專利名稱：?；被嵬庀福渖a(chǎn)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種?；被嵬庀福渖a(chǎn)方法及應(yīng)用。
使旋光N-?；?α-氨基羧酸(下文簡(jiǎn)稱Nα-?；被?外消旋成為非旋光DL-N-?；被岬姆磻?yīng)是用于生產(chǎn)旋光氨基酸的主要反應(yīng)。
經(jīng)旋光Nα-?；被岬耐庀饔蒙a(chǎn)DL-Nα-?；被岬囊阎椒ㄏ抻谠趪?yán)格條件下的物理學(xué)和化學(xué)方法，例如，在乙酸中將原料與較低當(dāng)量數(shù)的乙酐一起加熱的方法[Biochem.Z.，203，280(1929)]、在室溫下將原料加大量乙酐處理的方法[J.Am.Chem.Soc.，54，1630(1932)]、在磷酸三酯或低級(jí)脂肪酸等溶劑中加熱原料的方法[日本已公告專利申請(qǐng)No.18402/1976]、于大約160℃在氮?dú)饬髦兄苯蛹訜嵝釴α-酰基氨基酸的方法[日本已公開(kāi)未審查專利申請(qǐng)No.126058/1986]以及在芳香烴存在下將原料連同催化量脫水劑一起加熱到130℃以上的方法[日本已公開(kāi)未審查專利申請(qǐng)No.165354/1986]。
已使用D-Nα-酰基氨基酸的外消旋作用與?；被崴饷附Y(jié)合以生產(chǎn)旋光L-α-氨基酸。因此，借助酰化氨基酸水解酶的催化作用，使價(jià)格便宜的原料DL-Nα-?；被徂D(zhuǎn)化為L(zhǎng)-α-氨基酸和D-Nα-?；被幔⒒谖锢硇再|(zhì)的差異將兩者分離開(kāi)。然后應(yīng)用任何一種物理或化學(xué)消旋方法將D-Nα-?；被徂D(zhuǎn)化成原料DL-Nα-?；被?，并再次用酰化氨基酸水解酶處理之。如此反復(fù)進(jìn)行這一操作，即可使原料DL-Nα-酰基氨基酸完全轉(zhuǎn)化成旋光的L-α-氨基酸。但這一方法具有一個(gè)重要缺點(diǎn)，即使用?；被崴饷柑幚砗箜毥?jīng)一分離程序以使L-α-氨基酸與N-酰基氨基酸彼此分離開(kāi)。另外，在以固態(tài)形式分離后，還必須在嚴(yán)格的物理或化學(xué)條件下完成D-Nα-?；被岬耐庀^(guò)程。
如果能在一種旋光氨基酸存在下，于?；被崴饷覆槐皇Щ畹臈l件下(如在常壓室溫下，近于中性水溶液中)單單選擇性地使D-Nα-?；被嵬瓿蛇@種消旋作用，這一選擇性消旋作用即可與?；被崴饷竻f(xié)同作用，不經(jīng)分離程序使原料DL-Nα-?；被嵋詥我徊襟E100%轉(zhuǎn)化為預(yù)期產(chǎn)物L(fēng)-α-氨基酸。這樣將有可能省去現(xiàn)有技術(shù)中必不可少的分離和外消旋程序，并可大大提高旋光氨基酸之生產(chǎn)工藝的效率。
然而，在現(xiàn)有技術(shù)的任何工藝條件下均不可能實(shí)現(xiàn)選擇性外消旋作用。一種可能的辦法是得到一種具有選擇性作用酶或外消旋劑，以使之僅對(duì)旋光Nα-酰基氨基酸起作用而對(duì)相應(yīng)的旋光α-氨基酸則不起作用，但迄今尚未找到表現(xiàn)有這樣一種催化作用的酶或外消旋劑。已知有一類稱為氨基酸外消旋酶的酶，其對(duì)Nα-酰基氨基酸不起作用，但可使旋光α-氨基酸產(chǎn)生外消旋作用[如見(jiàn)Biochem.Biophys.Res.Comm.，35，363(1969)]，但有證據(jù)表明這些氨基酸外消旋酶并不適用于這一目的。
本發(fā)明人對(duì)此進(jìn)行了研究，第一次證明有一種天然存在的酶，其對(duì)旋光氨基酸沒(méi)有作用，但可作用于旋光Nα-?；被崾怪D(zhuǎn)化為相應(yīng)的對(duì)映體，已將該酶定名為?；被嵬庀?。本發(fā)明人進(jìn)一步研究并建立了使用?；被嵬庀赣蒁L-Nα-?；被嵘a(chǎn)旋光α-氨基酸的方法。
因此，本發(fā)明涉及一種具有下列性質(zhì)的酰基氨基酸外消旋酶(1)將D-Nα-?；被徂D(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-Nα-酰基氨基酸，
(2)將L-Nα-?；被徂D(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-Nα-?；被?，(3)不能將D-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-α-氨基酸，(4)不能將L-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-α-氨基酸;
一種生產(chǎn)?；被嵬庀傅姆椒?，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生上述酶的微生物以在培養(yǎng)液積聚上述的酶并收獲之;以及一種生產(chǎn)旋光D-或L-氨基酸的方法，該方法包括于D或L-?；被崴饷复嬖谙率笵L-Nα-?；被崤c?；被嵬庀附佑|。
就上述Nα-?；被岷挺?氨基酸來(lái)說(shuō)，α-氨基酸可以是天然的或非天然的。另外，α-氨基酸可以是中性的、堿性的或酸性的。
例如，上述Nα-酰基氨基酸可用下列結(jié)構(gòu)通式來(lái)表示
其中X是羧酸衍生的?；?，其可以是被取代的，R是可被取代的C1-20烷基。
Nα-?；被岬孽；鶊F(tuán)(X)包括羧酸?；缤轷；⒈郊柞；头蓟轷；?。這些酰基可至少有一個(gè)取代基(如囟素、C1-3烷基、C1-3烷氧基、硝基)。烷?；睦影–1-3烷?；缂柞；?、乙?；?、丙酰基和氯代乙?；?。苯甲?；睦影ū郊柞；蛯?duì)位氯代苯甲?；?。芳基烷?；睦影ū交?C1-3烷?；绫交阴；捅交；?。
另外，式(Ⅰ)中R可以是直鏈或分枝鏈的C1-6烷基、用羥基、C1-3烷硫基、硫羥基、苯基、羥苯基或吲哚基取代的C1-3烷基，或用氨基、羧基、胍基或咪唑基取代的C1-4烷基。
可按下面討論的方法找到酰基氨基酸外消旋酶生產(chǎn)微生物，用標(biāo)準(zhǔn)方法(必要時(shí)向培養(yǎng)基內(nèi)加入一種可誘導(dǎo)所說(shuō)的酶或促進(jìn)所說(shuō)的酶產(chǎn)生的化合物，如一種適用于該酶的底物或金屬鹽)培養(yǎng)自天然來(lái)源分離的或自保藏機(jī)構(gòu)得到的微生物;由各所得培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞;用緩沖液等洗滌細(xì)胞后，必要時(shí)將細(xì)胞懸浮于含有適量N-乙?；?D-蛋氨酸和硫酸鎂的磷酸鹽緩沖溶液(pH7)中;將懸液于30℃振蕩過(guò)夜以使之反應(yīng)。由反應(yīng)液中除去細(xì)胞后，向上清液中加入給定量的L-?；被崴饷福冶匾獣r(shí)加入氯化鈷，并使反應(yīng)于37℃進(jìn)行幾小時(shí)，然后對(duì)反應(yīng)混合物作薄層層析(TLC，正丁醇∶乙酸∶水＝3∶1∶1)。選擇經(jīng)茚三酮反應(yīng)顯現(xiàn)蛋氨酸斑點(diǎn)的反應(yīng)溶液，然后通過(guò)茚三酮反應(yīng)和/或高效液相層析法檢測(cè)其中蛋氨酸含量。向呈現(xiàn)蛋氨酸陽(yáng)性反應(yīng)的培養(yǎng)液內(nèi)加入D-氨基酸氧化酶溶液，并使反應(yīng)于30℃進(jìn)行20小時(shí)以分解D-蛋氨酸，然后再次對(duì)各反應(yīng)混合物作茚三酮反應(yīng)、高效液相層析和/或使用乳酸片球菌ATCC8042作生物檢測(cè)[J.Biol.Chem.，177，533(1949)]，以測(cè)定反應(yīng)混合物中殘留的蛋氨酸(即L-蛋氨酸)。這些在反應(yīng)液中有一定量L-蛋氨酸的菌株能夠自N-乙?；?D-蛋氨酸產(chǎn)生L-蛋氨酸，它們就一定能產(chǎn)生?；被嵬庀负?或氨基酸外消旋酶。
然后使用如上述的同樣條件再次培養(yǎng)L-蛋氨酸陽(yáng)性菌株并制備細(xì)胞懸液。向各懸液內(nèi)加入L-蛋氨酸以代替N-乙?；?D-蛋氨酸，并以上述的同樣方式進(jìn)行反應(yīng)。除去細(xì)胞后，使用D-氨基酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、苯酚和4-氨基-氨替比林以比色法[Clin.Chem.，20，470(1974)]檢測(cè)反應(yīng)混合物中D-蛋氨酸量，并選擇D-蛋氨酸陰性菌株。
另外可用D-Nα-酰基氨基酸代替N-乙酰基-D-蛋氨酸。這樣經(jīng)選擇不表現(xiàn)氨基酸外消旋酶活性并可由D-Nα-酰基氨基酸產(chǎn)生相應(yīng)L-α-氨基酸的菌株，即可得到酰基氨基酸外消旋酶生產(chǎn)微生物。
表1中列出了已用這一方法找到的N-酰基氨基酸外消旋酶生產(chǎn)微生物。
雖然表1中列出的?；被嵬庀干a(chǎn)微生物均出乎預(yù)料地屬于放線菌屬，任何微生物，無(wú)論是放線菌、細(xì)菌、真菌、酵母還是磨菇，只要依上述方法檢測(cè)證明其為?；被嵬庀干a(chǎn)微生物，都可用于本發(fā)明。
下面給出了由Arashiyama(Kyoto，Japan)的土壤中分離的?；被嵬庀干a(chǎn)微生物的微生物學(xué)特征。
(a)形態(tài)學(xué)攜帶孢子的菌絲顯示總狀分枝式，并形成鉤、環(huán)或少見(jiàn)的原始螺旋(2或3圈)[Retinaculum-Apertum(RA)]。成熟孢子鏈每個(gè)鏈有10個(gè)以上孢子且孢子均顯示為有平滑表面的圓柱形(0.7至0.9×1.1至1.5μm)。未觀察到游動(dòng)元件、特異器官或結(jié)構(gòu)。該菌株具有LL-二氨基庚二酸作為細(xì)胞壁成分并且沒(méi)有特征性糖(Ⅰ型細(xì)胞壁)。
(b)培養(yǎng)特征表2中顯示了Y-53菌株在各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。表2中給出的顏色是使之與“ColorHarmonyManual”(4thedition，ContainerCorporationofAmerica)的色片相比較而確定的。
(c)生理學(xué)特征(1)生長(zhǎng)溫度范圍在酵母浸膏-麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，14到37℃(最適生長(zhǎng)溫度20至30℃)(2)明膠液化陽(yáng)性(3)淀粉水解陽(yáng)性(4)脫脂乳凝固作用陰性脫脂乳胨化作用陽(yáng)性(5)類黑素形成陰性(d)碳源的利用陽(yáng)性葡萄糖、木糖、鼠李糖未確定的果糖陰性阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇、肌醇根據(jù)上述微生物學(xué)特征，Y-53菌株被鑒定為鏈霉菌屬菌株;本發(fā)明人將其定各為鏈霉屬Y-53菌株。Y-53菌株已寄存于發(fā)酵研究所(Osaka)，寄存登記號(hào)為IFO-14596;并于1987年8月13日寄存于日本國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)廳工業(yè)科學(xué)技術(shù)局發(fā)酵研究所，登記號(hào)為FERM-P9518，該寄存物按布達(dá)佩斯條約的規(guī)定同時(shí)寄存于FRI，登記號(hào)為FERMBP-1889，并寄存于CCTCC，登記號(hào)為CCTCCM88066。
應(yīng)提到的是，只要能產(chǎn)生酰基氨基酸外消旋酶，任何借助于細(xì)胞融合技術(shù)或?qū)⒕昊蛑徊糠?含有?；被嵬庀妇幋a區(qū))插入適當(dāng)宿主微生物所得到的轉(zhuǎn)化體自上述Y-53菌株或表Ⅰ所列出的其他?；被嵬庀干a(chǎn)微生物衍生的突變株或接合子均可用于本發(fā)明。
用于培養(yǎng)上述微生物的培養(yǎng)基可以是液體的或固體的，只要其含能被相關(guān)菌株利用的營(yíng)養(yǎng)源并促進(jìn)酰基氨基酸外消旋酶產(chǎn)生都是適用的。為進(jìn)行大批量培養(yǎng)，使用液體培養(yǎng)基更為方便。
用于制備培養(yǎng)基的物質(zhì)是一般適用于培養(yǎng)微生物的物質(zhì)，如碳源、氮源和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)素。如葡萄糖、甘油、糊精、淀粉、糖蜜及動(dòng)物和植物油可用作碳源;大豆粉、玉米漿、棉籽粉、肉汁、蛋白胨、酵母浸膏、硫酸銨、硝酸鈉和尿素等可用作氮源。如必要時(shí)可進(jìn)一步加入鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鐵鹽、鈷鹽、鋅鹽、磷酸鹽將其他鹽。
可用靜止培養(yǎng)法、振蕩培養(yǎng)法或需氧深層培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于大批量處理最好用需氧深層培養(yǎng)法。培養(yǎng)溫度為15-37℃，最好是20至37℃。培養(yǎng)基的pH最好保持在5至9。培養(yǎng)進(jìn)行18小時(shí)到4天，并當(dāng)積聚的?；被嵬庀傅牧窟_(dá)到最大時(shí)終止培養(yǎng)。
為了從培養(yǎng)物中收獲?；被嵬庀福紫纫噪x心或其他方法將培養(yǎng)物分離成細(xì)胞和培養(yǎng)濾液兩部分，如細(xì)胞中存在所說(shuō)的酶可單獨(dú)或結(jié)合使用溶解酶處理、超聲處理、French壓濾處理及Dyno-Mill壓榨處理等各種細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞，以使酶溶出。如所說(shuō)的酶存在于培養(yǎng)物濾液中，則可直接對(duì)培養(yǎng)物濾液進(jìn)行純化處理。
為了純化溶解的或存在于培養(yǎng)物濾液中的所說(shuō)的酶，可結(jié)合使用已知的酶純化方法，如利用硫酸銨等的鹽析法、利用羧甲基纖維素等的陽(yáng)離子交換層析法、利用二乙氨基乙基纖維素等的陰離子交換層析法、利用葡聚糖凝膠等的凝膠過(guò)濾法、利用疏水樹(shù)脂的疏水層析法以及親合層析法，從而可得到具有所要求之純化程度的酰基氨基酸外消旋酶標(biāo)準(zhǔn)樣品。
按本發(fā)明的方法制得的?；被嵬庀妇哂邢率鑫锢砘瘜W(xué)性質(zhì)(1)作用所說(shuō)的酶作用于L-Nα-?；被崾怪D(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-Nα-?；被幔⒆饔糜贒-Nα-?；被崾怪D(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-Nα-?；被?。即該酶催化由下式顯示的可逆反應(yīng)
L-Nα-?；被?()/() D-Nα-?；被?2)底物特異性如下列表3中所示，該酶可作用于旋光Nα-酰基氨基酸，但對(duì)相應(yīng)的旋光α-氨基酸則不起作用。
應(yīng)提到的是，表3中的相對(duì)活性是用Nα-?；被嶙鞯孜铮?3)中所述的酶活性檢測(cè)法測(cè)定的，其中代表所產(chǎn)生之α-氨基酸量(mM)(相當(dāng)于各底物者)的數(shù)值是基于將所產(chǎn)生的蛋氨酸的量定為100而計(jì)算的。當(dāng)?shù)孜锸荓-Nα-?；被釙r(shí)，用Y-53菌株產(chǎn)生的D-?；被崴饷复鍸-?；被崴饷?。當(dāng)?shù)孜锸切獍被釙r(shí)，在用D或L-氨基酸氧化酶(均由Sigma公司生產(chǎn))處理后，即可將反應(yīng)液作高效液相層析，以確定是否已形成了底物的光學(xué)對(duì)映體。
(3)酶活性測(cè)定方法酰基氨基酸外消旋酶催化可逆反應(yīng)。即是說(shuō)，當(dāng)用D-Nα-?；被嶙鞯孜飼r(shí)，隨著反應(yīng)進(jìn)行而產(chǎn)生并積聚的L-Nα-?；被岢蔀樗f(shuō)酶的另一種底物，因此它也受到酶的作用并轉(zhuǎn)化成D-Nα-?；被?，即底物。為了測(cè)定真空反應(yīng)速度，必須將反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化成其他化合物并將其從反應(yīng)系統(tǒng)中除去。
為此目的，當(dāng)產(chǎn)物是L-或D-Nα-?；被釙r(shí)，本發(fā)明人向反應(yīng)系統(tǒng)中加入了過(guò)量的L-或D-?；被崴饷敢詸z測(cè)酶的活性，從而使產(chǎn)物的脫酰反應(yīng)得以同時(shí)進(jìn)行，并檢測(cè)了最終積聚的L-或D-氨基酸的量，該數(shù)值(μM)被看作是相等于已產(chǎn)生的L-或的D-Nα-酰基氨基酸的量。
使用包含50μl酶溶液、40μl底物溶液、10μlL-?；被崴饷溉芤汉?00μl50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)的混合反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定酶活性。作為酶溶液，使用了將?；被嵬庀笜?biāo)準(zhǔn)樣品以1-0.2單位/ml的濃度溶解于Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中所制成的溶液;作為L(zhǎng)-酰化氨基酸水解酶溶液，則使用了將L-?；被崴饷笜?biāo)準(zhǔn)樣品(如可用由Sigma公司生產(chǎn)的商品酶，但本發(fā)明中使用的是由Y-53菌株提取并純化的L-?；被崴饷?以40-8單位/ml的濃度溶解在Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中所制成的溶液。
按照Tris-HCl緩沖液、底物溶液、L-酰化氨基酸水解酶溶液和酶溶液的順序依次加入各溶液并混合之，在加入酶溶液的同時(shí)于30℃開(kāi)始反應(yīng)。如果酶溶液的活性低，可使反應(yīng)持續(xù)120分鐘;如果酶活性高則持續(xù)10分鐘，并于100℃加熱處理3分鐘以終止反應(yīng)。
為測(cè)定酶活性，用高效液相層析法檢測(cè)反應(yīng)系統(tǒng)中所產(chǎn)生的蛋氨酸的量，并將相當(dāng)于產(chǎn)生1μmol/分蛋氨酸的酶活性定為1個(gè)單位。當(dāng)在x分鐘的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)反應(yīng)系統(tǒng)中已產(chǎn)生了ymM濃度的蛋氨酸時(shí)，則可用下列公式計(jì)算50μl溶液中所含酶活性(a單位)a＝ (y)/(2x)(4)酶活性的最適pH和保持酶穩(wěn)定性的pH范圍按上述檢測(cè)酶活性的方法使反應(yīng)進(jìn)行2或4小時(shí)，但分別使用乙酸鈉-HCl緩沖液(pH4.0，5.0)、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0、7.0、8.0)、磷酸二氫鉀-硼酸鈉(pH6.3、7.8、8.3、9.0)和碳酸鈉-硼酸鈉(pH9.2、10.0、10.9)代替Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，并根據(jù)所產(chǎn)生之蛋氨酸的量的比例計(jì)算各溶液中酶的相對(duì)活性。


圖1顯示當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)時(shí)各pH值的溶液中的相對(duì)酶活性;由圖1可知最適pH為大約8。
圖2顯示當(dāng)反應(yīng)時(shí)間由2小時(shí)延長(zhǎng)到4小時(shí)時(shí)，所產(chǎn)生之蛋氨酸的量增加的程度。反應(yīng)進(jìn)行4小時(shí)所產(chǎn)生的蛋氨酸的量為2小時(shí)反應(yīng)所得蛋氨酸量的近2倍，故可以說(shuō)在該反應(yīng)條件下酶是穩(wěn)定的。由圖2可知在pH6至9時(shí)?；被嵬庀甘欠€(wěn)定的。
(5)作用的適宜溫度范圍在25、30、35、40、50、60或70℃等不同反應(yīng)溫度(30℃)用檢測(cè)酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法(見(jiàn)(3)中所述)檢測(cè)由N-酰基-D-蛋氨酸產(chǎn)生的L-蛋氨酸的量。所用的酶的量逐漸增加，反應(yīng)時(shí)間為5分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，作用的適宜溫度范圍為30至50℃。
(6)不同溫度對(duì)酶活性的影響于30、35、40、50、60或70℃加熱處理30分鐘后，用檢測(cè)酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)酶溶液的殘留活性。所得結(jié)果以黑色點(diǎn)線示于圖4中。
由該曲線可以看出，在40℃以下的酶是穩(wěn)定的，但溫度高于50℃則酶失活。另外使用如上所述的同樣條件但向酶溶液內(nèi)加入1mM鈷離子，進(jìn)行加熱處理并測(cè)定殘留活性;如此所得結(jié)果與沒(méi)有Co++離子條件下所得結(jié)果不同。圖4中用白色點(diǎn)線示出了存在所加Co++離子時(shí)得到的結(jié)果;由此可知存在Co++離子的情況下酶在50℃以下是穩(wěn)定的并在60℃時(shí)失活。
(7)金屬離子的影響使用無(wú)金屬鹽溶液作對(duì)照，按(3)中所述的檢測(cè)酶活性的方法進(jìn)行反應(yīng)，但除去加到底物溶液內(nèi)的12.5mM(在反應(yīng)混合物中的終濃度為1mM)氯化鈷，代之以加入12.5mM或125mM(在反應(yīng)混合物中的終濃度分別為1mM或10mM)各種金屬鹽或EDTA，并檢測(cè)金屬離子對(duì)酶活性的影響。應(yīng)提到的是，業(yè)已證明用于本實(shí)驗(yàn)的L-?；被崴饷傅幕钚圆皇苓@些添加物的影響。結(jié)果如表4中所示。表4所示的酶活性是在將無(wú)添加物時(shí)所得到的值定為100的基礎(chǔ)，以相對(duì)活性的形式給出的。
表4金屬離子對(duì)酶活性的影響
如表4所示，在某一限定的濃度范圍的幾種金屬離子存在下，所說(shuō)的酶顯著地被激活了。即，鈷離子在低濃度(約1mM)時(shí)具有顯著的活化作用，但濃度為10mM時(shí)則很難激活該酶。鋅離子和鎳離子具有相似的傾向。鎂離子濃度為10mM時(shí)比1mM時(shí)活化作用大。錳離子和二價(jià)鐵離子具有相似的傾向。被檢測(cè)的幾種金屬離子中，銅離子表現(xiàn)有明顯的抑制作用。鋁離子和鉬離子在濃度為10mM時(shí)也抑制酶活性。EDTA在濃度為10mM時(shí)具有顯著的抑制作用。
(8)分子量約200，000其為按照Davis[Ann.N.Y.Acad.Sci.，121，404(1964)]所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)得的實(shí)施例2中表5第5步驟所制得之酶的分子量;電泳所用的條件是聚丙烯酰胺梯度凝膠，PAG平板4/15(由日本DaiichiPureChemicals公司生產(chǎn));30mA(恒定電流)2小時(shí)。酶的分子量是根據(jù)比較樣品酶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率來(lái)估計(jì)的。
使用SDS-PAG平板4/20(日本DaiichiPureChemicals公司)，在十二烷基硫酸鈉(SDS)存在下以同樣方法并在同樣條件下檢測(cè)該酶之亞單位的分子量。估計(jì)亞單位的分子量為大約40，000道爾頓。
(9)等電點(diǎn)使用載體兩性電解質(zhì)以瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)得等電點(diǎn)為4.8。電泳使用電泳裝置(2117型MultiphorⅡ，LKB)和Pharmalyte，pH3到10(Pharmacia，瑞典)以恒定電泳(2W)進(jìn)行2.5小時(shí)。
本發(fā)明的酰基氨基酸外消旋酶，當(dāng)與L-?；被崴饷富駾-?；被崴饷附Y(jié)合使用時(shí)，能夠以一步驟由廉價(jià)的DL-Nα-酰基氨基酸生產(chǎn)旋光L-α-氨基酸或旋光D-α-氨基酸。
用已知方法很容易制得L?；被崴饷?，但亦可使用市售產(chǎn)品。據(jù)報(bào)導(dǎo)，可由鏈霉菌屬[日本已公開(kāi)未審查專利申請(qǐng)No.126969/1987和126976/1987]、假單胞菌屬[Nature，170，888(1952);日本已公告專利申請(qǐng)No.31477/1985]和產(chǎn)堿桿菌屬[ProceedingsoftheannualmeetingoftheAgriculturalChemicalSocietyofJapan，1987，pp.659]的細(xì)菌產(chǎn)生D-酰化氨基酸水解酶。此外，本發(fā)明中作為?；被嵬庀干a(chǎn)微生物分離的大多數(shù)菌株不僅可產(chǎn)生?；被嵬庀?，且可產(chǎn)生D-酰化氨基酸水解酶和/或L-?；被崴饷?。
因此，為了由作為原料的DL-Nα-?；被嵘a(chǎn)旋光α-氨基酸，須由以本發(fā)明之方法生產(chǎn)的具有不同純化程度的酰基氨基酸外消旋酶標(biāo)準(zhǔn)樣品中選擇一種適用于這一目的和使用方式的標(biāo)準(zhǔn)樣品。例如欲生產(chǎn)L-α-氨基酸時(shí)，所選擇的標(biāo)準(zhǔn)酶樣品和L-?；被崴饷?其為由市場(chǎng)上購(gòu)得的或自某種適當(dāng)L-酰化氨基酸生產(chǎn)微生物中分離的)是結(jié)合形式的或另外用DL-Nα-?；被崽幚磉^(guò)的。當(dāng)原料已最后100%轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-α-氨基酸時(shí)，終止反應(yīng)并由反應(yīng)混合物中回收所需的L-α-氨基酸。
這里，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的使用目的是生產(chǎn)L-氨基酸時(shí)，它必須符合這樣的要求，即標(biāo)準(zhǔn)樣品中不含有L-酰化氨基酸水解酶。如將酶固定作為生物反應(yīng)器使用，標(biāo)準(zhǔn)樣品可以是含酶的細(xì)胞，且在使用俘獲固定法中其可以是無(wú)細(xì)胞提取物，而標(biāo)準(zhǔn)樣品的純化程度必須稍高于使用離子交換樹(shù)脂吸附法或不溶性載體共價(jià)結(jié)合法時(shí)的純化程度。
如果?；被嵬庀干a(chǎn)微生物即不產(chǎn)生L-酰化氨基酸水解酶也不產(chǎn)生D-?；被崴饷?，則用于本發(fā)明之旋光氨基酸生產(chǎn)方法的?；被嵬庀笜?biāo)準(zhǔn)樣品可包括培養(yǎng)的微生物細(xì)胞、其加工產(chǎn)品以及自細(xì)胞中提取和純化至不同純度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
如果酰基氨基酸外消旋酶生產(chǎn)微生物還產(chǎn)生L-?；被崴饷富駾-?；被崴饷福瑒t可按使用上述微生物的同樣方法將其用于生產(chǎn)L-α-氨基酸或D-α-氨基酸。在這種情況下，如果所產(chǎn)生的L-?；被崴饷富駾-?；被崴饷傅幕钚赃h(yuǎn)比?；被嵬庀傅幕钚詮?qiáng)，則不必另外再加L-或D-?；被崴饷浮?br> 如果?；被嵬庀干a(chǎn)微生物還產(chǎn)生L-酰化氨基酸水解酶或D-?；被崴饷?，可用常規(guī)方法突變誘導(dǎo)缺乏D-或L-?；被崴饷傅木?，以分別產(chǎn)生L-氨基酸或D-氨基酸。根據(jù)需要還可使用包括培養(yǎng)的細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)酶樣品在內(nèi)的各種處于不同純化水平的加工產(chǎn)物。
應(yīng)注意的是，如加工產(chǎn)物是培養(yǎng)的細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞提取物，則可含有一種分解所需氨基酸的酶;在這種情況下，必須去掉該氨基酸分解活性。如果微生物不是缺乏?；被崴饷傅木?，便難于用它在細(xì)胞水平上直接生產(chǎn)旋光α-氨基酸，但可以在不影響?；被嵬庀傅那闆r下用加熱處理或加入抑制劑等方法使一種或兩種?；被崴饷甘Щ钪笫褂弥?。為了由共產(chǎn)生L-和D-酰化氨基酸水解酶的菌株中制備?；被嵬庀傅臉?biāo)準(zhǔn)樣品，可先由培養(yǎng)的細(xì)胞中提取?；被嵬庀?，然后分離并除去影響生產(chǎn)預(yù)期氨基酸的?；被崴饷?，且必要時(shí)可再增加某種純化步驟，從而制得標(biāo)準(zhǔn)樣品。
用酰基氨基酸外消旋酶和L-或D-?；被崴饷干a(chǎn)L-或D-α-氨基酸時(shí)，通?？墒褂眠@樣一些方法如(1)將?；被嵬庀傅臉?biāo)準(zhǔn)樣品及L-或D-?；被崴饷溉芙庥趐H為6-9含有適當(dāng)量原料DL-Nα-?；被峒癈o++或其他金屬離子的緩沖液中，將該溶液放置于適當(dāng)溫度下直到反應(yīng)完成;(2)用已知方法一起或分別固定?；被嵬庀傅臉?biāo)準(zhǔn)樣品和L-或D-酰化氨基酸水解酶，然后以一或多階段將其裝入反應(yīng)容器中，以制成生物反應(yīng)器，使pH為6至9含有DL-Nα-?；被岷虲o++或其他金屬離子的緩沖液通過(guò)該反應(yīng)器以引起反應(yīng);(3)將兩種溶解于被超濾膜分成2個(gè)室之反應(yīng)器的一個(gè)室中，加入原料溶液以引起反應(yīng)，并回收已通過(guò)超濾膜的產(chǎn)物。無(wú)論使用哪種方法，反應(yīng)混合物都要滅菌并盡可能地?zé)o菌操作。
因?yàn)槿绱酥频玫淖罱K反應(yīng)混合物只含有由所需之旋光氨基酸的水解作用而產(chǎn)生的有機(jī)酸和?；鶊F(tuán)，所以很容易用常規(guī)方法回收所要的氨基酸。
圖1顯示?；被嵬庀傅膒H依賴性。
圖2顯示在不同pH值條件下借助?；被嵬庀杆a(chǎn)生的蛋氨酸的量;這些量是以基于將2小時(shí)反應(yīng)(
)的量定為1而計(jì)算的4小時(shí)反應(yīng)(
)的量的相對(duì)值表示的。
圖3顯示反應(yīng)溫度與?；被嵬庀钢富钚灾g的關(guān)系。
圖4顯示?；被嵬庀傅臒岱€(wěn)定性。
實(shí)施例1向200ml錐形瓶?jī)?nèi)各加入20ml含BBL胰酶解酪蛋白一大豆培養(yǎng)液(購(gòu)自BectonDickinson公司)和0.1%N-乙?；?D-蛋氨酸的培養(yǎng)基(pH7.0)并于120℃消毒20分鐘。另外，經(jīng)液體培養(yǎng)后，將鏈霉菌屬Y-53菌株儲(chǔ)存于冷卻條件(-80℃)下，以備需要時(shí)用作種菌接種物溶液。
向30個(gè)含上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)以每瓶0.7ml的量無(wú)菌接種冷凍的微生物(在溶液中)于28℃振蕩培養(yǎng)2天以產(chǎn)生種子菌培養(yǎng)物。然后將各種子菌培養(yǎng)物以每瓶1ml的量移入含同樣培養(yǎng)基的500個(gè)培養(yǎng)瓶中，并于28℃振蕩培養(yǎng)42小時(shí)。收集培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)容物并經(jīng)離心(4℃，10，000rpm、15分鐘)收集細(xì)胞。用生理鹽水洗細(xì)胞并得到216g濕細(xì)胞。以下程序均在4℃以下完成。
將216g濕細(xì)胞懸浮于1升50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并加于Dyno-Mill細(xì)胞破碎器(MillyA.BachofenAG生產(chǎn))中以破碎細(xì)胞。所用玻璃珠直徑為0.1至0.2mm，流速為60ml/分。于4℃將處理的細(xì)胞液以10，000rpm離心20分鐘，得到1700ml無(wú)細(xì)胞提取物。該提取物的?；被嵬庀富钚詾?.9單位，比活性為0.52毫單位/mg蛋白。用Bio-Rad蛋白分析法測(cè)定總蛋白量。
實(shí)施例2于冷卻和攪拌下向1700ml實(shí)施例1中制得的無(wú)細(xì)胞提取物內(nèi)緩慢加入300g硫酸銨。全部加完后，繼續(xù)攪拌30分鐘以上，于4℃以10，000rpm將混合物離心30分鐘，得到1660ml澄清的上清液。
將1660ml上清液吸附于用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含30%飽和硫酸銨)平衡過(guò)的TSKHW65C柱(4.8cm×30cm)(日本Tosoh公司，)上，用1000ml上述磷酸鹽緩沖液洗柱，然后用不含硫酸銨的磷酸鹽緩沖液洗脫蛋白組分，并收集顯示有預(yù)期之酶活性的洗脫部分。于冷卻和攪拌下向所得330ml活性部分中緩慢加128g硫酸銨。以10，000rpm離心30分鐘以收集所得沉淀。將沉淀物溶解于50ml50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并過(guò)SephadexG25柱(Phamacia，瑞典)除鹽。將如此制得的粗酶溶液吸附于用50mM磷酸鹽緩沖液平衡過(guò)的DEAEToyopearl650M柱(Tosoh公司，日本)上。用1000ml同樣緩沖液洗柱，然后用含有0.2MNaCl的同樣緩沖液洗脫得到340ml活性部分。用常規(guī)方法向該活性部分中加入133g硫酸銨。離心(4℃、10，000rpm、30分鐘)收集所得沉淀并溶解于30ml同樣的緩沖液。使該溶液通過(guò)一個(gè)SephadexG5柱脫鹽，并得到59ml粗酶溶液。使該粗酶溶液吸附于用同樣緩沖液平衡過(guò)的DEAE-5PW柱(日本Tosoh公司，2.15cm×15cm)上進(jìn)行制備高效液相層析(HLC-837型，日本Tosoh公司)，并用0至0.5M線性濃度梯度NaCl洗脫。洗脫速度為每分鐘4ml?；厥赵?2至36分鐘時(shí)洗脫的部分，得到16ml活性部分。該部分中的?；被嵬庀富钚詾榇蠹s7.2單位，且比活性為大約63毫單位/mg蛋白。比活性增加到無(wú)細(xì)胞提取物之比活性的約122倍。
將該活性部分進(jìn)一步加到用50mM磷酸鹽緩沖液平衡過(guò)的TSK-G3000SW柱(日本Tosoh公司，5.5cm×60cm)上，以1ml/分的流速進(jìn)行凝膠過(guò)濾，并分別得到活性部分。因該部分在聚丙烯酰胺凝膠電泳中呈現(xiàn)出單一的帶，故可推斷?；被嵬庀敢训玫郊兓Ｔ摬糠种絮；被嵬庀富钚詾?.2單位，比活性為2.8單位/mg蛋白。
表5中給出了各個(gè)純化步驟中所得部分的?；被嵬庀缚偦钚?、總蛋白含量和比活性以及各樣品溶液的體積。
實(shí)施例3在10升培養(yǎng)基中按實(shí)施例1的同樣方法培養(yǎng)鏈霉菌屬Y-53菌株。培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞并用0.8%NaCl溶液洗一次。得到300g濕細(xì)胞。
按實(shí)施例1中所述同樣方法用Dyno-Mill(一種細(xì)胞破碎器)破碎濕細(xì)胞并離心(10，000rpm，20分鐘)得到1680ml上清液。該上清液中含21單位?；被嵬庀?、315單位L-酰化氨基酸水解酶和75單位D-?；被崴饷?。向該上清中加入硫酸銨達(dá)到30%飽和度，并離心除去沉淀物。再向離心的上清中加入硫酸銨達(dá)到60%飽和度并離心除去所得沉淀物。將得到的沉淀物溶解于50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并使用已經(jīng)過(guò)同樣緩沖液平衡過(guò)的SephadexG25柱凝膠過(guò)濾脫鹽。對(duì)所得溶液進(jìn)行離子交換層析。
將上述已除鹽的溶液(490ml)加至用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡過(guò)的DEAEToyopearl650M柱(樹(shù)脂體積700ml)上并用2升同樣磷酸鹽緩沖液洗柱，從而洗出非吸附的組分。由洗出液中回收到114單位D-?；被崴饷?。該DEAEToyopearl650M柱上相當(dāng)強(qiáng)地吸附了?；被嵬庀?約20單位)和L-?；被崴饷?約900單位)，除非使用大于0.2摩爾的鹽溶液否則便不能將它們洗脫下來(lái)。
將上述柱置于30℃下，使含有0.5%N-乙?；?DL-蛋氨酸和1mM氯化鈷的20mM磷酸鹽緩沖液以每小時(shí)30ml的流速通過(guò)柱。收集3升洗脫液并過(guò)IR120陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，然后在減壓下濃縮使之干燥成為固態(tài)。用10ml冷的無(wú)水乙醇洗兩次后將所得殘留物溶解于約100ml熱水中，并過(guò)濾收集冷卻后析出的結(jié)晶。此外，向?yàn)V液內(nèi)逐滴加入乙醇并將所得混合物放置過(guò)夜。收集析出的結(jié)晶并干燥之，得到9.6g L-蛋氨酸。其熔點(diǎn)為280至281℃，[α]25D-8.2°(C＝1%)。該產(chǎn)物在高效液相層析及薄層層析中顯示有與L-蛋氨酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品同樣的行為。另外，當(dāng)該產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)樣品一起熔融時(shí)，未顯示熔點(diǎn)下降。
實(shí)施例4向置于200ml錐形瓶中之20ml含1.5%甘油、1.0%蛋白胨、1.0%酵母浸膏、0.5%Na Cl、0.25%K2HPO4、0.25%MgSO4·7H2O和0.05%N-乙?；?DL-蛋氨酸的種子菌培養(yǎng)基(pH7.0)中接種0.7ml實(shí)施例1中制備的原培養(yǎng)物并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上(200rpm)28℃培養(yǎng)18小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物移入200ml錐形瓶中之25ml含0.5%甘油、1.0%蛋白胨、0.5% Na Cl、0.25%K2HPO4和0.05%N-乙?；?DL-蛋氨酸的生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH7.0)中。于上述的同樣條件下進(jìn)行培養(yǎng)。于0至4℃下完成以下程序。
離心(10，000rpm，15分鐘)收獲5升培養(yǎng)液中的細(xì)胞并用0.85%Na Cl水溶液洗滌。將洗過(guò)的細(xì)胞(385g，濕重)懸浮于1升50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并用Dyno-Mill(Willy A.Bachofen AG)于下述條件下破碎之玻璃珠直徑0.1至0.2mm;細(xì)胞懸浮液流速60ml/分;轉(zhuǎn)速3，000rpm。離心(10，000rpm，20分鐘)除去已破碎的細(xì)胞。所得上清液(1280ml)含75單位?；被嵬庀富钚院?，500單位L-?；被崴饷富钚?。按實(shí)施例2中所述的方法向該無(wú)細(xì)胞提取液(1280ml)中加入500g(NH4)2SO4達(dá)到60%飽和度。離心(10，000rpm，30分鐘)收集所得沉淀并溶解于600ml之50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。用纖維素袋對(duì)同樣緩沖液將酶溶液透析18小時(shí)。將除鹽后的酶溶液加于用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡過(guò)的DEAE-Toyopearl 650M柱(3cm×30cm)(日本Tosoh公司)上。用1，000ml同樣緩沖液并進(jìn)一步用1，000ml含1mM Co Cl2的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗柱。
吸附于該柱上的酰基氨基酸外消旋酶和L-?；被崴饷傅目偦钚苑謩e為43和800單位。將上述柱置于28℃下，使2，000ml含0.5% N-氯乙酰基-D-纈氨酸、1mM Co Cl2和1μg/ml硫酸雙氫鏈霉素的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)以60ml/小時(shí)的流速通過(guò)柱。反應(yīng)終止后，用500ml含有1mM Co Cl2的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗柱。收集洗脫物并用高效液相層析法分析之，但在該溶液中并沒(méi)有測(cè)到N-氯乙?；?D-纈氨酸。洗脫物于真空中濃縮后，向其中加入冷乙醇。過(guò)濾收集所得沉淀的白色固體物，用冷乙醇洗滌并溶解于小量水-乙醇中。將其放置于4℃下得到無(wú)色小葉狀結(jié)晶物。過(guò)濾收集結(jié)晶并干燥之。產(chǎn)量為4.5g。熔點(diǎn)為315℃(分解)，[α]25D+64°(C＝1，H2O)。該結(jié)晶的樣品溶液在高效液相層析和薄層層析中分別顯示有與L-纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品同樣的滯留時(shí)間和Rf值。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)具有下列特性之酰基氨基酸外消旋酶的方法(1)使D-N-?；?α-氨基羧酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-N-酰基-α-氨基羧酸，(2)使L-N-酰基-α-氨基羧酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-N-?；?α-氨基羧酸，(3)不能使D-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-α-氨基酸，(4)不能使L-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-α-氨基酸，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生所說(shuō)的酶的微生物，以在培養(yǎng)液中積聚所說(shuō)的酶并收獲所說(shuō)的酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中作為底物的N-酰基-α-氨基羧酸具有下列結(jié)構(gòu)通式
其中X是可被取代的羧酸衍生的?；琑是可被取代的C1-20烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中X是可被囟素、C1-3烷基、C1-3烷氧基和/或硝基取代的C1-3烷?；虮郊柞；?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中R是直鏈或分枝鏈C1-6烷基。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中R是被羥基、C1-3烷基硫代、硫羥、苯基、羥苯基或吲哚基取代的C1-3烷基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中R是被氨基、羥基、胍基或咪唑基取代的C1-4烷基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其為由能產(chǎn)生酶的微生物產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中酰基氨基酸外消旋酶還含有?；被崴饷?。
9.生產(chǎn)旋光D-或L-氨基酸的方法，其包括使依據(jù)權(quán)利要求1的?；被嵬庀冈贒-或L-?；被崴饷复嬖谙屡cDL-N-酰基-α-氨基羧酸接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及?；被嵬庀福渖a(chǎn)方法及應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/90GK1035320SQ88106108
公開(kāi)日1989年9月6日 申請(qǐng)日期1988年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1987年8月21日
發(fā)明者高橋健, 波多野和德 申請(qǐng)人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社