專利名稱：慶大霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法
專利說(shuō)明 本發(fā)明是關(guān)于抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，特別是慶大霉素地發(fā)酵生產(chǎn)。
慶大霉素是由絳紅小單孢菌(MICromons Pora PUrPUrea)發(fā)酵代謝而產(chǎn)生的一族氨基糖甙抗生素。它主要由慶大霉素C1和C2C1a三種成份組成。美國(guó)專利US-3，091，572首次公開(kāi)了實(shí)驗(yàn)室小量制取慶大霉素的方法“以牛肉膏0.3%、色氨酸鹽0.5%、右旋糖0.1%、可溶性淀粉2.4%、酵母膏0.5%為種子培養(yǎng)基，在37℃、280rPm，培養(yǎng)5天，進(jìn)而以酵母膏1%、右旋糖1%和碳酸鈣0.1%為發(fā)酵培養(yǎng)基，在26℃、培養(yǎng)5天，最后進(jìn)行化學(xué)提純”。此后，經(jīng)多年的生產(chǎn)實(shí)踐逐步形成現(xiàn)有的慶大霉素發(fā)酵與化學(xué)提純的工業(yè)生產(chǎn)工藝，其中發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程為 砂土孢子→母瓶孢子 (37℃)/(9～10天) 子瓶孢子 (37℃)/(9～10天) 種子(罐)培養(yǎng) (35℃)/(36小時(shí)左右) 繁殖(罐)培養(yǎng) (34℃)/(25～30小時(shí)) 發(fā)酵(罐)培養(yǎng) (32～34℃)/(132小時(shí)左右) 放罐→化學(xué)提純。
慶大霉素是一種副作用小，殺菌力強(qiáng)的廣譜抗生素，然而現(xiàn)有發(fā)酵生產(chǎn)所能合成的慶大產(chǎn)量低，我國(guó)的發(fā)酵單位一般在1000r/ML左右，無(wú)法滿足需求。分析其原因是由于現(xiàn)有發(fā)酵生產(chǎn)工藝落后，存在不利于菌種正常生長(zhǎng)的因素，主要體現(xiàn)在種子培養(yǎng)、繁殖培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)等工序中，表現(xiàn)于如下二個(gè)方面 一、種子、繁殖、發(fā)酵培養(yǎng)三道工序的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成不合理 1、由于現(xiàn)有的種子、繁殖和發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有魚粉、酵母粉，這兩種成份內(nèi)含有不利(甚至可抑制)菌種正常生長(zhǎng)的某些氨基酸，以至菌種在培養(yǎng)中易老化，生長(zhǎng)能力衰退。
2、在發(fā)酵培養(yǎng)中，蛋白胨和黃豆餅粉對(duì)菌種的發(fā)酵代謝起著積極的作用，它們可使慶大霉素合成量增加，同時(shí)可促進(jìn)微生物的И-CH3化，使有效組分增加，但是現(xiàn)有的發(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中這兩種成份含量卻偏少。
二、種子、繁殖、發(fā)酵培養(yǎng)三道工序中的工藝不合理 由于現(xiàn)有的工藝采取“單種法”，即將一個(gè)種子罐內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后的種子培養(yǎng)液全部移入一個(gè)繁殖罐內(nèi)培養(yǎng)后，再全部移種入一個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)至放罐。這種采用一罐移入一罐的工藝流程很容易引起菌種老化，最終將導(dǎo)致如下后果 1、現(xiàn)有的繁殖培養(yǎng)是將種子罐內(nèi)經(jīng)種子培養(yǎng)后的種子培養(yǎng)液全部移入裝有繁殖培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的繁殖罐內(nèi)，進(jìn)行25～30小時(shí)的繁殖培養(yǎng)。經(jīng)12～14小時(shí)的繁殖培養(yǎng)后，培養(yǎng)液內(nèi)菌種的濃度相應(yīng)增加，通入的空氣又不斷將水份帶走，培養(yǎng)液不斷濃縮，營(yíng)養(yǎng)成份不斷減少，溶解氧的速率不斷下降，菌種生長(zhǎng)環(huán)境不斷惡化，使菌種正常、持續(xù)的繁殖和生長(zhǎng)受影響。
2、現(xiàn)有發(fā)酵培養(yǎng)工藝中，長(zhǎng)達(dá)132小時(shí)左右的發(fā)酵培養(yǎng)始終處于一個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行，這樣就出現(xiàn)以下三種不利情況 (1)、當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至一定的時(shí)候(一般為發(fā)酵至75～95小時(shí))，培養(yǎng)液中慶大霉素的合成量增加至一定量時(shí)即產(chǎn)生“反饋抑制”，使菌種合成慶大霉素受抑制。
(2)、慶大霉素合成中大量的消耗養(yǎng)份，通入的空氣帶走水份，在發(fā)酵培養(yǎng)的后期，培養(yǎng)液的濃度、粘度相應(yīng)增加，物理狀況產(chǎn)生變化，溶解氧的速率不斷下降，至使合成抗生素的酶的活力降低。
(3)、慶大霉素合成的高峰期一般處于發(fā)酵培養(yǎng)至36～76小時(shí)之間，此后，由于菌齡過(guò)大，菌絲衰退化，產(chǎn)抗生素(即慶大霉素)的能力降低。
以上(1)～(3)的情況造成在發(fā)酵培養(yǎng)的中、后期，慶大霉素的合成量低，特別是在發(fā)酵培養(yǎng)至72小時(shí)之后到132小時(shí)放罐的這段約60小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，慶大霉素的合成基本處于停滯。
3、現(xiàn)有工藝中所采用的“單種法”渲蟹⒔團(tuán)嘌慕又至慷嗌儆梢桓齜敝徹弈諗嘌憾嗌倮淳齠?，接种量少，菌种的发芽聦?shí)停ㄒ話憬鑫 5～25%)，直接影響菌種的數(shù)量，以至產(chǎn)抗生素的量也低。
為此，本發(fā)明的任務(wù)在于對(duì)現(xiàn)有慶大霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)，以除去影響菌種生長(zhǎng)的不利因素，提高慶大霉素發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)量(即慶大霉素合成量)。并通過(guò)其一，設(shè)計(jì)種子、繁殖、發(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及中間補(bǔ)料培養(yǎng)基;其二，改進(jìn)并設(shè)計(jì)種子、繁殖、發(fā)酵培養(yǎng)的工藝，實(shí)現(xiàn)完成本發(fā)明的任務(wù)。
在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出如下的技術(shù)解決方案 一、本發(fā)明所設(shè)計(jì)的各種培養(yǎng)基配方 根據(jù)蛋白胨、黃豆餅粉、酵母粉、魚粉及其它組成在菌種所生長(zhǎng)培養(yǎng)中所起的作用，以及各工藝的需要，采取如下措施在各種培養(yǎng)基中不使用魚粉與酵母粉類成份，適當(dāng)?shù)脑黾影l(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)第一、二次中間補(bǔ)料培養(yǎng)基中蛋白胨、黃豆餅粉的用量，適當(dāng)?shù)脑黾臃敝撑囵B(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中玉米淀粉的用量，并為新設(shè)的繁殖培養(yǎng)中間補(bǔ)料工藝設(shè)計(jì)相應(yīng)的繁殖培養(yǎng)中間補(bǔ)料培養(yǎng)基。所以，在本發(fā)明所設(shè)計(jì)的種子、繁殖、發(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和繁殖培養(yǎng)中間補(bǔ)料培養(yǎng)基，以及發(fā)酵培養(yǎng)的第一、二次中間補(bǔ)料培養(yǎng)基均不含酵母粉類和魚粉成份，這些培養(yǎng)基的組成分別為 1、種子培養(yǎng)(罐)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基〔基礎(chǔ)配方Ⅰ〕 玉米淀粉1.0～1.5%、玉米粉1.5～2.0%、 蛋白胨0.2～0.4%、黃豆餅粉1.0～1.5%、 碳酸鈣0.6～0.8%、硝酸鉀0.05%、 氯化鈷1～2r/ML、葡萄糖0.1～0.2% 2、繁殖培養(yǎng)(罐)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基〔基礎(chǔ)配方Ⅱ〕 玉米淀粉1.5%、玉米粉1.5%、 蛋白胨0.2～0.4%、黃豆餅粉2.0%、 碳酸鈣0.5～0.8%、氯化鈷8～10r/ML、 葡萄糖0.3～0.5%、 3、發(fā)酵培養(yǎng)(罐)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基〔基礎(chǔ)配方Ⅲ〕 玉米淀粉5.5～6.5%、玉米粉1.0～1.5%、 蛋白胨0.2～0.5%、黃豆餅粉2.0～5.0%、 碳酸鈣0.50～0.80%、氯化鈷8～12r/ML、 硝酸鉀0.01～0.02%、硫酸銨0.1～0.2%、 4、繁殖培養(yǎng)(罐)的中間補(bǔ)料培養(yǎng)基〔補(bǔ)料配方Ⅰ〕 玉米淀粉2.0～2.5%、玉米粉1.0～1.5%、 蛋白胨0.3～0.4%、黃豆餅粉2.0～3.0%、 碳酸鈣0.60～0.65%、硝酸鉀0.01%、 氯化鈷8～10r/ML、硫酸銨0.10～0.15%、 葡萄糖0.2～0.3%、 二、本發(fā)明所設(shè)計(jì)的發(fā)酵生產(chǎn)工藝 發(fā)酵生產(chǎn)工藝由前期工藝和后期工藝組成。
1、前期工藝采用以麩皮1.6%、可溶性淀粉0.75%、硫酸鎂0.05%、硝酸鉀0.1%、磷酸二氫鉀0.03%、天門冬素0.002%、氯化鈉0.05%、碳酸鈣0.1%、瓊脂1.6～2.5%為培養(yǎng)基進(jìn)行砂土孢子、母瓶孢子和子瓶孢子的培養(yǎng)，隨后為后期提供合格的孢子液的現(xiàn)有技術(shù)。
2、后期工藝是采取如下措施。
其一，設(shè)置一套具有二個(gè)或二個(gè)以上的種子罐、二個(gè)或二個(gè)以上的繁殖罐、一個(gè)或一個(gè)以上的發(fā)酵罐和一個(gè)或一個(gè)以上的中轉(zhuǎn)罐的設(shè)備。這些罐均為采用發(fā)凸ひ瞪諧Ｓ玫拇薪漣?、通气装置的发酵用罐? 其二，采取“雙種法”，即將二個(gè)繁殖罐內(nèi)的繁殖培養(yǎng)液接種入同一個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)，以加大發(fā)酵培養(yǎng)的接種量，使一個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)菌種的發(fā)芽率提高(約為30～50%)的方法。
其三，在繁殖培養(yǎng)工序中，于繁殖培養(yǎng)至12～14小時(shí)，采取中間補(bǔ)料工藝，以改善菌種的生長(zhǎng)環(huán)境。
其四，為使菌種能夠向著正常代謝合成抗生素的方向順利發(fā)展，在發(fā)酵培養(yǎng)工序中采取 (1)、在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)行四次中間補(bǔ)料工藝，第一次與第二次為補(bǔ)加培養(yǎng)基料，第三次與第四次為補(bǔ)加無(wú)菌水。
(2)、對(duì)處于發(fā)酵中期的發(fā)酵液(罐)進(jìn)行發(fā)酵中期強(qiáng)化處理對(duì)所設(shè)置的中轉(zhuǎn)罐進(jìn)行備料消毒后備用，在繁殖罐移種時(shí)，將少量的繁殖培養(yǎng)液移入備用的中轉(zhuǎn)罐內(nèi)進(jìn)行38～54小時(shí)的培養(yǎng)，隨后適用將中轉(zhuǎn)罐內(nèi)的培養(yǎng)液全部移入盛有正處于發(fā)酵中期發(fā)酵液的中期發(fā)酵罐內(nèi)(該罐已預(yù)先進(jìn)行過(guò)發(fā)酵后期強(qiáng)化的倒種處理)，實(shí)現(xiàn)向該中期發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)入菌齡相對(duì)小而生命力強(qiáng)的菌種。
(3)、對(duì)處于發(fā)酵后期的發(fā)酵液(罐)進(jìn)行發(fā)酵后期強(qiáng)化處理從正處于發(fā)酵中期的中期發(fā)酵罐內(nèi)取出少量的發(fā)酵培養(yǎng)液倒入相對(duì)于該中期發(fā)酵罐而言的后期發(fā)酵罐內(nèi)，實(shí)現(xiàn)將正處于發(fā)酵中期的、菌齡相對(duì)小而生命力強(qiáng)的菌種補(bǔ)入以上正處于發(fā)酵后期的、菌齡大、生命力弱的菌種中去的發(fā)酵后期強(qiáng)化處理工藝 后期工藝所采取的措施詳述如下 (1)、中間補(bǔ)料工藝 繁殖培養(yǎng)工序的中間補(bǔ)料當(dāng)繁殖罐內(nèi)菌種繁殖生長(zhǎng)至12～14小時(shí)，以〔補(bǔ)料配方Ⅰ〕向繁殖罐內(nèi)補(bǔ)加，其補(bǔ)料量為繁殖罐內(nèi)培養(yǎng)液體積的30～50%。
發(fā)酵培養(yǎng)工序的中間補(bǔ)料第一次中間補(bǔ)料是當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至12～24小時(shí)，以〔以基礎(chǔ)配方Ⅲ〕向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)加，補(bǔ)料量為此時(shí)發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液體積的40～50%;第二次中間補(bǔ)料是當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至30～36小時(shí)，以〔基礎(chǔ)配方Ⅲ〕向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)加，補(bǔ)料量為此時(shí)發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液體積的25～35%;第三次中間補(bǔ)料是當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至56～78小時(shí)，向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)加消毒后的無(wú)菌水，補(bǔ)加量為此時(shí)發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液體積的20～30%;第四次中間補(bǔ)料是當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至80～94小時(shí)，向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)加消毒后的無(wú)菌水，補(bǔ)加量為此時(shí)發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液體積的10～20%。
(2)、發(fā)酵培養(yǎng)工序中的發(fā)酵中期、后期強(qiáng)化處理工藝 發(fā)酵中期強(qiáng)化處理首先按〔基礎(chǔ)配方Ⅲ〕對(duì)每個(gè)中轉(zhuǎn)罐進(jìn)行備料消毒后備用。將經(jīng)過(guò)繁殖培養(yǎng)后的一個(gè)繁殖罐內(nèi)的培養(yǎng)液移出15～25%(體積比)至備用的中轉(zhuǎn)罐內(nèi)，并將繁殖罐內(nèi)剩余的培養(yǎng)液全部接種入發(fā)酵罐內(nèi)，分別進(jìn)行培養(yǎng)。將經(jīng)38～54小時(shí)培養(yǎng)后的中轉(zhuǎn)罐內(nèi)的培養(yǎng)液作為此時(shí)已發(fā)酵運(yùn)行56～78小時(shí)(即此時(shí)菌種在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)的時(shí)間與在中轉(zhuǎn)罐內(nèi)培養(yǎng)的時(shí)間相差24小時(shí))的中期發(fā)酵罐經(jīng)倒種后的中期強(qiáng)化補(bǔ)充液補(bǔ)入罐內(nèi)，補(bǔ)液量為中期發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液體積的10～15%，補(bǔ)入時(shí)該中期發(fā)酵罐應(yīng)是已進(jìn)行過(guò)倒出小部份培養(yǎng)液作發(fā)酵后期強(qiáng)化處理液的發(fā)酵罐。
發(fā)酵后期強(qiáng)化處理該工藝是一個(gè)倒種過(guò)程，將已發(fā)酵運(yùn)行57～69小時(shí)的中期發(fā)酵罐內(nèi)的中期發(fā)酵液倒種入已發(fā)酵運(yùn)行82～100小時(shí)的后期發(fā)酵罐內(nèi)，實(shí)行對(duì)處于發(fā)酵后期的發(fā)酵液中補(bǔ)入正處于發(fā)酵中期的發(fā)酵液的后期強(qiáng)化工藝，倒種量控制在后期發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積的8～12%。
發(fā)酵中期-后期強(qiáng)化處理工藝這部份是將上述兩強(qiáng)化處理聯(lián)合起來(lái)先進(jìn)行后期強(qiáng)化倒種處理，倒出種后的中期發(fā)酵罐內(nèi)經(jīng)1～9小時(shí)的繼續(xù)發(fā)酵運(yùn)行后，再將中轉(zhuǎn)罐內(nèi)給培養(yǎng)后的培養(yǎng)液移種入該中期發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行中期強(qiáng)化處理。這樣可以一罐連一罐的進(jìn)行發(fā)酵中期、后期強(qiáng)化處理。
本發(fā)明由于改進(jìn)了慶大霉素的發(fā)酵生產(chǎn)的各種培養(yǎng)基和生產(chǎn)工藝，克服了現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，使菌種在全部的培養(yǎng)過(guò)程中均處于良好的環(huán)境，使得菌種產(chǎn)抗活力強(qiáng)，能夠旺盛的合成抗生素(即慶大霉素)。改變了過(guò)去在長(zhǎng)達(dá)60小時(shí)左右的發(fā)酵后期慶大霉素的合成處于停滯的情況。采用本發(fā)明的方法，具有很高的效益，慶大霉素的發(fā)酵單位和發(fā)酵指數(shù)完全超過(guò)我國(guó)醫(yī)藥總局頒布的“七·五”慶大霉素攻關(guān)指標(biāo)發(fā)酵單位1700r/ML、發(fā)酵指數(shù)0.090總億/噸·小時(shí)的指標(biāo)，最高已達(dá)發(fā)酵單位2385r/ML、發(fā)酵指數(shù)0.1090總億/噸·小時(shí)以上。


圖1是本發(fā)明的工藝流程示意圖，圖中“→”所指為工藝流程的方向。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例工藝圖(包括發(fā)酵中、后期強(qiáng)化處理工藝過(guò)程)。圖中〔102-1〕、〔102-2〕、〔103-1〕、〔103-2〕〔104-1〕、〔104-2〕等為種子罐，〔202-1〕、〔202-2〕、〔203-1〕、〔203-2〕、〔204-1〕、〔204-2〕等為繁殖罐，〔301〕、〔302〕、〔303〕、〔304〕、〔305〕、等為發(fā)酵罐，〔401〕、〔402〕、〔403〕、〔404〕、等為中轉(zhuǎn)罐。圖中“→”表示主要接種(或移種)及放罐的方向，圖中“→”表示少量移種入中轉(zhuǎn)罐培養(yǎng)后再送入中期發(fā)酵罐進(jìn)行中期強(qiáng)化處理的方向，“·-·-·→”表示從中期發(fā)酵罐內(nèi)取少量中期發(fā)酵液倒種入后期發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行后期強(qiáng)化處理的方向。
實(shí)施例1 取2個(gè)1000立升的種子罐〔103-1〕、〔103-2〕進(jìn)行種子培養(yǎng)，采用含玉米淀粉1.0%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2%、黃豆餅粉1.0%、碳酸鈣0.6%、硝酸鉀0.05%、氯化鈷1r/ML、葡萄糖0.1%的種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每個(gè)種子罐分別投入料300立升，每個(gè)種子罐的接菌量為360ML的孢子懸浮液(含約孢子量數(shù)2760～3660億個(gè))，培養(yǎng)溫度33℃，通氣量1∶2.4～2.8，攪拌速度280轉(zhuǎn)/分。培養(yǎng)28小時(shí)后，于種子罐〔103-1〕、〔103-2〕得培養(yǎng)液各250立升。將兩種子罐〔103-1、〕〔103-2〕內(nèi)的培養(yǎng)液分別全部接種入繁殖罐〔203-1〕、〔203-2〕內(nèi)，兩個(gè)繁殖罐〔203-1〕、〔203-2〕均采用含玉米淀粉1.5%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2%、黃豆餅粉2.0%、碳酸鈣0.5%、氯化鈷8r/ML、葡萄糖0.3%的繁殖培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每個(gè)繁殖罐均為5000立升的工業(yè)發(fā)酵罐設(shè)備，并分別投料為2000立升。繁殖培養(yǎng)溫度34℃，通氣量1∶2.0～2.5，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分。繁殖培養(yǎng)至14小時(shí)，采用含玉米淀粉2.5%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.3%、黃豆餅粉2.0%、碳酸鈣0.6%、硝酸鉀0.05%、氯化鈷8r/ML、硫酸銨0.10%、葡萄糖0.3%的繁殖培養(yǎng)的中間補(bǔ)料培養(yǎng)基，兩繁殖罐〔203-1〕、〔203-2〕分別補(bǔ)料800立升和900立升。繼續(xù)繁殖培養(yǎng)至25小時(shí)，將繁殖罐〔203-1〕內(nèi)的培養(yǎng)液取出500立升接種入中轉(zhuǎn)罐〔402〕中培養(yǎng)備用，隨后將罐〔203-1〕內(nèi)剩余的2000立升的培養(yǎng)液與繁殖罐〔203-2〕內(nèi)2600立升的培養(yǎng)液一同全部移種入發(fā)酵罐〔303〕內(nèi)，發(fā)酵罐〔303〕采用含玉米淀粉5.5%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.4%、黃豆餅粉3.5%、碳酸鈣0.65%、氯化鈷10r/ML、硝酸鉀0.01%、硫酸銨0.1%的發(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基投料7000立升，采用20000立升的工業(yè)發(fā)酵罐設(shè)備。發(fā)酵培養(yǎng)溫度33～35℃，通氣量1∶1.5～1.8攪拌速度140轉(zhuǎn)/分。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至16小時(shí)，進(jìn)行第一次中間補(bǔ)料，采用本例以上的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料量為4000立升。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至35小時(shí)，進(jìn)行第二次中間補(bǔ)料，并采用與第一次中間補(bǔ)料相同的培養(yǎng)基，補(bǔ)料量為3000立升。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至60小時(shí)，補(bǔ)加2000立升無(wú)菌水。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至70小時(shí)，壓出2000立升的培養(yǎng)液倒種入后期(相對(duì)于發(fā)酵酵〔303〕而言)發(fā)酵〔302〕，實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵罐〔302〕進(jìn)行后期強(qiáng)化處理。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至71小時(shí)，將中轉(zhuǎn)罐〔403〕中經(jīng)培養(yǎng)后的全部約2000立升的培養(yǎng)液移種入本發(fā)酵罐〔303〕內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)本罐〔303〕的中期強(qiáng)化處理。當(dāng)發(fā)酵運(yùn)行至85小時(shí)，補(bǔ)加無(wú)菌水1500立升。繼續(xù)培養(yǎng)至97小時(shí)，將中期(相對(duì)本罐〔303〕而言)發(fā)酵罐〔304〕內(nèi)取出2000立升培養(yǎng)液倒種入本發(fā)酵罐〔303〕，實(shí)現(xiàn)對(duì)本發(fā)酵罐的后期強(qiáng)化處理。隨后繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至131小時(shí)，進(jìn)行放罐送往化學(xué)提純，測(cè)得慶大霉素的發(fā)酵單位為2092r/ML，發(fā)酵指數(shù)為0.1072總億/噸·小時(shí)，全部培養(yǎng)液為13000立升。
實(shí)施例2 取2個(gè)1000立升的工業(yè)發(fā)酵罐作種子罐〔102-1〕、〔102-2〕進(jìn)行種子培養(yǎng)，兩種子罐〔102-1〕、〔102-2〕經(jīng)種子培養(yǎng)均得約有250立升的培養(yǎng)液分別全部送入繁殖罐〔202-1〕、〔202-2〕內(nèi)進(jìn)行繁殖培養(yǎng)，當(dāng)繁殖培養(yǎng)至14小時(shí)，進(jìn)行補(bǔ)料，每罐均補(bǔ)料800立升，繼續(xù)繁殖培養(yǎng)至29小時(shí)，兩罐都得約2400立升的培養(yǎng)液，將繁殖罐〔202-1〕內(nèi)取出400立升培養(yǎng)液送入中轉(zhuǎn)罐〔401〕內(nèi)培養(yǎng)備用，將繁殖罐〔202-1〕剩余的培養(yǎng)液與繁殖罐〔202-1〕內(nèi)的2400立升培養(yǎng)液一同送入發(fā)酵罐〔302〕內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至20小時(shí)進(jìn)行第一次中間補(bǔ)料，補(bǔ)料量為4000立升。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至34小時(shí)進(jìn)行第二次中間補(bǔ)料，補(bǔ)料量為3000立升。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至68小時(shí)，壓出約2000立升的培養(yǎng)液送往發(fā)酵罐〔301〕。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至69小時(shí)，將中轉(zhuǎn)罐〔402〕經(jīng)培養(yǎng)后全部約2000立升的培養(yǎng)液補(bǔ)入本發(fā)酵罐〔302〕內(nèi)。繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至70小時(shí)，補(bǔ)加1000立升的無(wú)菌水。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至92小時(shí)，將發(fā)酵罐〔303〕中的培養(yǎng)液取出2000立升補(bǔ)入本發(fā)酵罐〔302〕內(nèi)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至93小時(shí)，補(bǔ)加2700立升無(wú)菌水。繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至133小時(shí)，放罐送往化學(xué)提純，此時(shí)得發(fā)酵培養(yǎng)液14100立升，測(cè)含慶大霉素發(fā)酵單位為1785r/ML，發(fā)酵指數(shù)為0.0934總億/噸·小時(shí)。
實(shí)施例3 將在種子罐〔104-1〕、〔104-2〕中經(jīng)種子培養(yǎng)后的培養(yǎng)液分別全部送入兩個(gè)繁殖罐〔204-1〕、〔204-2〕內(nèi)進(jìn)行繁殖培養(yǎng)，當(dāng)繁殖培養(yǎng)至14小時(shí)，于兩繁殖罐〔204-1〕、〔204-2〕分別補(bǔ)料各700立升。繼續(xù)繁殖培養(yǎng)至26小時(shí)，將繁殖罐〔204-1〕內(nèi)的培養(yǎng)液取出500立升送入中轉(zhuǎn)罐〔403〕內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)后備用，再將剩余的約1900立升的培養(yǎng)液同繁殖罐〔204-2〕內(nèi)的2400立升的培養(yǎng)液送入發(fā)酵罐〔304〕內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至12小時(shí)進(jìn)行第一次中間補(bǔ)料，補(bǔ)料量為4000立升。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至35小時(shí)進(jìn)行第二次中間補(bǔ)料，補(bǔ)料量為3000立升。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至59小時(shí)，補(bǔ)加1500立升無(wú)菌水。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至62小時(shí)，壓出2000立升的培養(yǎng)液送入發(fā)酵罐〔303〕。發(fā)酵培養(yǎng)至63小時(shí)，將中轉(zhuǎn)罐〔404〕內(nèi)約2000立升的培養(yǎng)液全部移入本發(fā)酵罐〔304〕內(nèi)，發(fā)酵培養(yǎng)至82小時(shí)，從發(fā)酵罐〔305〕內(nèi)取出約2000立升的培養(yǎng)液送入本發(fā)酵罐〔304〕內(nèi)。發(fā)酵培養(yǎng)至83小時(shí)，補(bǔ)加2000立升無(wú)菌水。繼續(xù)培養(yǎng)至129小時(shí)，得約14000立升培養(yǎng)液，放罐送往化學(xué)提純。測(cè)得培養(yǎng)液中含慶大霉素的發(fā)酵單位1827r/ML，發(fā)酵指數(shù)0.1090總億/噸·小時(shí)。
注以上“實(shí)施例2”和“實(shí)施例3”中未說(shuō)明部份均按“實(shí)施例1”實(shí)施。中轉(zhuǎn)罐〔401〕、〔402〕、〔403〕、〔404〕等全部是采用“實(shí)施例1”中的發(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，投料量均為2000立升，其中中轉(zhuǎn)罐〔402〕培養(yǎng)49小時(shí)，中轉(zhuǎn)罐〔403〕培養(yǎng)47小時(shí)，中轉(zhuǎn)罐〔404〕培養(yǎng)40小時(shí)，中轉(zhuǎn)罐〔401〕培養(yǎng)45小時(shí)。各實(shí)施例中各階段培養(yǎng)過(guò)程中數(shù)據(jù)見(jiàn)“表1～表3”。



權(quán)利要求
1、一種利用絳紅小單孢菌經(jīng)，砂土孢子、母瓶孢子、子瓶孢子、種子、繁殖和發(fā)酵等培養(yǎng)工藝合成慶大霉素的方法，本發(fā)明的特征在于
1、1、采取將二個(gè)繁殖罐的繁殖培養(yǎng)液接種入同一個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以加大發(fā)酵培養(yǎng)的接種量的方法，
1、2、在繁殖培養(yǎng)液接種入發(fā)酵罐的同時(shí)，將其中一個(gè)繁殖罐內(nèi)約15～25%的繁殖培養(yǎng)液移種入備用的中轉(zhuǎn)罐內(nèi)進(jìn)行38～54小時(shí)的培養(yǎng)后，適時(shí)再將該中轉(zhuǎn)罐內(nèi)全部的培養(yǎng)液移種入已經(jīng)進(jìn)行過(guò)發(fā)酵后期強(qiáng)化處理倒過(guò)種的并且罐內(nèi)還盛有正處于發(fā)酵培養(yǎng)中期的中期發(fā)酵罐內(nèi)，實(shí)現(xiàn)向該中期發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)入菌齡相對(duì)小、生命力強(qiáng)的菌種的發(fā)酵中期強(qiáng)化處理，
1、3、從正處于發(fā)酵中期的中期發(fā)酵罐內(nèi)取出少量的中期發(fā)酵培養(yǎng)液倒種入相對(duì)于該中期發(fā)酵罐而言的后期發(fā)酵罐內(nèi)，倒種量應(yīng)控制在后期發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)液體積的8～12%，實(shí)現(xiàn)將正處于發(fā)酵中的菌齡相對(duì)小、生命力強(qiáng)的菌種補(bǔ)入正處于發(fā)酵后期、菌齡小、生命力弱的菌種中去的發(fā)酵后期強(qiáng)化處理，
1、4、于繁殖培養(yǎng)至12～14小時(shí)，按[補(bǔ)料配方I]進(jìn)行繁殖培養(yǎng)工序的中間補(bǔ)料，補(bǔ)料量為繁殖罐內(nèi)培養(yǎng)液體積的30～50%，
1、5、在發(fā)酵培養(yǎng)工序中設(shè)計(jì)了四次中間補(bǔ)料工藝在發(fā)酵12～24小時(shí)進(jìn)行第一次補(bǔ)料，補(bǔ)料40～50%，于發(fā)酵30～36小時(shí)進(jìn)行第二次補(bǔ)料，補(bǔ)料25～35%，于發(fā)酵56～78小時(shí)進(jìn)行第三次補(bǔ)料，補(bǔ)加無(wú)菌水20～30%，于發(fā)酵80～94小時(shí)進(jìn)行第四次補(bǔ)料，補(bǔ)加無(wú)菌水10～20%，第一、第二次補(bǔ)料為采用[基礎(chǔ)配方Ⅲ]，四次補(bǔ)料的量為當(dāng)時(shí)發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液體積比，
1、6、為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明工藝相應(yīng)的設(shè)置一套具有二個(gè)或二個(gè)以上的種子罐、二個(gè)或二個(gè)以上的繁殖罐、一個(gè)或一個(gè)以上的發(fā)酵罐和一個(gè)或一個(gè)以上的中轉(zhuǎn)罐的設(shè)備，這些罐均采用發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中常用的帶有攪拌、通氣裝置的發(fā)酵用罐，
1、7、設(shè)計(jì)了種子、繁殖、發(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，與繁殖培養(yǎng)中的中間補(bǔ)料和發(fā)酵培養(yǎng)中的第一次、第二次中間補(bǔ)料培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基均為不含酵母粉、魚粉成份，所設(shè)計(jì)的各種培養(yǎng)基分別為
種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基玉米淀粉1.0～1.5%、玉米粉1.5～2.0%、蛋白胨0.2～0.4%、黃豆餅粉1.0～1.5%、碳酸鈣0.6～0.8%、硝酸鉀0.05%、氯化鈷1～2r/ML、葡萄糖0.1～0.2%。
繁殖培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基玉米淀粉1.5%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2～0.4%、黃豆餅粉2.0%、碳酸鈣0.5～0.8%氯化鈷8～10r/ML、葡萄糖0.3～0.5%。
發(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及第一次、第二次中間補(bǔ)料培養(yǎng)基玉米淀粉5.5～6.5%、玉米粉1.0～1.5%、蛋白胨0.2～0.5%、黃豆餅粉2.0～5.0%、碳酸鈣0.50～0.80%、氯化鈷8～12r/ML、硝酸鉀0.01～0.02%、硫酸銨0.1～0.2%。
繁殖培養(yǎng)的中間補(bǔ)料培養(yǎng)基玉米淀粉2.0～2.5%、玉米粉1.0～1.5%、蛋白胨0.3～0.4%、黃豆餅粉2.0～3.0%、碳酸鈣0.60～0.65%、硝酸鉀0.01%、氯化鈷8～10r/ML、硫酸銨0.10～0.15%、葡萄糖0.2～0.3%。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其特征在于含有玉米淀粉1.0%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2%、黃豆餅粉1.0%、碳酸鈣0.6%、硝酸鉀0.05%、氯化鈷1r/ML、葡萄糖0.1%。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的繁殖培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其特征在于含有玉米淀粉1.0%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2%、黃豆餅粉2.0%、碳酸鈣0.5%、氯化鈷8r/ML、葡萄糖0.3%。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的繁殖培養(yǎng)的中間補(bǔ)料培養(yǎng)基，其特征在于含有玉米淀粉2.5%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.3%、黃豆餅粉2.0%、碳酸鈣0.6%、碳酸鉀0.01%、氯化鈷8r/ML、硫酸銨0.10%、葡萄糖0.3%。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及第一次和第二次中間補(bǔ)料培養(yǎng)基，其特征在于均含有玉米淀粉5.5%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.4%、黃豆餅粉3.5%、碳酸鈣0.65%、氯化鈷10r/ML、硝酸鉀0.01%、硫酸銨0.1%。
全文摘要
一種利用絳紅小單孢菌合成慶大霉素的方法。采用不含酵母粉類和魚粉的培養(yǎng)基設(shè)置繁殖培養(yǎng)的中間補(bǔ)料工藝，和發(fā)酵培養(yǎng)中二次補(bǔ)加培養(yǎng)基料、二次補(bǔ)水料的四次中間補(bǔ)料工藝。通過(guò)設(shè)置中轉(zhuǎn)罐，實(shí)現(xiàn)向處于發(fā)酵中期的培養(yǎng)液內(nèi)補(bǔ)入菌齡小、生命力強(qiáng)的菌種液。通過(guò)倒種的方式向處于發(fā)酵后期的培養(yǎng)液內(nèi)補(bǔ)入菌齡小、生命力強(qiáng)的菌種液。以“雙種法”加大發(fā)酵培養(yǎng)的接種量。本發(fā)明的方法可以提高慶大霉素的合成量，其發(fā)酵單位最高可達(dá)2385r/ML。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1037924SQ8910206
公開(kāi)日1989年12月13日 申請(qǐng)日期1989年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1988年4月11日
發(fā)明者沈棨 申請(qǐng)人:福州抗菌素廠