專利名稱：生產Af1 II限制性核酸內切酶和甲基代酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及Af1Ⅱ限制性核酸內切酶和修飾性甲基化酶的克隆，以及由這些克隆生產酶的方法。
限制性核酸內切酶是一類天然產生于細菌中的酶。將它們由其他污染的細菌成分中純化出來后，即可在實驗室中用以將DNA分子切成有明確大小的片段。限制性核酸內切酶的這一性質，使DNA分子得以很好地鑒定並可被分離成其組成基因。已證明限制性核酸內切酶是現代遺傳學研究中必不可少的工具。它們是生物化學“剪刀”，借助這些“剪刀”得以完成基因工程和分析工作。
限制性核酸內切酶是通過識別和結合DNA分子上特定的核苷酸順序(“識別順序”)而起作用的。一旦結合，它們即可在分子內或在其一側切斷核苷酸順序。不同的限制性核酸內切酶對不同的識別順序有親合性。迄今已在數百種細菌中鑒定出近一百種限制性核酸內切酶。
每種細菌至多具有很小量限制性核酸內切酶。核酸內切酶一般是根據得到這些酶的細菌或命名的。例如，埃及嗜血桿菌(Haemophilusaegyptius)可合成三種不同的限制性核酸內切酶，即HaeⅠ，HaeⅡ和HaeⅢ。這三種酶分別識別和裂解順序(AT)GGCC(AT)、PuGCGCPy和GGCC。另一方面，大腸桿菌RY13則只合成一種的切酶即EcoRI，該酶可識別順序GAATTC。
雖然理論上尚沒有明確的解釋，但據信限制性核酸內切酶在細菌細胞的正常生長中起到一種保護性作用。它們使細菌能夠對抗那些可破壞或寄生于其中的病毒和質粒等DNA分子的感染。它們是通過識別感染性DNA分子的全長並在每個出現識別順序的部位切斷之而使細菌得有這種抗性的。從而使許多感染性基因失去感染能力並使之對非特異性核酸內切酶的進一步降解作用具有敏感性。
細菌的保護性系統(tǒng)的第二個成分是修飾性甲基化酶。這些酶互補于限制性核酸內切酶，它們的作用在于使細菌能夠保護其自身DNA並將自身DNA與外來的感染性DNA區(qū)別開。修飾性甲基化酶所能識別和結合的順序與限制性核酸內切酶所識別和結合的核苷酸識別順序相同，但它們不是破壞DNA，而是通過加入一個甲基基團來對該順序內的某一個核苷酸進行化學修飾。經甲基化后，識別順序就不再被限制性核酸內切酶結合或裂解。細菌細胞的DNA總是要借助其修飾性甲基化酶的活性被充分修飾，因而對內源性限制性核酸內切酶的存在完全失去敏感性。只有未被修飾的，並因此而可鑒別的、外來的DNA，才對限制性核酸內切酶識別和攻擊具有敏感性。
隨著基因工程技術的出現，現已有可能克隆基因並由之產生蛋白質和酶類，而且產量要比使用常規(guī)的純化技術大得多。分離限制性核酸內切酶基因之克隆的關鍵在于找到一種簡單而可靠的方法，借以在復雜的“基因庫”一即通過“霰彈”方法得到的克隆群體中鑒別出這些只以低至10-3至10-4的頻率出現的所需克隆。該方法最好是有選擇性的，這樣便可使大多數不需要的克隆被破壞掉，而留下很小數所需克隆。
Ⅱ型限制-修飾系統(tǒng)是以不斷增加的頻率被克隆的。第一個克隆的系統(tǒng)作為鑒定或選擇限制性核酸內切酶克隆的方法使用了噬菌體感染(EcoRⅡKosykh等，Molec.gen.Genet178717-719，(1980);HhaⅡMann等，Gene397-112，(1978);PstⅠWalder等，Proc.Natl.Acad.Sci.781503-1507，(1981))。因為細菌中存在有限制-修飾系統(tǒng)，故使之能夠對抗噬菌體的感染，而攜帶克隆之限制-修飾基因的細胞原則上便能作為幸存者由已與噬菌體接觸的庫中被選擇性地分離出來。但發(fā)現這種方法只有有限的價值。特別是已發(fā)現克隆的限制-修飾基因並不總是表現能賦予選擇的存活體以足夠的抗噬菌體抗性。另一克隆方法包括將最初定性為質粒攜帶的系統(tǒng)轉移到大腸桿菌克隆質粒中(EcoRVBougueleret等，Nucl.Acid.Res.123659-3676，1984;PaeR7Gingeras和Brooks，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80402-406，1983;Theriault和Roy，Gene19355-359，1982;PvuⅡBlumenthal等，J.Bacteriol.164501-509，1985)。最后，現已通過選擇我們的707079號專利申請所岬降幕钚約諄富蚨寺×嗽嚼叢蕉嗟南低常˙suRIKiss等，Nucl.Acid.Res.136403-6421，1985)。因為限制和修飾基因常常密切相連，故可將這兩個基因同時進行克隆。但這一選擇作用并不總是得到完全的限制系統(tǒng)，而是只產生出甲基化酶基因(BspRISzomolanyi等，Gene10219-225，1980;BcnIJanulaitis等，Gene20197-204，1982;BsuRIKiss和Baldauf，Gene21111-119，1983;MspⅠWalder等，J.Biol.Chem.2581235-1241，1983)。
在某些系統(tǒng)中，克隆問題可能在于試圖將核酸內切酶基因引入並不總是能通過修飾作用得以保護的宿主內。如果將核酸內切酶基因和甲基化酶基因引入同一DNA片段上，則在核酸內切酶基因切酶基因切斷宿主基因組之前，甲基化酶基因必定會修飾或保護該宿主。
在克隆各種不同的甲基化酶的過程中，發(fā)現了在大腸桿菌中克隆這些系統(tǒng)的另一個障礙。許多大腸桿菌菌株(包括正常用于克隆的菌株)都具有抵抗含有胞嘧啶甲基化之DNA引入的系統(tǒng)(Raleigh和Wilson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA839070-9074，1986)。因此，還必須慎重地考慮用那個大腸桿菌菌株進行克隆。
因為純化的限制性核酸內切酶，以及純化到較低程度的修飾性甲基化酶是實驗室中定性和重新排列DNA的有用工具，所以從商業(yè)角度積極鼓勵通過重組DNA技術得到能夠大量合成這些酶的菌株。這些菌株所以有用是因為它們可簡化純化工作並提供了商業(yè)化生產這些酶的方法。
本發(fā)明提供了一個含有得自水花魚腥藻(Anabaenaflosaquae)之Af1Ⅱ限制性核酸內切酶和修飾性甲基化酶基因的克隆，以及生產這些酶的相關方法。更具體地說，本發(fā)明是涉及表達限制性核酸內切酶Af1Ⅱ(一種識別DNA順序CTTAAG並在C和T殘基之間裂解該順序的酶)的克隆(見Whitehead，P.R.和Brown，N.L.，1985，J.Gen.Microbiol.131951-958，該文獻列入本文參考文獻)。依據本發(fā)明的方法生產的Af1Ⅱ限制性核酸內切酶基本上是純的並且沒有一般見于依常規(guī)技術生產的Af1Ⅱ制劑中的污染物(參見Whitehead和Brown，上述文獻)。
克隆這種酶的優(yōu)選方法包括制備成一個含有水花魚腥藻之DNA的基因庫、分離含有編碼Af1Ⅱ修飾性甲基化酶之DNA的克隆並篩選之，以鑒定那些也包含Af1Ⅱ限制性核酸內切酶基因的克隆。


圖1為克隆和生產Af1Ⅱ限制性核酸內切酶的流程。
圖2是編碼Af1Ⅱ限制性核酸內切酶及修飾性甲基化酶的12.4KbXhoⅡ片段插入部分的限制性酶切圖譜。
圖3顯示具有得自pKLAf1ⅡRM520-4粗提物之Af1Ⅱ限制性核酸內切酶活性的瓊脂糖的照片。
本發(fā)明涉及Af1Ⅱ限制性和修飾性基因的克隆，以及由這些克隆產生的限制性核酸內切酶Af1Ⅱ。Af1Ⅱ基因是使用具有下述優(yōu)點的方法克隆的，即某些克隆是在含有並表達Af1Ⅱ修飾酶或甲基化酶基因同時還含有Af1Ⅱ限制酶基因的基礎上被選擇的。這些克隆的DNA在體外可對抗Af1Ⅱ限制性核酸內切酶的消化作用。這種抗性為選擇性地分離為Af1Ⅱ甲基化酶和限制性核酸內切酶編碼的克隆提供一種手段。
使用本發(fā)明如圖1所圖解描述的方法，可很好地克隆並表達Af1Ⅱ限制性酶基因和甲基化酶基因，該方法包括以下步驟1.純化Anabaenaflos-aquae的DNA。有關Anabaenaflos-aquae已有許多出版物中描述過，其中包括列為本文參考文獻的Whitehead和Brown的文章(出處同上)。可由美國劍橋的藻類和原生動物保藏中心(CambridgeCollectionofAlgaeandProtozoa)得到，其保藏登記號為CCAP1403/13f;另外亦可由美國劍橋的Cambio公司(CambioCorporationofCambridge，England)得到。
2.用限制性核酸內切酶XhoⅡ部分消化該DNA。
3.使消化過的DNA與克隆載體如含有一Af1Ⅱ位點的pBR322衍生物相連接。其中一種優(yōu)選的載體是得自LabofinaS.A.ofFeluyBelgium的pJRD184。然后用所得到的混合物轉化一適當宿主如大腸桿菌RR1細胞。
4.將DNA/細胞混合物在含有對轉化細胞有選擇性之抗生素(如氨芐青霉素)的培養(yǎng)基上鋪板，保溫后，收集轉化了的細胞集落，一起進行單細胞培養(yǎng)，得到初級細胞庫。
5.由初級細胞庫整體純化重組質粒，以制得初級質粒庫。
6.用Af1Ⅱ限制性核酸內切酶體外充分消化質粒庫，該內切酶基本上是按照Whitehead和Brown(上述文獻)所述的方法由水花魚腥藻制得的，所不同的是ⅰ)刪去第一個Sepharose4B層析步驟ⅱ)刪去DEAE層析步驟;以及ⅲ)在肝素-Sepharo-se層析步驟之后包括一個單Q-FPLC層析步驟。Af1Ⅱ限制性核酸內切酶消化可選擇性地破壞未修飾的、不含甲基化酶的克隆，而導致攜帶Af1Ⅱ甲基化酶克隆之相對頻數的增加。亦可加入核酸外切酶和/或磷酸酶參予消化過程，以增加對無甲基化酶克隆的破壞。
7.將已消化的質粒庫DNA轉化到適用宿主如大腸桿菌株RR7中，並通過在抗生素培養(yǎng)皿上鋪板而再次得到轉化的菌落。收集各菌落並按下述方法分析以檢測其DNA中是否存在Af1Ⅱ修飾基因純化它們所攜帶的質粒DNA並在體外與Af1Ⅱ限制性核酸內切酶保溫，以檢測其是否對Af1Ⅱ的消化作用有抗性。同時還純化克隆的總細胞DNA(染色體和質粒DNA)與Af1Ⅱ限制性核酸內切酶保溫。攜帶Af1Ⅱ甲基化酶基因之克隆的DNA應受到充分修飾，而且應發(fā)現質粒DNA和總DNA對消化作用具有實質性地或完全地抗性。
9.制備步驟8中根據其攜帶Af1Ⅱ甲基化酶基因而鑒定的那些克隆的粗提物，並分析該提取物的Af1Ⅱ限制性核酸內切酶活性，進而鑒定出攜帶Af1Ⅱ限制性核酸內切酶的克隆。
10.可在含有氨芐青霉素的富集培養(yǎng)基中，用發(fā)酵器增值攜帶Af1Ⅱ限制性和修飾性基因的克隆以生產Af1Ⅱ限制性核酸內切酶。然后經離心收獲細胞並經超聲振蕩破壞之，以制得含有Af1Ⅱ限制性核酸內切酶活性的細胞粗提物。
11.用標準的蛋白質純化技術如親合層析或離子交換層析法純化含Af1Ⅱ限制性核酸內切酶活性的細胞粗提物。
雖然上面簡述的步驟代表了實踐本發(fā)明的優(yōu)選方案，但對于本領域內的熟練技術人員來說，顯然可以依據本領域內的已知技術對上述方法作若干改動。
下列實施例因其使用了優(yōu)選條件，因而可用于進一步闡明本發(fā)明的實施方案。應明確的是，該實施例只是作為舉例說明，而不能認為是對本發(fā)明待批權利要求中所指出之內容的限制。
實施例1Af1Ⅱ限制性核酸內切酶基因的克隆1.DNA純化為制備水花魚腥藻CCAP1403/13f的DNA，將1g細胞糊重新懸浮于5ml0.1MTris-HCl.0.1MEDTA(pH7.6)中。將懸浮液分成兩份各2.5ml。每份內各加入3.5ml濃度為1.7mg/ml的溶菌酶(溶于0.1MTris-HCl、0.1MEDTA，pH7.6中)並于37℃保溫15分鐘。加入SDS至1%，蛋白酶K至0.13mg/ml，然后于37℃保溫1小時。各份內再各加入0.4ml10%SDS和8%Sarcosyl並于55℃繼續(xù)保溫2小時。然后將這兩部分合并並對四次更換的DNA緩沖液(10mMTris-HCl、1mMEDTA，pH8.0)透析24小時。第一次透析后，以17，000rpm離心DNA溶液10分鐘，以除去固體碎片。將澄清了的上清液移入透析管並繼續(xù)透析。然后向DNA溶液內加入DNA緩沖液使其體積達到40ml，再將該溶液分成兩份每份各20ml並各加20g氯化和0.2ml(濃度為5mg/ml)溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，以進行氯化銫-溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓平衡密度離心。將DNA溶液以44，000rpm離心48小時，並用注射器和18號針頭吸除所得到的DNA帶。用等體積冰冷的、水飽和的正丁醇抽提4次以除去溴化3，8′-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。經透析除去氯化。然后用異丙醇沉淀DNA，並將其重新溶解于DNA緩沖液中達到終ǘ任笤 00μg/ml。
2.部分消化按下述方法用XhoⅡ切割純化的DNA以完成部分消化將0.3mlDNA(溶于10mM Tris pH7.5、10mM MgCl2、50mM NaCl、10mM巰基乙醇緩沖液，濃度為80μg/ml)分成1份100μl和4份50μl的等分部分。向100μl管內加入6.4單位XhoⅡ以達到每μgDNA含0.8單位酶。由第一管中吸出50μl並移入第二管中以達到0.4單位XhoⅡ/μg，如此進行，使每個接續(xù)的管均接受前一管中一半量的XhoⅡ。將各管于37℃保溫一小時，然后于72℃加熱處理15分鐘並自各管取10μl以瓊脂糖凝膠電泳法分析之。選擇呈現中度但不完全消化的各管作為用于克隆的部分消化片段的來源(這些管分別為0.4μ/μg，0.2u/μg和0.1u/μg。將三種溶液混合在一起並按下述方法使用之)。
3.連接按下述方法使分離的DNA片段與pJRD184連受;將4.0μgXhoⅡ部分消化的水花魚腥藻DNA(60μl)與2.0μg BamHⅠ裂解的並去磷酸化的pJRD184(2.5μl)混合。加入100μl 10X連接混合物(500mM Tris，pH7.5、100mM MgCl2、100mM DTT、5mM ATP)，加27.5μl無菌蒸餾水使終體積達到100μl。加入3.75μlT4DNA連接酶並于17℃將混合物保溫4小時，然后再加10μl氯仿除菌。按下述方法用大約80μl連接的DNA轉化大腸菌菌株RR1將DNA與1.0ml SSC/CaCl2(50mM NaCl、5mM檸檬酸鈉、67mM CaCl2)在冰上混合並加入2.0ml冷冷的感受態(tài)大腸桿菌RR1(hsd R-M-，ATCC No.31343)細胞。43℃保溫6分鐘后，用Sml Luria(L-)培養(yǎng)液稀釋細胞並于37℃保溫4小時。
4.初級細胞庫簡單地離心轉化的細胞培養(yǎng)物，棄去上清並將細胞重新懸浮于1ml L-培養(yǎng)液中。取200μl細胞懸液在含有100μg/ml氨芐青霉素的Luria-瓊脂(L-瓊脂)平皿上鋪板。37℃保溫過夜后，各用2.5ml 10mM Tris(pH7.5)、10mM MgCl2浸沒平皿並收集已轉化的菌落，us得到初級細胞庫。
5.初級質粒庫按下述方法制備初級質粒庫將2.5ml初級細胞庫接種到500ml含100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)液中。于37℃下將培養(yǎng)物振蕩培養(yǎng)過夜后以4，000rpm離心5分鐘。棄去上清並將細胞沉淀物于室溫下重新懸浮于10ml25%蔗糖、50mMTris(pH8.0)中。加入5ml0.25MEDTA(pH8.0)，然后再加入3ml溶于0.25MTris(pH8.0)的溶菌酶(10mg/ml)。將溶液在冰上放置1小時，然后向其中強力吸移12ml溶解混合物(1%TritonX-100，50mMTris(pH8.0)、67mMEDTA)並輕輕旋動細胞懸浮液以使之溶解。細胞溶解后，將混合物移入50ml的塑料離心管中並以17，000rpm，于4℃離心45分鐘。用吸管除去上清液。稱取20.0g固體CsCl加入50ml塑料螺帽試管中並吸入22.0g上清液與之混合。向混合物內加入1.0ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶液(5mg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，溶于10mMTris(pH8.0)、1mMEDTA、100mMNaCl中)。將溶液移入兩個5/8英吋×3英吋的同質異晶聚合物離心管中並封閉之。然后將這些離心管置于BeckmanTi70轉子中于17℃以44，000rpm離心42小時。為了收集質粒，用一外科手術刀刺入管的頂部並于紫外光下用注射器收集在較低部收集兩條熒光DNA帶。將從兩個管中收集的較低帶并入一個有螺旋蓋的玻璃管中並用等體積水飽合的冰冷正丁醇提取四次以除去溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。
將提取過的溶液移入透析管內並對4次更換的DNA緩沖液透析24小時。然后將透析過的DNA溶液移入預稱重的50ml無菌離心管內並測量其體積。加入5MNaCl達到終體積為0.4M，然后加兩倍體積異丙醇並混合之。溶液于-20℃放置過夜以沉淀DNA。沉淀后，以15，000rpm于0℃下離心15分鐘並棄去上清。將離心管在實驗臺上放置15分鐘風干，然后將DNA沉淀并溶解于500μlDNA緩沖液中並儲存于-20℃下。以這種方法制得的質粒DNA濃度為100-200μg/ml。
6.質粒儲備物的消化按下述方法消化初級質粒儲備物以破壞非Af1Ⅱ甲基化酶克隆在10mM Tris(pH7.5)、10mM MgCl2、10mM巰基乙醇、50mM NaCl。共制得600μl並分裝于3個管中，第一管含300μl，其兩管各含150μl。向第一管內加入Af1Ⅱ達到8單位/μg DNA，取所得溶液150μl移入第二管內達到4單位/蘥 DNA。第三管內不加Af1Ⅱ。各管于37℃下保溫2小時。將反應混合物加熱至72℃處理10分鐘使之失活。反應混合物各吸出100μl並加異丙醇沉淀DNA。離心收集沉淀的DNA並懸浮于20μl DNA緩沖液(pH9.0)中以達到每毫升約含150μg DNA。向各管內加入0.4單位細菌堿性磷酸並于石臘油封閉下于68℃保溫2小時。加入80μlDNA緩沖液，混合並除去之。向該混合物中加入8μl氯仿並經強力混合使之乳化，然后經離心分離。
7.轉化各管分別取12.5μl樣品用于轉化大腸桿菌RR7。加熱，不經中間稀釋和生長過程，直接用細胞/DNA混合物在含有100μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂培養(yǎng)皿上鋪板。37℃保溫過夜后檢查培養(yǎng)皿。用Af1Ⅱ和細菌堿性磷酸酶消化質粒庫后，發(fā)現轉化體的數目減少了約103倍。由已經受到最大消耗(8單位Af1Ⅱ/μg)平皿中收集到大約30個個別菌落。將各菌落接種到10ml含氨芐青霉素的L培養(yǎng)液中以制備微量培養(yǎng)物，另外還在含有氨芐青霉素的L瓊脂平皿上進行劃線接種以制備種子培養(yǎng)物。
8.存活菌落的分析使7中制得的約30個存活菌落增值為10ml培養(yǎng)物(見第7節(jié))並按下述Birnboin和Doly(NucleicAcidsRes.71513，1979)的小量制備純化方法(minipreppurificationprocedure)制備它們所攜帶質粒。
小量制備方法將各培養(yǎng)物于8，000rpm離心5分鐘棄去上清並將細胞沉淀餅重新懸浮于1ml含1mg/ml溶菌酶的25mMTris、10mMEDTA、50mM葡萄糖(pH8.0)中。室溫放置10分鐘后向各管內加入2.0ml0.2MNaOH、1%SDS並搖動試管以使細胞溶解，然后放在冰上。待溶液澄清后向各管內加入1.5ml3M醋酸鈉(pH4.8)並搖動試管。于4℃下以15，000rpm離心10分鐘分離所形成的沉淀物。將各管上清液倒入含3ml異丙醇的離心管內並進行混合。室溫放置10分鐘后，以15，000rpm離心10分鐘使沉淀的核酸形成沉淀餅。棄去上清並于室溫下放置30分鐘使沉淀餅風干。干燥后將沉淀餅重新懸浮于850μl10mMTris、1mMEDTA(pH8.0)中。向各管內加入75μl5MNaCl並將溶液移入含575μl異丙醇的Eppendorf管內，于室溫下繼續(xù)沉淀10分鐘。然后在微量離心機中將各管離心45秒，棄去上清並使沉淀餅風干。將沉淀餅溶解在500μl含100μg/mlRNAase10mMTris、1mMEDTA(pH8.0)中並于37℃保溫1小時以消化RNA。加入50μl5MNaCl，然后加350μl異丙醇，反復沉淀DNA。室溫處理10分鐘后，離心45秒鐘以沉淀DNA，棄去上清並將沉淀餅重新溶解在15μl含10mMTris、1mMEDTA(pH8.0)的終溶液中。然后用Af1Ⅱ消化以分析質粒微量制備物。
9.甲基化酶基因克隆對大部分質粒的分析結果可見其對Af1Ⅱ的消化作用敏感，並且攜帶太湖念珠藻DNA的隨機的XhoⅡ片段。這些質粒不是真正存活的，沒有更多使用價值，故棄去。發(fā)現其中有一個質粒對Af1Ⅱ有抗性，並且至少攜帶兩個長度約10.1Kb和2.1Kb的XhoⅡ片段(見圖2)。繼而顯示該質粒不僅攜帶Af1Ⅱ修飾性甲基化酶基因，而且還攜帶限制性核酸內切酶基因。
10.限制酶基因克隆如上(第9節(jié))鑒定的克隆不僅攜帶Af1Ⅱ修飾性甲基化酶基因，還發(fā)現其攜帶Af1Ⅱ限制性核酸內切酶基因。這一點是經下述體外限制性核酸內切酶分析法而確證的。
核酸內切酶分析法為了檢測核酸內切酶活性，預制備以下兩種溶液(ⅰ)10X限制性核酸內切酶緩沖液100mM Tris(pH7.5)、100mM MgCl2、100mM2-巰基乙醇、500mM NaCl;和(ⅱ)消化反應混合物45μl λ-HindⅢ消化的DNA(630μg/ml)、56μl 10X限制性核酸內切酶緩沖液、加459μL蒸餾水達到50μg/ml DNA。
按下述方法制備細胞提取物使100ml待檢測克隆的培養(yǎng)物于37℃在含有100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)液中生長過夜，並以4，000rpm離心5分鐘沉淀細胞。棄去上清並將沉淀餅重新懸浮于3ml聲波處理緩沖液 5mM KPO4pH7.5、10mM BME、0.1mM EDTA)。懸浮后再加入0.3ml含10mg/ml溶菌酶的超聲處理緩沖液。旋動懸浮液並在冰上放置1小時。取1ml樣品移入一Eppendorf管中並給予三次各10秒鐘超聲處理以破碎細胞。試管在微量離心機中離心5分鐘並將上清用作細胞提取物。為分析該提取物，將消化反應混合物分加到5個試管內，第一管加入150μl，其余四管各加102.5μl。向第一管中加入7.5μl提取物並混合之。由第一管中取47.5μl移入第二管，混合並依此進行。這樣第一管便接受了每μg DNA 1 μl提取物，第二管為0.3μl/μg，第三管為0.1μl/μg並依此類推。將現含有100μl的各管在37℃下保溫1小時，然后各取20μl用凝膠電泳法分析之。結果發(fā)現提取物的滴度約為每毫升2×104單位，其相當于每克細胞糊(濕重)約1×105單位Af1Ⅱ限制性核酸內切酶(見圖3)。
11.用攜帶編碼Af1Ⅱ限制性核酸內切酶及甲基化酶基因的重組質粒pKL Af1ⅡRM520-4轉化大腸桿菌菌株MM294(hsd R-M+，ATCC No.33625)，以提供轉化體大腸桿菌MM294(pKLAf1Ⅱ-RM520-4)。
實施例2由大腸桿菌MM294(pKLAf1Ⅱ-520-4)產生Af1Ⅱ。
1.在含L培養(yǎng)基的發(fā)酵器中于37℃下增殖大腸桿菌MM294(pKLAf1Ⅱ-RM520-4)，其中每升L培養(yǎng)基內含有10g酪蛋白水解產物;5g酵母浸膏;10gNaCl;1g六水合氯化鎂;1g葡萄糖;100mg氨芐青霉素，用NaOH將其pH調到7.2。離心收集細胞並將細胞糊儲存于-70℃下。以下各步驟均在4℃下完成。
2.融化24g冷凍的細胞糊，並將細胞重新懸浮于100ml超聲處理緩沖液(10mMKPO4、10mML-巰基乙醇，0.1mM EDTA)中。
3.經超聲處理破碎細胞，以使每ml懸浮的細胞釋放出大約50mg可溶性蛋白質。
4.以10，000rpm離心45分鐘以除去不溶性細胞碎片。
5.將上清調到含0.15MNaCl並過磷酸纖維素柱(3Cm×18Cm)。用兩倍柱床體積含0.15MNaCl的超聲處理緩沖液洗柱。柱內提供0.15M至1.0M(總體積200ml)的NaCl線性梯度並按每管2ml收集洗脫物。然后分析各管內容物的Af1Ⅱ限制性核酸內切酶活性。合并活性部分並用超聲處理緩沖液稀釋，以降低電導率達到溶液含0.15MNacl。
6.將活性儲集部分上肝素-Sepnarose柱(2Cm×12Cm)並用2倍柱床體積含0.15MNaCl的超聲處理緩沖液洗柱。向柱頂提供0.15M至1.0M的NaCl線性梯度(總體積150ml)並再次按2ml一管收集洗脫液。然后分析各管內容物中的Af1Ⅱ限制性核酸內切酶活性。合并各活性部分並對100倍體積的H緩沖液(50mMKCl、20mMTris-HCl(pH8.0)、10mM2-巰基乙醇)透析。
7.將透析物上1mlMOO-QFPLC柱(Pharmacia)並用H緩沖液洗柱。向柱頂提供40ml溶于H緩沖液的5mM至0.6M的KCl線性梯度並按每管1ml收集各洗脫部分。然后分析各管的Af1Ⅱ限制性核酸內切酶活性。合并兩管有最大活性的部分並加入2ml甘油和800μg牛血清白殼白。將此純化的制劑保存于-20℃。
權利要求
1.包括AflⅡ限制性核酸內切酶基因的克隆載體。
2.含權利要求1之克隆載體的轉化的宿主。
3.根據權利要求1的克隆載體，其中Af1Ⅱ基因是由水花魚腥藻(Anabaena flos-aquae)中切割得到的。
4.包括Af1Ⅱ修飾基因的克隆載體。
5.含權利要求4之克隆載體的轉化的宿主。
6.克隆Af1Ⅱ限制性核酸內切酶基因的方法，其包括(a)由水花魚腥藻中的DNA制得基因庫;(b)分離含Af1Ⅱ修飾基因的克隆;以及(c)篩選含修飾基因的克隆，並分離含Af1Ⅱ限制性核酸內切酶基因的克隆。
7.根據權利要求6的方法，其中基因庫是依照以下步驟制得的(a)純化水花魚腥藻的DNA;(b)將純化的DNA部分消化成DNA片段;(c)將片段連接到克隆載體上;(d)用步驟(c)的克隆載體轉化宿主細胞以形成細胞庫;以及(e)由細胞庫中純化重組載體以形成質粒庫。
8.根據權利要求7的方法，其中克隆載體是pJRD184。
9.根據權利要求7的方法，其中宿主細胞是呈hsd R-的大腸桿菌菌株。
10.根據權利要求7的方法，其中含Af1Ⅱ修飾基因的克隆是經用Af1Ⅱ消化質粒庫以形成消化產物儲集物、將該消化儲集物轉化到宿主細胞內，然后分離含修飾基因的克隆而得到的。
11.生產Af1Ⅱ限制性核酸內切酶的方法，其包括(a)純化水花魚腥藻的DNA;(b)用適當的限制性核酸內切酶部分消化已純化的DNA，得到DNA片段;(c)將片段連接到克隆載體上以形成DNA混合物;(d)用步驟(c)的DNA混合物轉化宿主細胞以形成細胞庫;(e)分離含Af1Ⅱ修飾性甲基化酶基因的克隆;(f)篩選含Af1Ⅱ修飾性甲基化酶基因的克隆，並分離含Af1Ⅱ限制性核酸內切酶的克隆;(g)培養(yǎng)含步驟(f)之克隆的宿主細胞;以及(h)由培養(yǎng)物中回收AflⅡ限制性核酸內切酶。
12.根據權利要求11的方法，其中克隆載體是一質?；虿《綝NA分子。
13.根據權利要求12的方法，其中質粒是pJRD184。
全文摘要
本發(fā)明涉及克隆和生產Af1 II限制性核酸內切酶的方法，其包括1)向宿主內引入由水花魚腥藻(Anabaena flos-aquae)得到的限制性核酸內切酶基因以便該限制基因得以表達；2)培養(yǎng)含編碼并表達Af1 II限制性核酸內切酶活性之質粒的宿主；以及3)由發(fā)酵培養(yǎng)的、含編碼和表達Af1 II限制性核酸內切酶活性之質粒的宿主中純化得到Af1 II限制性核酸內切酶。
文檔編號C12N1/20GK1034391SQ88107078
公開日1989年8月2日 申請日期1988年10月14日 優(yōu)先權日1987年10月15日
發(fā)明者基思, 洛恩 申請人:新英格蘭貝艾拉伯斯公司