī)相，并濃縮至干。殘留物用二噁烷凍干。該鹽用適宜的溶劑(如丙酮)結(jié)晶。
A80577的烷基醚衍生物是式中由YR基團(tuán)取代了一個(gè)或多個(gè)羥基的那些化合物，其中Y代表O或S;
R代表C1-6烷基，C1-4烷氧基-C2-5烷基，C1-4-烷氧羰基-C2-5烷基，氨基-C2-5烷基，巰基-C2-5烷基，羥基烷基，鹵代烷基，或(R′)-苯基(CH2)n，其中R1代表C1-4烷基，C1-4烷氧基，或羥基，m代表0-2;n代表0-3。
術(shù)語(yǔ)“烷基”意指C1至C7直鏈或支鏈烷烴，最好是C1至C4烷烴，如甲基，乙基，丙基，異丙基，正丁基等。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基”意指其中具有氧官能團(tuán)取代的C1至C7低級(jí)烷基，如甲氧基，乙氧基，丙氧基，和類似基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“羥基烷基”或意指單羥基-C1-5烷基殘基，或者當(dāng)Y是0時(shí)，意指2，3-二羥基丙-1-基殘基。
術(shù)語(yǔ)“鹵代烷基”意指含1至3個(gè)鹵原子取代的C2-5烷基殘基，所說(shuō)鹵原子選自溴，氯，氟。當(dāng)所說(shuō)烷基是二鹵或三鹵取代烷基時(shí)，鹵素取代基必須是同一鹵素。
優(yōu)選的A80577醚衍生物是式中Y代表O，R代表C1-6烷基的那些化合物。A80577或其鹽與相應(yīng)的伯醇或硫醇反應(yīng)，即可制得上述醚衍生物。
以某些醇或硫醇作原料時(shí)，有必要在該反應(yīng)中加入酸催化劑。適宜的催化劑包括鹽酸，硫酸，高氯酸，甲磺酸，苯磺酸，甲苯磺酸，二氧化硒，三氟化硼。
為加快反應(yīng)可加入下列某一溶劑水，丙酮，苯，醚，四氫呋喃，二噁烷。盡管也可采用較高的溫度，但一般在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。
A80577的酰酯衍生物是式中一個(gè)或多個(gè)羥基由式
取代的那些化合物，其中R1是C1-6烷基或氫。A80577與相應(yīng)的酸酐或酰氯反應(yīng)可制得A80577酰酯衍生物。只將A80577中多個(gè)羥基中的一個(gè)羥基酯化。在室溫下，A80577與相應(yīng)的酸酐反應(yīng)很容易制得這些酯。
盡管有時(shí)采用一般反應(yīng)操作法即可，但要得到本發(fā)明化合物，還可能需要進(jìn)一步純化。采用眾所周知的方法，例如柱色譜，薄層色譜，分級(jí)結(jié)晶等，即可完成這一純化。
A80577化合物能抑制使動(dòng)物致病的菌的生長(zhǎng)。表Ⅲ給出了最低抑制濃度(MIC)，在該濃度下A80577抑制某些生物。表Ⅲ中的MIC是通過(guò)慣用的瓊脂稀釋試驗(yàn)確定的。
表ⅢA80577的抗菌作用(鈉鹽)受試生物MIC(mcg/mL)金黃色葡萄球菌X1.10.5金黃色葡萄球菌V410.5金黃色葡萄球菌X4000.5金黃色葡萄球菌S13E0.5表皮葡萄球菌EPI10.5表皮葡萄球菌2220.5生膿鏈球菌C2030.125肺炎鏈球菌Park10.125肺炎鏈球菌X660.5肺炎鏈球菌20410.5發(fā)否氏桿菌32-128其他草蘭氏陰性菌試驗(yàn)＞128獸醫(yī)生物葡萄球菌屬＜0.05鏈球菌屬＜0.05出血敗血性巴斯德氏菌1.56溶血性巴斯德氏菌＞50支氣管敗血性博代氏桿菌＞50支原菌屬galliseticum0.78支原菌屬hyopneumoniae1.56大腸桿菌＞50鼠傷寒沙門(mén)氏菌＞50A80577化合物還具有抗厭氧菌的作用。表Ⅳ給出了由標(biāo)準(zhǔn)瓊脂稀釋實(shí)驗(yàn)測(cè)定的、A80577抑制各種厭氧菌的MIC。保溫24小時(shí)后記錄最后讀數(shù)。
表Ⅳ厭氧菌分離體對(duì)A80577(鈉鹽)的敏感性厭氧菌MIC(mcg/mL)梭狀芽胞桿菌屬difficile2994＜0.5產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌81＜0.5敗血梭狀芽胞桿菌1128＜0.5Eubacteriumaerofaciens1235＜0.5發(fā)酵球菌asaccharolyticus1302＜0.5發(fā)酵球菌prevoti1281＜0.5厭氧發(fā)酵鏈球菌1428＜0.5中間發(fā)酵鏈球菌1624＜0.5丙酸菌屬痤皰菌79＜0.5胞弱擬桿菌111＞128胞弱擬桿菌1877＞128胞弱擬桿菌1936B＞128擬桿菌屬thetajotaomicron14384黑色素?cái)M桿菌1856/281.0黑色素?cái)M桿菌273616飧司魐ulgatis12114擬桿菌屬corrodens1874＞128共生梭〔形桿〕菌1470＜0.5梭桿菌屬necrophorum6054A＜0.5通過(guò)腹膜內(nèi)注射給藥測(cè)定了A80577對(duì)大鼠的急性毒性，以LD50表示，為53.3gm/kg。
A80577化合物的另一重要性質(zhì)是改善動(dòng)物進(jìn)食利用率的能力。例如，A80577化合物可以改善具有發(fā)達(dá)的瘤胃器官的反動(dòng)物的進(jìn)食利用率。
采用ArthurP.Raun在美國(guó)專利3，794，732(尤其參見(jiàn)實(shí)施例5)中所述方法，通過(guò)觀察瘤胃中丙酸酯化合物的產(chǎn)生及濃度水平可以測(cè)得進(jìn)食利用率。表Ⅴ列出了A80577化合物對(duì)反芻動(dòng)物進(jìn)食利用率的影響。表ⅤA列出了A80577的劑量和產(chǎn)生丙酸酯類化合物之間的關(guān)系。表ⅤB列出了經(jīng)A80577處理過(guò)的瓶中易揮發(fā)脂肪酸(VFA)與該試驗(yàn)對(duì)照瓶中濃度的比例。
表ⅤA80577(鈉鹽)對(duì)反芻動(dòng)物進(jìn)食利用率的影響。
A丙酸酯產(chǎn)物，mM/d劑量，ppm觀察值中項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)差0269.61.40.041414.31.70.21414.81.41.01422.33.45.01421.82.7B處理組與對(duì)照組的比值劑量摩爾%摩爾%摩爾%VFA總量mcg/mL丙酸酯乙酸酯丁酸酯mM/L1.01.5320.8450.7540.8582.51.4590.8510.8270.8235.01.5620.7990.8390.77310.01.7090.7720.7280.876LSD雙盲t試驗(yàn);顯著性P＜0.01;C＞99%高于可信限度。
就增加丙酸酯而言，A80577化合物特別有效。因此，以約0.01mg/kg/天至約1.0mg/kg/天的比例給反芻動(dòng)物口服該化合物時(shí)，可以改善進(jìn)食利用率。優(yōu)選的服用劑量是約0.06mg/kg/天至約0.35mg/kg/天。優(yōu)選的服用方法是將該化合物與動(dòng)物飼料混合。適用于增加反芻動(dòng)物進(jìn)食利用率的進(jìn)食組合物一般包括飼料比例和0.5至50gA80577化合物/噸飼料，最好是2至15g/噸。
按照supra的描述，A80577化合物具有抗厭氧菌的作用，包括抗產(chǎn)氣夾膜桿菌。因此，可將A80577化合物用于治療(包括預(yù)防)雞，豬，牛，羊的腸炎。還能將A80577化合物用于治療反芻動(dòng)物的腸原性毒血癥。
可以通過(guò)口服或經(jīng)胃腸道外給動(dòng)物服用A80577化合物。服用A85077化合物最實(shí)用的途徑是將其配入飼料中。可以使用各種飼料，包括普通干飼料，液體飼料，顆粒飼料。盡管優(yōu)選服用方法是將它與動(dòng)物飼料混合，但也可以以其他方法服用，例如，以片劑，獸用飲劑，大丸劑或膠囊劑服用。每個(gè)劑量單體中A80577化合物的含量應(yīng)該與受治動(dòng)物的適宜日劑量直接聯(lián)系。
將藥物配進(jìn)動(dòng)物飼料的方法是眾所周知的。優(yōu)選方法是先制備高濃度含藥預(yù)混合物，然后再將其用于制備藥用飼料。典型的預(yù)混合物中，每磅預(yù)混合物可以含有約1至約200g藥物。該預(yù)混合物既可以是液體，也可以是固體制劑。
用于動(dòng)物的藥物最后配方應(yīng)取決于欲服用藥物量?？刹捎门渲疲旌?，制丸飼料的一般方法，制備含A80577化合物的飼料。
可以采用獸藥領(lǐng)域公知的方法將A80577化合物配制成適于胃腸道外給藥的制劑。含A80577化合物的有效的注射用組合物既可以是懸浮劑，也可以是溶液。就溶液劑而言，是將A80577化合物溶解在生理上可以接受的載體中。這類載體包括適宜的溶劑，必要的話，包括防腐劑(如芐醇)，和緩沖液。有用的溶劑包括例如，酒精，丙二醇，或者是惰性油，如，植物油或高精制礦物油。
采用非溶劑將該化合物與作為載體的添加劑混合制得注射用懸浮劑組合物。該非溶劑可以是水或乙二醇(如聚乙二醇)。
為了使該化合物在懸浮組合物中保持懸浮態(tài)，有必要加入適宜的生理上可以接受的添加劑。所述添加劑可以選自增稠劑，如羧甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，凝膠，藻酸鹽。許多表面活性劑也可以用來(lái)懸浮該類化合物。在液體非溶劑中可用作懸浮劑的有卵磷脂，烷基苯酚聚乙烯氧加成物，萘磺酸鹽，烷基苯磺酸鹽，聚氧乙烯脫水山梨醇酯。
能夠影響液體非溶劑的親水性，比重，表面張力的許多物質(zhì)均有助于制備注射用懸浮劑。例如，硅氧烷抗泡沫劑，乙二醇，山梨醇和糖均可用作懸浮劑。
為對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作更充分的說(shuō)明，提供下列實(shí)施例實(shí)施例1A.Actinomadura屬Verrucosospora種的搖瓶發(fā)酵將保存于液氮中的凍干丸狀或懸浮狀A(yù)ctinomadura屬Verrucosospora種培養(yǎng)物用于接種含有下列組份的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)或種基質(zhì)成份量(g/L)葡萄糖10.0可溶淀粉20.0酶水解酪蛋白＊5.0酵母提取物5.0CaCO31.0去離子水適量至1升＊N-ZAmineA，Humko-SheffieldChemical，Norwich，NJ.
將2.5%瓊脂加到該種基質(zhì)中，制得斜面或平板。將接種過(guò)的斜面在30℃保溫約10至14天。用無(wú)菌工具在成熟的斜面培養(yǎng)物上劃線，使孢子松散，除去并浸解菌絲體襯墊。將由此得到的約1/4松散孢子和培養(yǎng)生長(zhǎng)物用于接種50ml第一階段種基質(zhì)。
在振蕩器上，將接種后的第一階段基質(zhì)在250ml的Erlenmeyer燒瓶中，于30℃，保溫約72小時(shí)，同時(shí)使該振蕩器以250rpm，以兩英寸(5.08cm)的周長(zhǎng)做圓周運(yùn)動(dòng)。
用該保溫過(guò)的第一階段基質(zhì)91.00mL)接種具有下列組份的生產(chǎn)基質(zhì)成份量(g/L)葡萄糖25.0赤糖糊糖漿15.0酶水解酪蛋白＊5.0MgSO4(無(wú)水) 3.0CaCO31.0自來(lái)水適量至1升＊N-ZAmineA在振蕩器上，將接種后的生產(chǎn)基質(zhì)在250ml的廣口Erlenmeyer燒瓶中，于30℃保溫8至10天，同時(shí)，該振蕩器以250rpm，以兩英寸周長(zhǎng)做圓周運(yùn)動(dòng)。
B.Actinomadura屬Verrucosospora種的罐發(fā)酵為了提供大量的接種，將如A節(jié)所述方法制備的10ml第一階段培養(yǎng)基質(zhì)接種于400ml第二階段生長(zhǎng)基質(zhì)，該基質(zhì)的成份與第一階段基質(zhì)相同，將該第二階段營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)在2升Erlenmeyer廣口瓶中，于30℃保溫48小時(shí)，以25rpm轉(zhuǎn)速在2英寸圓周內(nèi)搖動(dòng)。
將由此制得的保溫過(guò)的第二階段營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)(400ml)用于接種過(guò)的100升無(wú)菌生產(chǎn)基質(zhì)，后者除加入抗泡沫劑P-2000(0.1mL/L)和Sag471(0.2g/L)外，制備方法與A節(jié)所述相同。于30℃，在165升攪拌發(fā)酵罐內(nèi)使該接種過(guò)的基質(zhì)發(fā)酵4至5天。在該攪拌反應(yīng)器中(200-250rpm)調(diào)節(jié)空氣流量(0.5-0.6v/v/m)，使溶水氧水平保持在室氣飽和度30%以上。
實(shí)施例2A80577鈉鹽的分離合并來(lái)自2份100L發(fā)酵液的發(fā)酵肉湯(187L)，并用3%HufloSupercel過(guò)濾。將菌絲體濾塊用40L丙酮提取兩次。合并丙酮提取液，減壓濃縮除去丙酮。將濃縮液(20升)與肉湯濾液(162升)合并，用50%NaOH將該溶液調(diào)至pH9.0，然后用125升乙酸乙酯提取之。將乙酸乙酯提取液減壓濃縮，殘留物于5℃放置結(jié)晶。依次用戊烷，乙腈，乙醚洗滌該結(jié)晶，真空干燥，得到36.4g白色晶體狀A(yù)80577鈉鹽(m.p.275-278℃)。
將1.0g該結(jié)晶溶解在100ml丙酮中，加入100ml水，于5℃放置72小時(shí)讓其結(jié)晶。另加入100ml水∶丙酮(3∶1)使結(jié)晶完全。濾出結(jié)晶，干燥，得到788mg純品(m.p.276-278℃)。
從上述合并洗液及母液中還可進(jìn)一步回收A80577的鈉鹽，具體方法是將溶液濃縮至干，溶解在250ml甲苯中，然后注入含有2升硅膠(GraceGrade62)甲苯浸濕的層析柱，該柱先用10升甲苯洗滌，然后依次用10升甲苯/乙醇(98∶2)和10升甲苯/乙醇(96∶4)洗脫，收集1升餾份。用TLC跟蹤該洗脫過(guò)程，并用枯草桿菌進(jìn)行生物測(cè)定。合并含A80577的餾份13-18，減壓濃縮，用乙醚洗滌該殘留物，干燥，得到2.3g非晶形A80577鈉鹽。
實(shí)施例3A80577游離酸的制備將A80577鈉鹽(1g)溶解在100ml丙酮中，加入0.1N的鹽酸(100ml)，將該溶液攪拌15分鐘，該溶液用乙酸乙酯(每次100ml)提取兩次，合并乙酸乙酯提取液，減壓濃縮至油狀殘留物，將該殘留物溶于二噁烷(50ml)中，冷凍干燥，得到0.9gA80577酸。
實(shí)施例4A80577鉀鹽的制備將A80577(酸式，100mg)溶解在四氫呋喃(20ml)中，加入水(3ml)和2N的KOH(6ml)，將該混合物攪拌15分鐘，加入水(30ml)，該溶液用二乙醚(每次60ml)提取兩次，合并提取液，減壓下蒸發(fā)至干。將殘留物溶解在二噁烷中，冷凍干燥，得到100mgA80577鉀鹽(m.p.270-272℃)。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)式Ⅰ所示抗生素A80577的方法，式Ⅰ為
該方法包括在含同源碳、氮和無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，在浸水需氧發(fā)酵條件下，培養(yǎng)Actinomadura屬Verrucosospora種或其產(chǎn)A80577的變種、突變體或重組體，直到產(chǎn)生抗生素A80577為止。
2.按權(quán)利要求1所述方法，該方法包括從培養(yǎng)基中分離A80577的步驟。
3.按權(quán)利要求1或2所述方法，其中使用Actinomadura屬Verrucosospora種。
4.按權(quán)利要求1至3所述任一方法，該方法包括A80577與陽(yáng)離子型堿反應(yīng)、形成相應(yīng)鹽的步驟。
5.按權(quán)利要求4所述方法，其中陽(yáng)離子型堿是氫氧化鈉。
6.按權(quán)利要求4所述方法，其中陽(yáng)離子型堿是氫氧化鉀。
7.按權(quán)利要求1至4所述任一方法，該方法包括A80577或其鹽與伯醇或硫醇反應(yīng)、形成相應(yīng)的烷醚衍生物的步驟。
8.按權(quán)利要求1至3所述任一方法，該方法包括A80577與酸酐或酰氯反應(yīng)、形成相應(yīng)的酰酯衍生物的步驟。
9.按權(quán)利要求7或8所述方法，該方法包括所說(shuō)衍生物與陽(yáng)離子型堿反應(yīng)、形成相應(yīng)鹽的步驟。
全文摘要
新的多醚類抗菌素A80577及其酰酯、烷醚衍生物和它們的鹽可用作抗菌劑，并能增加動(dòng)物的進(jìn)食利用率。本發(fā)明還提供了通過(guò)培養(yǎng)Actinomadura屬Verrucosospora種制備A80577的方法以及含有A80577化合物的組合物。
文檔編號(hào)C12P17/16GK1031253SQ8810604
公開(kāi)日1989年2月22日 申請(qǐng)日期1988年8月12日 優(yōu)先權(quán)日1987年8月13日
發(fā)明者羅伯特·L·哈米爾, 姚慈晃 申請(qǐng)人:伊萊利利公司