專利名稱：被囊細(xì)菌的制作方法
蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(Bacillusthuringiensisisraelensis，BTI)在形成孢子的期間產(chǎn)生一種胞內(nèi)的稱為伴孢晶體的殺蟲毒素。此毒素由昆蟲(如蚊子)吸收后，被昆蟲腸道內(nèi)的堿性物質(zhì)分解，它就在昆蟲的腸道內(nèi)導(dǎo)致腸道解體并殺死昆蟲。該昆蟲毒素的一般生產(chǎn)方法如下使BTI發(fā)酵形成大量細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞形成孢子，使產(chǎn)生毒素和形成孢子，然后溶解母體細(xì)胞，將孢子和伴孢晶體釋放至培養(yǎng)基中。然后收集晶體和與其相連的孢子，配制殺蟲劑并進(jìn)行包裝。將此殺蟲劑分散于所需位點(diǎn)之上。關(guān)于這些可參見例如Aizawa的“昆蟲害的微生物控制”(《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)進(jìn)展》第15章397頁，Subba編，OxfordIBH，1982)，Lacey等人的摘要(J.Am.Mosq.Control.Ass，1493-497，1985);Novak等人的摘要(J.Am.ControlAss.1449～453，1985)。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是一種含有殺蟲毒素的細(xì)菌，所述細(xì)菌包有一層由非生命的、樹脂的、保護(hù)物質(zhì)構(gòu)成的被囊，該被囊在高堿性PH(例如PH高于9)條件下可滲透目標(biāo)昆蟲的消化酶。被囊化是指由聚合物完全包裹，從而在環(huán)境中遇到的PH水平下(例如PH低于8.5)免受環(huán)境因素的影響，這些因素包括熱、濕度和溶液，例如，由雨水形成的碳酸溶液。“保護(hù)”是指該物質(zhì)在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中遇到的環(huán)境條件下，能顯著地阻止被囊細(xì)菌的降解。
在優(yōu)選的具體方案中，該毒素是伴孢晶體毒素，細(xì)菌是蘇云金芽孢桿菌;聚合物在農(nóng)業(yè)環(huán)境中是穩(wěn)定的，例如，在土壤中或植物葉片上;具體地說，聚合物具有熱穩(wěn)定性(至少在高達(dá)大約120°F)，并且不會被水(PH低于8.5)、紫外輻射及農(nóng)業(yè)環(huán)境中的其他條件迅速降解。另外，聚合物還保護(hù)孢子囊免受其他的環(huán)境降解，例如，微生物降解或酶降解。聚合物無須在昆蟲腸道中迅速降解，只要它能容易透過溶解孢子囊的昆蟲腸道液(例如PH高于10)就行。聚合物應(yīng)在此條件下能透過毒素，從而將它釋放至昆蟲腸道中。毒素是通過將細(xì)菌培養(yǎng)到孢子形成的第Ⅲ期而生產(chǎn)的。聚合物可以是非離子型的、多陰離子型的或多陽離子型的。一種合適的非離子型聚合物是葡聚糖，淀粉或明膠;一種合適的多陰離子型聚合物是海藻酸鹽或角叉膠，一種合適的多陽離子型聚合物是脫乙酰殼多糖或聚氧乙烯二胺。其它優(yōu)選的聚合物的特征是(a)聚合物是交聯(lián)的，最好是與甲醛、戊二醛、二甲基己二酰亞胺2HCl(DMA，參見Waterman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.63580-587，1975)、二甲基辛二酰亞胺2HCl(DMS，參見Packman等，Biochemistry，215171～5175，1982)、二〔2-(琥珀酰亞胺氧羰基氧)乙基〕砜(BSOCOES，參見Zarling等，J.Immunol.124913～920，1980)、二琥珀酰亞胺酒石酸酯(DST，參見Bragg等，Eur.J.Biochem.106495～503，1980)、硫-BSOCOES(Zarling等)、硫-DST(Bragg等)、多磷酸鹽離子或金屬離子(例如Ca2+)的交聯(lián)物;以及(b)聚合物中還含有一種添加劑，例如，防曬生色團(tuán)、調(diào)味劑或引誘劑如外激素。
在第二方面，本發(fā)明涉及一種含有上述細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞團(tuán)。團(tuán)聚體的直徑優(yōu)選為10～100微米，最好為20～50微米。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)被囊殺蟲劑的方法。該方法包括培養(yǎng)含有昆蟲毒素編碼基因的細(xì)菌，以形成殺蟲劑，然后將細(xì)菌包囊在聚合物中。
在優(yōu)選的具體方案中，細(xì)菌是能夠產(chǎn)生孢子的，細(xì)菌培養(yǎng)至形成孢子的第Ⅲ期，被囊化包括包裹細(xì)菌的外膜。
本發(fā)明利用微生物細(xì)胞壁這一特征，以吸引細(xì)胞聚合物，并因此被包囊。通過化學(xué)交聯(lián)這些被囊制劑的穩(wěn)定化產(chǎn)生一種適用于控制昆蟲的高度穩(wěn)定的產(chǎn)物，對于公共衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)都很重要。在優(yōu)選的方面，毒素是胃毒素，微被囊化提高了目標(biāo)昆蟲的吞食，并使毒素釋放和通過目標(biāo)昆蟲腸道堿性基質(zhì)中的消化酶活化。在一個(gè)特別優(yōu)選的具體方案中，使用例如蘇云金芽孢桿菌，該方法使細(xì)胞維持為完整的孢子囊。
被囊化的毒素在大田條件下高度穩(wěn)定，因此不必象以前的殺蟲劑那樣頻繁使用，從而降低使用費(fèi)用。此外，生產(chǎn)這些殺蟲劑的方法也相對便宜一些。由于優(yōu)選的是使毒素保留在細(xì)菌內(nèi)，因此可縮短發(fā)酵時(shí)間。例如，形成孢子的細(xì)菌只需培養(yǎng)至生產(chǎn)完成時(shí)，也就是形成孢子的第Ⅲ期。細(xì)菌可在此時(shí)用被囊聚合物直接包裹并出售、運(yùn)輸并以此狀態(tài)施用于農(nóng)產(chǎn)品。在天然和模擬的大田條件下，被囊毒素比非被囊毒素的半衰期長得多。此外，由于細(xì)胞能夠通過聚合物的交聯(lián)而團(tuán)聚，因此可選擇最佳的團(tuán)聚物直徑，使它最適于目標(biāo)昆蟲的飼喂要求。例如，對于蚊子來說(其中有些是濾食性動物)，當(dāng)顆粒直徑為25～100微米時(shí)毒性增強(qiáng)，而對于較小的幼蟲，10～20微米的大小更好。
本發(fā)明的另一個(gè)特征是提供了在聚合物中摻入防曬生色團(tuán)、食物添加劑、染料和外激素的機(jī)會和可能性。生色團(tuán)保護(hù)被囊毒素不受紫外輻射，因此提高其穩(wěn)定性。食品添加劑和外激素提高昆蟲吞食毒素的機(jī)會。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，從下述優(yōu)選的具體方案和權(quán)利要求中是顯而易見的。
毒素適于本發(fā)明的毒素包括殺蟲毒素。合適的毒素包括常用的那些，在某些情況下它們在通常的農(nóng)業(yè)應(yīng)用環(huán)境中是不穩(wěn)定的。這些毒素包括BTI或蘇云金芽孢桿菌昆蟲亞種(B.thuringlensisentomotsides)的伴孢晶體毒素及其有關(guān)的毒素。參見上述引用的Aizawa，第400頁。毒素可通過常規(guī)使用的方法或修改過的方法生產(chǎn)，這些方法如下所述。毒素也可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Mclean和Whitely，J.Bacteriol、169(3)1017～1023(1987);Ward等，J.Mol.Biol、19113～22(1986))在其它細(xì)菌(如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌)中通過表達(dá)編碼毒素的基因而進(jìn)行生產(chǎn)。在被囊化的過程中，毒素最好保留在這些細(xì)菌內(nèi)。
被囊聚合物適于包囊上述毒素的聚合物包括許多非離子型、多陰離子型和多陽離子型聚合物。這種聚合物的實(shí)例有葡聚糖如淀粉，蛋白質(zhì)如明膠，海藻酸鹽或角叉膠和脫乙酰殼多糖和聚氧乙烯二胺。這些聚合物通常都是生物聚合物，具有廣泛的可生物降解性，但它們最好是對多種通常的農(nóng)業(yè)型條件具有足夠的抗性，以保護(hù)毒素一個(gè)時(shí)間，使其被吞食，并顯著縮短應(yīng)用之間的時(shí)間。聚合物保護(hù)孢子囊不受到細(xì)菌或酶降解。聚合物是高度多孔的，并接近堿性條件和消化酶，例如在昆蟲的腸道中。
實(shí)施例在此實(shí)例中，應(yīng)用從多種包囊聚合物之一種來包裹含有BTI伴孢晶體毒素的孢子囊。
本實(shí)施例并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員將認(rèn)識到，上述毒素和包囊聚合物可在本實(shí)例中進(jìn)行取代。
BTI細(xì)胞在浸沒培養(yǎng)中于32℃培養(yǎng)大約12～18小時(shí)，培養(yǎng)利用隔板式震蕩玻瓶于100rpm下進(jìn)行。另外，使細(xì)胞在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，每體積培養(yǎng)基具有0.8體積的空氣，直至達(dá)到孢子形成的第Ⅲ期。此期通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定，例如通過顯微觀察或監(jiān)測細(xì)菌的代謝熱輸出。在發(fā)酵的這一階段，溫度由32℃降至22℃，或通過加入硫酸使PH由7降到6。這些環(huán)境變化有助于延遲細(xì)菌溶解達(dá)24小時(shí)以上。此延遲使得細(xì)菌被囊化得以進(jìn)行，而不至使毒素晶體從形成孢子的母體細(xì)胞或孢子囊中釋放出來。
利用下述三種聚合物中的一種包裹孢子囊。(在此步驟之前可使細(xì)胞濃縮，即簡單地使它們沉淀，并傾出沉淀物上的大約80%的液體。另外，細(xì)胞可保留在懸浮液中。)a)在培養(yǎng)基中加入一種非離子型聚合物，如可溶性淀粉，然后加入50%體積的一種有機(jī)溶劑，例如乙醇或丙酮。這些溶劑起凝聚劑作用，使被囊細(xì)胞由培養(yǎng)基中沉淀出來。一般來說，淀粉加入量大約等于培養(yǎng)基中的細(xì)胞量，其濃度約為0.5～5%重量。通過迅速的溫度改變也能使聚合物從溶劑中沉淀出來。
b)在培養(yǎng)基中加入一種多陽離子型聚合物，如脫乙酰殼多糖(大約0.4～4%重量)。脫乙酰殼多糖已予先用乙酸(0.2～0.5M)酸化至PH小于大約5。載負(fù)電荷的孢子囊壁吸引可溶性聚合物。然后用多磷酸離子(0.1～0.2M)使聚合物穩(wěn)定化。
c)在培養(yǎng)基中加入一種陰離子型聚合物，如海藻酸鹽(約0.4～4%重量)。這些聚合物被吸引在細(xì)胞上。然后加入鈣鹽(0.1～0.2M)使聚合物交聯(lián)，從而產(chǎn)生具有多層聚合物的細(xì)胞。
在這一階段，加入色彩引誘劑，如染料或紫外光屏蔽化合物，如對氨基苯甲酸。
包裹步驟只需要幾分鐘，但混合物可放置1～2小時(shí)。此刻，包裹的孢子囊與添加劑一起進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，以使最終產(chǎn)品穩(wěn)定。合適的交聯(lián)物質(zhì)(約0.1～0.01%重量)有醛類，如甲醛或戊二醛、雙功能氨基酯，如DMA或DMS，雙功能N-羥基琥珀酰亞胺酯，如BSOCOES或DST、及其他列于PierceHandbookandCatalog(1986～7，PP311～340)中的物質(zhì)。最合適的這種交聯(lián)劑是具有堿回復(fù)性的那種，它因此在目標(biāo)昆蟲的腸道中被切斷。參見Zarling(見上)。這些交聯(lián)物質(zhì)因此提高了腸道中的毒素釋放，以及毒素的最終活化。
最終產(chǎn)品是由交聯(lián)聚合物包囊的孢子囊，能使之噴霧干燥或作為乳化劑出售，并直接施用于目標(biāo)植物。噴霧干燥是用霧化器通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，將混合物噴霧于鈣或多磷酸鹽溶液中(根據(jù)需要)。另外，混合物可通過加入苯甲酸或山梨酸進(jìn)行保存，它們通常以0.1%的濃度用作食品防腐劑。這種溶液或干燥產(chǎn)品可在數(shù)月甚至數(shù)年內(nèi)保持穩(wěn)定。它們通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被施用于植物或大田，但殺蟲劑的用量少于現(xiàn)有的制劑，因?yàn)槠浔匾膽?yīng)用次數(shù)較少。
其他的具體方案也落入下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種被囊細(xì)菌，所說細(xì)菌包括一種殺蟲毒素，其中所述細(xì)菌由一種非生命的、樹脂狀的、保護(hù)性聚合物所包裹，該聚合物在高堿性PH下能透過昆蟲的消化酶。
2.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中的毒素是伴孢晶體毒素。
3.權(quán)利要求2的細(xì)菌，其中的細(xì)菌是蘇云金芽孢桿菌的孢子囊。
4.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中的聚合物在農(nóng)業(yè)環(huán)境中具有穩(wěn)定性。
5.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中的聚合物能透過昆蟲腸道的消化液。
6.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中的聚合物基本上不能透過能夠降解所述細(xì)菌的生物劑。
7.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中的細(xì)菌是通過收集孢子形成第Ⅲ期的集落而生產(chǎn)的。
8.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中的聚合物是非離子型，多陰離子型或多陽離子型的。
9.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中的聚合物是選自以下物質(zhì)葡聚糖、淀粉、明膠、海藻酸鹽、角叉膠、脫乙酰殼多糖和聚氧乙烯二胺。
10.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中的聚合物是交聯(lián)的。
11.權(quán)利要求8的細(xì)菌，其中的聚合物是與甲醛、戊二醛、DMA、DMS、BSOCOES、DST、多磷酸鹽離子或金屬交聯(lián)的。
12.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中的聚合物包括選自以下的添加劑防曬生色團(tuán)、吞噬促進(jìn)劑和昆蟲引誘劑。
13.一種含有權(quán)利要求1的細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞團(tuán)聚體。
14.權(quán)利要求13的團(tuán)聚體，其直徑為10～100微米。
15.權(quán)利要求13的團(tuán)聚體，其直徑為20～50微米。
16.一種生產(chǎn)殺蟲劑的方法，包括的步驟如下培養(yǎng)具有昆蟲毒素編碼基因的細(xì)菌，以產(chǎn)生所述毒素，并用一種聚合物包裹所述細(xì)菌。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的細(xì)菌是能夠形成孢子的，所述的培養(yǎng)步驟包括使所述細(xì)菌進(jìn)入孢子形成第Ⅲ期。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述包裹包括用所述聚合物包裹所述細(xì)菌的外膜。
19.權(quán)利要求16的方法，其中用來包裹細(xì)菌的聚合物能透過昆蟲腸道消化液，并基本上不透過能降解所述細(xì)菌的生物劑。
全文摘要
一種被囊細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種殺蟲毒素，所述細(xì)菌被包囊在聚合物中。
文檔編號C12N11/08GK1036226SQ89101839
公開日1989年10月11日 申請日期1989年2月11日 優(yōu)先權(quán)日1988年2月12日
發(fā)明者埃利沙·佐馬, 安德魯·斯皮爾曼, 約瑟夫·B·佩龍 申請人:哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會