專利名稱：尿激酶原的低分子量衍生物及含有它們的藥用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尿激酶原(單鏈尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子(SCU-PA))以及通過DNA重組來制備這些化合物的方法。
本發(fā)明提供的衍生物顯示令人感興趣的、改善了的藥理作用，具體來講它們可用作有效的溶解血栓的藥物。
我們采用部位引導的誘變技術(shù)來修飾人類表達尿激酶原(又稱scu-PA)的基因，并且將突變后的基因在大腸桿菌(E.Coli)的重組株上得到表達。這些修飾以得到低分子量的衍生物為目的。
本發(fā)明中的尿激酶原的新的分子形式被純化，然后確定了其生物化學及生物學性能。它們保留與原型的尿激酶原類似的特異性和選擇性溶解血栓的性能，然而它們失去了尿激酶原的細胞結(jié)合區(qū)域，因此在血液循環(huán)中顯示更長的半衰期。
另外，它們可以高效率地用DNA重組技術(shù)制得，從而可以較低的成本制得血栓溶解劑。
對調(diào)節(jié)生理狀態(tài)下纖維蛋白溶解的分子間作用認識的不斷深入，給了解血栓溶解的機制和發(fā)展一些新的血栓溶解劑帶來一些啟示。
在人類纖維蛋白溶解系統(tǒng)中，酶原即纖維蛋白溶酶原可以被幾種類型的纖維蛋白溶酶原激活因子激活為活性酶，即纖維蛋白溶酶。(Collen，D.和Lijnen，H.R，人類的纖維蛋白溶解系統(tǒng)，CRC Critical Reviews in oncology/hematology，4，№3，249，1986;Verstraete，M和collen，D.，八十年代的血栓溶解療法，Blood，67，№1529，1986)。纖維蛋白溶酶是降解血栓中纖維蛋白組分的主要蛋白霉(Rakoczi.I.，Wiman，B.，和Collen，P.，纖維蛋白，纖維蛋白溶酶原和抗纖維蛋白溶酶間特異性作用的生物學意義，Biochim.，Biophys.，Acta，540，295，1978;Robbins，K.C.，Summaria，L.，Hsieh，B.，和Shah，R.S.;人類纖維蛋白溶酶的肽鏈，人類纖維蛋白溶酶原到纖維蛋白溶酶的激活機理，J.Biol.Chem，242，2333，1967;Widman，B.，人類纖維蛋白溶酶B鏈的一級結(jié)構(gòu)，Eur.J.Biochem.，76，129，1977)。然而，纖維蛋白溶酶對一些血漿蛋白也顯示其溶蛋白作用，這些蛋白包括血液凝固途徑中的成份纖維蛋白原，因子Ⅴ和因子Ⅶ(Collen，D.和Lijnen，H.R.人類纖維蛋白溶解系統(tǒng)，CRC Critical Reviews in Oncology/hematology.4，№3，249，1986;Verstraete，M.和Collen，D.八十年代的血栓溶解療法，Blood 67，№6，1529，1986;Wiman，B.，B.，Ljinen，H.R.和Collen.D.，纖維蛋白溶酶的賴氨酸結(jié)合位點和α2-抗纖維蛋白溶酶和纖維蛋白原的補充位點的特異性作用，Biochim.Biophys.Acta，579，142，1979)。
纖維蛋白溶酶原的激活可能發(fā)生在全身的血液循環(huán)中，這樣使血液循環(huán)中的纖維蛋白溶酶很快被α2-抗纖維蛋白溶酶中和，因此不能用來溶解纖維蛋白(Collen，D.和Lijnen，H.R.人類的纖維蛋白溶解系統(tǒng)，CRC Critical Reviews in Oncology/hematology，4，№3，249，1986;Verstraete，M.和Collen，D.，八十年代的血栓溶解療法，Blood，67，№6，1529，1986)。當α2-抗纖維蛋白溶酶水平明顯降低時，纖維蛋白溶酶被中和得較慢，這樣不但對纖維蛋白，而且對上述的血液凝固蛋白可以顯示蛋白溶解作用。血漿中纖維蛋白原，因子Ⅴ和因子Ⅷ水平的過度降低，同某些纖維蛋白原降解產(chǎn)物對止血過程，血小板凝集和纖維蛋白聚合顯示的抑制作用一起導致止血困難，從而有大量失血的危險(Latallo，2.S.和Lpaciuk，S.血栓溶解療法的新途徑與鏈激酶連接的去纖維蛋白酶的應用，Thrombos.Diath.Haemouh.，56，253，1973;Totty，W.G.，Gilula，L.A.，Mc.Clennman，M.，Ahmed，P.，和Sherman L.低劑量血管內(nèi)的纖維蛋白溶解療法，Radiology 143，59，1982)。另一方面，纖維蛋白溶酶原的激活可能發(fā)生在纖維蛋白水平(纖維蛋白結(jié)合的纖維蛋白溶酶原激活)，得到纖維蛋白結(jié)合的纖維蛋白溶酶(Collen，D.和Lijnen，H.R.人類的纖維蛋白溶解系統(tǒng)，CRC Critical Reviews in Oncology/hematology，4.№3，249，1986;Verstraete，M.和Collen，D.八十年代的血栓溶解療法，Blood，67.№6，1529，1986)，這樣的纖溶酶不受α2-抗纖維蛋白溶酶的影響，因而不會導致全身性纖維蛋白原的溶解。
在人類慣常難ㄈ芙飭品ㄖ兇畛Ｊ褂玫南宋鞍茲苊岡せ羆?，尿激秘撏链激酶俄嵥维蛋白脫]刑匾煨裕飭礁齷銜錛せ鈦貉分謝螄宋鞍捉岷系南宋鞍茲苊岡負趺揮惺裁辭穡╖amarron，C.，Lijnen，H.R.VanHoet，B.和Collen，D.人類尿激酶的酶原和活性形式的生物學和血栓溶解性能，Ⅰ.由人類或用DNA重組技術(shù)得到的尿激酶體外在人血漿中的纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解性能，Throm.Haemostasi，52，19，1984;Samama，M.和Kher，A.，纖維蛋白溶解劑和抗纖維蛋白溶解劑，Sem.Hop.Paris，61，№20，1423，1985)。因此，在使用鏈激酶和尿溶酶的治療過程中，經(jīng)常導致全身性止血困難，這樣，大失血危險性的增加，阻礙了這些血栓溶解劑在臨床上的廣泛應用，盡管它們有很強的臨床效用(Samama，M.，和Kher，A.纖維蛋白溶解劑和抗纖維蛋白溶解劑，Sem.Hop.Paris，61，№20，1423，1985;Maizel，A.S.，和Bookstein，J.J.鏈激酶、尿激酶和組織纖維蛋白溶酶原激活劑，藥代動力學、相對的優(yōu)點以及提高速率和溶解一致性的方法，Cardiovasc.Intervent.Radiol.，9，236，1986;Bell，W.R.，鏈激酶和尿激酶用于治療肺栓塞，Thromb.Haemostas.，35，57，1976;Acar，J.，Vahanian.A.，Michel，P.L.，Slama，M.，Cormier，B.和Roger，V.，急性心肌梗塞的血栓溶解療法，SeminarsinThromb.andHaemost.，13，№2.186，1987;GISSI急性心肌梗塞有效的靜脈血栓溶解療法，Lancet，1，397，1986)。
相反，組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)(Hoylaerts，M.，Ryken，D.C.，Lijnen，H.R和Collen，D.人組織纖維蛋白溶酶原激活性劑激活纖維蛋白溶酶原的動力學，纖維蛋白的作用。J.Biol.Chem.，257，№6，2912，1982)和更近的尿激酶原(ProcUK)(Husain，S.S.，和Gureuhich.V.，人尿中單鏈、高分子量形式的尿激酶的純化和部分定性，Arch.Biochem.Biophys.，220，31，1983)，這兩個天然存在的蛋白質(zhì)是血液循環(huán)中的纖維蛋白溶酶原的弱激活劑，相反地是纖維蛋白結(jié)合的纖維蛋白溶解酶原的強激活劑，它們既不引起全身性止血困難，也不消耗α2-抗纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原，所以它們的臨床應用帶來的失血危險性較小。
t-PA的纖維蛋白特異的溶解血栓的活性，歸因于其通過特異的賴氨酸結(jié)合部位與纖維蛋白相結(jié)合的能力，特異的賴氨酸結(jié)合部位位于分子的三重二硫鍵的“Kringle”區(qū)域，因此，與纖維蛋白結(jié)合的纖維蛋白溶酶原可以在不顯著影響止血功能的情況下被激活(Collen.D.和Lijnen，H.R.，組織纖維蛋白溶酶原激活劑的作用機理和溶血栓性能，Haemostasis，16，№3，25，1986)。另一方面，尿激酶原(又稱為單鏈尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑，Scu-PA)不與纖維蛋白結(jié)合，然而，它顯示纖維蛋白特異的溶血栓作用而不影響全身性的止血功能(Pannell，R.和Gurewieb，V.，尿激酶原，其血漿中的穩(wěn)定性和選擇性溶纖維蛋白作用機理的研究，Blood，67，1215，1986;Gurewich，V.和Pannell，R.，單鏈尿激酶(尿激酶原)的纖維蛋白結(jié)合和發(fā)酵作用，SeminarsinThromb.和Haemostat，B，№2，146，1987;Lijnen，H.R.，Zamarron，C.，Blaber，M.，Winbler，M.Z.和Collen，D.，尿激酶原對纖維蛋白溶酶原的激活，I，機理，J.Biol.Chem.261，1253，1986)。對人類表達這些蛋白的基因的分離和定性以及后來用DNA重組技術(shù)制備這些蛋白進行了廣泛的研究(Collen，D.，Stassen，J.M.，Marafino，B.J.，Ruilder，JR.S.DeCock，F(xiàn)，Ogez，Jajiri，D.，Pennica，D.，Bennett，W.T.Salwa，T.和Hoyng.C.F.由重組DNA在哺乳動物細胞中表達得到的人類組織型纖維蛋白溶酶原激活劑的生物學性質(zhì)，J.Pharmacol，Exp.Ther.，231，№1，146，1984;Holmes，W.E.，Pennica，D.，Blaber，M.，Rey，M.W.，Gunzler，W.A.，Steffens.G.J.和Heynecker，H.L.代表尿激酶原的基因在大腸桿菌(EscherichiaColi)中的克隆化和表達，Biotechnology，3，923，1985)。
重組的t-PA曾送交多中心臨床試驗，用于急性心肌梗塞的病人，結(jié)果表明它在疏通堵塞了的冠狀動脈方面顯然比鏈激酶更有效(歐洲重組組織型纖維蛋白溶酶原激活劑聯(lián)合研究組急性心肌梗塞中靜脈使用重組組織型纖維蛋白溶酶原激活劑和鏈激酶對比的隨機試驗，Lancet，1，842，1985;Sheehan，F(xiàn).H.，Braunwald，E.，Canner，D.，Doodge，H.T.，Gone，J.，VanNattaP.，Passamani，E.R.，Williams，D.O.，Zaret，B.靜脈溶血栓療法對左室δ艿撓跋歟豪醋孕募」Ｈ═IMI相I)中血栓溶解的有關(guān)組織型纖維蛋白溶酶原激活劑和鏈激酶的報告，Circulation，75，4，817，1987)。尿激酶原目前處于臨床Ⅱ期的試驗中，被認為在溶血栓活性和安全性方面至少同t-PA一樣有效(VandeWerf，F(xiàn).，Nobuhara，M.和Collen，D.急性性肌梗塞的病人使用人單鏈尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(尿激酶原)后冠狀動脈的血栓溶解，AnnalsofInternalMedicline，104，345，1986;VandeWerf，F(xiàn).，Vanhaecke.J.，DeGeest，H.，Verstraehe，M.，和Collen.D.急性心肌梗塞的病人使用重組單鏈尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑后的冠狀動脈血栓溶解，Circulaton，74，№5，1066，1986)。
在人尿、血漿和許多細胞組成的適宜的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)至少有三種尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(U-PAS)的不同形式。第一種形式的特點為含有一個有溶解纖維蛋白活性的含有410個氨基的多肽，其表觀分子量為54000道爾頓，含有兩個由二硫鍵連接的肽鏈(Gunzler.W.A.，Steffens，G.J.，Oetting，F(xiàn).，Kim，SM.A.，F(xiàn)rankus，E.，和Flohe，L，從人尿中得到的高分子量的尿激酶的一級結(jié)構(gòu)，A鏈所有氨基酸的序列，Hoppe-Seyler′sA.Phisiol.Chem.，363，1155，1982)。
A鏈或輕鏈含有157個氨基酸和一個由三重二硫鍵構(gòu)成的“Kringle”結(jié)構(gòu)。這個鏈還含有一個正常細胞和新生物細胞(單細胞、類單細胞和A431表皮樣細胞)的受體結(jié)合區(qū)域。B鏈或重鏈(30，000道爾頓)含有253個氨基酸并含有催化區(qū)域。
U-PA的這一分子形式通常被為尿激酶(UK)、雙鏈尿激酶(TC-UK)或高分子量尿激酶(HMW-UK)(Gunzler，W.A.，Steffens，G.J.，Dtting，F(xiàn).，Buze，G和Fohe，L.，高分子量和低分子量尿激酶之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系，Hoppe-Seyler′sZ.Phisiol.Chem.，363，133，1982)。
U-PA的第二種形式的分子量為33，000道爾頓，是由纖維蛋白溶酶或胰蛋白對HMW形式的溶蛋白降解而得到的，它被稱為低分子量尿激酶(LMW-UK)，蛋白質(zhì)序列分析表明LMW-UK與HMW-UK一致，不同的是LMW-UK沒有NH2-端的135個氨基酸，它們是被纖維蛋白溶酶或胰蛋白酶特異性地去除的(Steffens，G.J.，Gunzler，W.A.，Otting.，F(xiàn).，F(xiàn)raankens，E.，和Flohe，L.由人尿中得到的低分子尿激酶全部氨基酸的序列，Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Ohem.，363，1043，1982)。
已確定的U-PA的第三種形式為尿激酶原(ProUK)，為尿激酶的一個單鏈(54，000道爾頓)形式，從而也稱作單鏈尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(SCU-PA)。
尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的所有分子形式均已由DNA重組技術(shù)制得(Zamarron.C.，Lijnen，H.R.，VanHoef，B.，和Collen，D.人尿激酶的酶原和活性形式的生物學和溶血栓性質(zhì)，I.從人尿中或由DNA重組技術(shù)得到的尿激酶體外在人血漿中的纖維蛋白溶解作用或纖維蛋白原溶解作用，Thromb.Haemostas.，52，19，1984;Holmes，W.E.，Pennica，D.，Blaber，M.，Rey，M.W.，Gunzler，W.A.，Steffens，G.J.和Heynecker，H.L.大腸桿菌(EscherichiaColi)中尿激酶原基因的克隆化和表達，Biotechnology，3，923，1985;Gunaler，W.A.，Henninger，W.，Hennies，H.H.，Otting，F(xiàn).，Schneider，J.，F(xiàn)riderichs，E.，Giertz，H.，F(xiàn)lohe，L.，Blaber，H.和WinklerM.由細菌產(chǎn)生的人尿激酶對比于從人尿中得到的尿激酶的功能定性，Haemostasis，14，60，1984)。
通過部位特異的誘變，我們從人類表達尿激酶原的基因開始，得到了一系列表達新的和原來的單鏈尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑衍生物的修飾了的基因，這些衍生物為在開始的162個氨基酸中失去不同大小的序列片段的較低分子量的類似物。
修飾后的基因在大腸桿菌(E.coli)的重組株中表達，新的重組產(chǎn)物，以其單鏈形式被純化，并確定它們有特異性溶解纖維蛋白栓塞的能力。
這些新分子形式的化合物，以前從未在自然界中發(fā)現(xiàn)過，這正是本發(fā)明的目的所在。這些單鏈低分子量的尿激酶原衍生物具有特異的血栓溶解作用，可有效地替代原來的或重組的尿激酶原。試驗表明它們的半衰期較長，從而也延長了其藥理作用。
本發(fā)明的一個方面是提供一個人尿激酶原的低分子量衍生物，它至少含有完整尿液酶原單鏈構(gòu)型的氨基酸163到氨基酸411之間的序列。
更好的情況是，衍生物至少含有氨基酸151到411，氨基酸141到411之間的序列，或者至少含有完整尿激酶原的氨基酸1到10連到完整尿激酶原的氨基酸136到411的序列。
本發(fā)明還提供一個衍生物，其中不存在包含在序列氨基酸48～135間的完整尿激酶原的“kringle”區(qū)域或包含在序列氨基酸11～47間的完整尿激酶原的受體結(jié)合區(qū)域或細胞結(jié)合區(qū)域。
本發(fā)明還包括進一步修飾的上述衍生物，可以是氨基酸的去除、插入或取代，或者含有至少一個附加的氨基酸。
本發(fā)明還進一步包括含有上述衍生物的藥用組合物，以及制備這些衍生物的DNA序列、載體和轉(zhuǎn)換宿主。
完整的尿激酶原理解為長度完整的尿激酶原。
另外，本發(fā)明提供的衍生物至少缺少下列一個完整尿激酶原的區(qū)域-“Kringle”區(qū)域-受體結(jié)合區(qū)域，或細胞結(jié)合區(qū)域。
再者，衍生物在多肽的-NH端可以有一個附加的蛋氨酸殘基，或可帶有至少一個糖甙側(cè)鏈。衍生物也可含有另外的至少一個任何來源的氨基酸序列。
本發(fā)明中后面的幾類衍生物可通過用纖維蛋白溶酶處理前述的衍生物來得到。
本發(fā)明中的衍生物可以做成與適于藥用的載體相混合的藥用組合物的形式，這樣的藥用組合物為有效的溶血栓藥物。
新尿激酶原衍生物的分子特性新的尿激酶原衍生物是由寡核苷酸引導的誘變來得到的。具體來講，設計并合成一些寡核苷酸來導致尿激酶原基因的密碼區(qū)域的去除。這一方法的原理是將尿激酶原基因亞克隆化至一個能以單鏈形式得到的載體上，例如質(zhì)粒載體M13。重組的單鏈與補充的合成的含有所需密碼序列而不含有要除去的序列的寡脫氧核糖核苷酸一起孵育，然后用DNA聚合酶和連接酶來延長新鏈并將其連接成環(huán)狀形式。新生成的雜二重DNA用來將細胞線轉(zhuǎn)化為可以復制的，并得到一個子代，其中帶有原型基因和已進行過必要的消除的基因的質(zhì)粒將分成兩種不同的分子種類。起始的致突變的寡核苷酸可用作檢測突變基因的探針。
突變基因隨后可插到大腸桿菌表達載體上，這些載體可指導新尿激酶原衍生物的合成，然后重組的分子得到純化和定性。
組成本發(fā)明主要內(nèi)容的新尿激酶原衍生物可歸納如下a)稱為△125的形式，(表觀分子量約為31kd)，是通過去除尿激酶原基因中從氨基酸11到氨基酸135之間的DNA序列而得到的。這一衍生物由286個氨基酸組成，它保留了原有的溶蛋白區(qū)域而失去了“Kringle”區(qū)域，它以單鏈形式分離得到，可以被纖維蛋白溶酶轉(zhuǎn)化為其雙鏈構(gòu)型。△125用纖維蛋白溶酶處理后具有解酰胺的活性。
b)稱為△140的形式，(表觀分子量約為30kd)，它是去除尿激酶原的開始的140個氨基酸而得到的。由271個氨基酸組成的這個衍生物是以其單鏈構(gòu)型分離得到的，用纖維蛋白溶酶處理后可得到其有解酰胺活性的雙鏈形式。
c)稱為△150的形式，(表觀分子量約為29Kd)，是由尿激酶原中去除開始的150個氨基酸而得到的。含261個氨基酸的這一衍生物的單鏈構(gòu)型是無解酰胺活性的，當用纖維蛋白溶酶處理后，則變成完全有活性的。
d)稱為△162的形式，(表觀分子量約為27kd)，是從尿激酶原中去除開始的162個氨基酸而得到的。這個含有249個氨基酸的衍生物相當于B鏈尿激酶，只是沒有開始的4個氨基酸。
所有我們的新衍生物，以圖表形式歸納于

圖1，其各自的特異性活性列于表1。
體外125I-標記的纖維蛋白栓溶解及纖維蛋白原溶解活性。
在如前所述的125I標記的人血漿栓塞浸在含檸檬酸的人血漿組成的體外試驗系統(tǒng)中測定了代表性的尿激酶原衍生物的相對溶纖維蛋白和溶纖維蛋白原活性(Matsuo，O.，Ryken，D.C.和Collen，D.體外組織纖維蛋白溶酶原激活劑和尿激酶的相對溶纖維蛋白原、溶纖維蛋白和溶血栓作用的比較，Throm.Haemost.，45，225，1981)。原型的尿激酶原和人尿中的雙鏈尿激酶作為參照產(chǎn)物。
將125I標記的血栓加至2.0毫升沉淀過的血漿中，記數(shù)，在水浴37℃時加或不加(對照)1.50i.u./ml各個尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的情況下孵育，研究TC-UK時其濃度為50i.u./ml。孵育4小時后，除去血漿樣品，125I標記測定，由溶解了的放射性同位素可算出溶解百分率。另外，還測定了各個樣品的血漿纖維蛋白原水平(Vermylen，C.，De Vreker，.R.，和Verstraete，M.纖維蛋白原的快速酶法測定纖維蛋白的聚合時間(FPT-試驗)，Clin.Chim.Acta，8，418，1963)，并表示為基線值(對照樣品)百分數(shù)。
尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(尿激酶原及其低分子量衍生物濃度為iu/ml;TC-UK的濃度為50i.u./ml)在血漿中的穩(wěn)定性在室溫預孵育14小時后測定。預孵育后，往各混合物中加入新鮮制備的125I標記血栓，并置于37℃，將三重樣品如上測定并計算其溶解率。
所得結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，所有受試的低分子量衍生物均可誘導完全的血栓溶解而無明顯的溶纖維蛋白原作用。本發(fā)明中的低分子量尿激酶原衍生物顯示極為有效的纖維蛋白特異的栓溶作用。
另外，本發(fā)明的低分子量衍生物在人血漿中孵育24小時后仍保留其溶栓效力，這表明這些分子在血漿中更穩(wěn)定，類似原型的尿激酶原，而不類似于TC-UK。
新尿激酶原衍生物的藥代動力學曲線。
本發(fā)明一些代表性尿激酶原衍生物的藥代動力學曲線通過紡普通鼠靜脈注射80.000IU/kg的方法測定。
類尿激酶抗原水平及優(yōu)球蛋白組分的溶解纖維蛋白活性在注射前及注射后0.5，1，2，5，10，20，30分鐘后測定。
所得結(jié)果見圖2。
這些結(jié)果顯示與天然原型尿激酶原衍生物△125比較(初始t1/2小于5分鐘)，U-PA相關(guān)抗原的血漿消失速率慢得多。
另外，優(yōu)球蛋白部分的溶解纖維蛋白活性與血漿中U-PA抗原水平相關(guān)。
這些新尿激酶原衍生物與肝素的作用在抗凝血治療中經(jīng)常會在血漿中碰到藥理劑量的肝素(在0.01至1IU/ml范圍內(nèi))，這劑量在體外明顯增加纖維蛋白溶酶活化一些代表性的新LMW衍生物△125的活化速率(圖3顯示)。天然原型尿激酶原也顯示出這種作用，但程度小得多。
討論和結(jié)果本發(fā)明中受試的新衍生物△125，△140和△150所觀察到的酰胺解行為顯示任何含有尿激酶原最后261個氨基酸的單鏈構(gòu)型在纖維蛋白溶酶把它活化而轉(zhuǎn)變成雙鏈構(gòu)型(表1)后，都顯示出酰胺解活性。
在進行溶解血栓治療而伴有抗凝血作用時，肝素可達一定濃度(0.01-1IV/ml)，此濃度能極顯著地刺激本發(fā)明中的一個衍生物(△125)被纖維蛋白溶酶的轉(zhuǎn)化成雙鏈構(gòu)型。原型尿激酶原也顯示出此作用，但程度要小得多。
另一方面，此新LMW衍生物能使125I-標記的人纖維蛋白栓完全溶解而不引起持續(xù)性纖維蛋白原溶解作用，而雙鏈尿激酶不是這樣。
另外，在加入I標記的人纖維蛋白栓前在血漿中對此新衍生物進行至少24小時的孵育仍有上述作用。與此相反，在人血漿中進行長時間孵育后，TC-UK的栓溶解作用完全消失。
最后，本發(fā)明中的一個新衍生物(△125)給大鼠一次靜脈注射后，觀察到其血中的半衰期顯著地延長了(圖3)。
由此可得到下述結(jié)論-本發(fā)明中的新分子量的衍生物具有原型尿激酶原內(nèi)在的酰胺解作用并且可在纖維蛋白溶酶的激活下完全活化成一具有酰胺解活性的雙鏈型。
-纖維蛋白溶酶對本發(fā)明的新分子量的衍生物的活化作用及隨后把它們轉(zhuǎn)化成完全具酰胺解活性的雙鏈構(gòu)型過程能顯著地被肝類刺激。由于臨床上肝素往往與溶解血栓治療相關(guān)，這種對本發(fā)明的新尿激酶原衍生物的刺激作用也許改善其血栓溶解活性。
-與非特別異性的TC-UK比較，本發(fā)明的新分子量的衍生物對纖維蛋白栓的溶解作用更專一。因此，所有具有氨基酸序列151至411的單鏈構(gòu)型尿激酶原衍生物是比TC-UK優(yōu)越的血栓溶解劑，具有更小的大出血危險。
-另外，由于新的尿激酶原衍生物沒有尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑位于殘基13-30(Appella，E.Robinson，E.A.，Ullrich，S.J.stoppelli，M.P.，Corti，A.，Cassani.G.，和Blasi，F(xiàn).，Theveceptorbindingsequenceofurokinase，J.Biol.Chem.262，№10，4437，1987)的細胞結(jié)合部位，與原型尿激酶原和TC-UK比較，前者在循環(huán)中的半衰期可顯著地延長。因此，本發(fā)明新的低分子量的尿激酶原衍生物的纖維蛋白特異的溶栓活性，肝素治療中其作用的潛在增強和在循環(huán)中半衰期的延長，無疑使它們比雙鏈尿激酶和原型尿激酶原在治療上有優(yōu)越性。
方法誘變用已發(fā)表的方法(ManiatisT.，F(xiàn)ritschE.F.和SambrookJ.，MoleculorClonging，實驗指導，ColdSpringHarbour1982)Weizmann研究所(以色列)對人前尿激酶原的基因密碼進行了克隆化。為完成所要的誘變，采用方便的限制性內(nèi)切段并在M13質(zhì)粒載體上進行亞克隆化(ZollerM.J.和SmithM.用M13-衍生載體進行寡核苷酸引導誘變在任何DNA片段上產(chǎn)生點突變的一種有效而通用的方法，《核酸研究》，101，6487，1982)。
用已發(fā)表的方法生長單鏈形式的重組質(zhì)粒載體20ng;這些M13單鏈DNA在10毫摩爾濃度的Tris-HCl(PH為7.5)，0.1毫摩爾濃度EDTA，50毫摩爾濃度Na Cl液中于95℃加熱5分鐘然后逐步冷卻至室溫得普通寡核苷酸。然后順序加入下列組分ATP至濃度為0.4毫摩爾濃度，dCTP，dGPT，dTTP至0.12毫摩爾濃度，dATP至0.04毫摩爾濃度，1單位的大腸桿菌多聚酶I的Klenow片段和0.5單位的T4 DNA連接酶(Boenringer Mannheim)。最后加入濃度為35毫摩爾濃度Tris-HCl(PH為7.5)，0.1毫摩爾濃度EDTA，6毫摩爾濃度MgCl2，0.006毫摩爾濃度DTT的50微升溶液。在15℃下孵育12小時后，按已知的方法(Zoller M.J.和Smith M.，用M13衍生載體進行寡核苷酸引導的誘變在任何DNA片段上產(chǎn)生點突變的一種有效而通用的方法，《核酸研究》，101，6487，1982)用所得DNA橫切大腸桿菌JM101細胞。
用于產(chǎn)生所需消除的寡核苷酸用含150βCi(α-32P)ATP(新英格蘭核，6000Ci/毫摩爾)，70毫摩爾濃度的Tris-HCl(PH為8)，10毫摩爾濃度的MgCl2，5毫摩爾濃度的DTT和10單位的T4多聚核苷激酶(Boekringer Mannkeim)的50微升混合物于37℃下孵育30分鐘。標記的寡核苷酸用于雜交產(chǎn)生突變的質(zhì)粒DNA。
在10毫摩爾濃度Tris-HCl(PH為8)，其中含有3×ssc，0.1%SDS，10×Denhart′s和0.2毫克/毫升變性的鮭魚精子DNA的溶液于65℃下雜交過夜。用0.4ssc，0.1%SDS在65℃下洗滌硝基纖維素過濾器30分鐘，然后把過濾器用X光照射過夜。選出顯示已雜交的段用美國M13序列分析儀進行Sanger二脫氧核苷酸序列分析。
用傳統(tǒng)的表達質(zhì)粒(ManiatisT.，F(xiàn)ristschE.F和SammbrookJ.，《分子克隆》，一實驗室手冊，ColdSpringHarbour1982)，突變的基因表達于重組的大腸桿菌株上，然后進行培養(yǎng)生產(chǎn)所需分子。
重組分子的純化破壞細菌后，重組產(chǎn)品在不溶組分內(nèi)。用10毫摩爾濃度的Triis-HCl(PH為8.5)，0.1%Triton×100洗滌固體后，不溶物重新懸浮于含6摩爾濃度鹽酸胍、0.1摩爾濃度β-巰基乙醇、10毫摩爾濃度的Tris-HCl(PH為8.5)的溶液中。此懸浮液然后在4℃下?lián)u晃16小時并離心分離，上清液然后以1∶25的比例加入含10毫摩爾濃度Tris-HCl(PH為8)、2.5毫摩爾濃度尿素，8毫摩爾濃度EDTAD緩沖液中進行變構(gòu)。此溶液在15℃下保持24小時。為降低離子強度，此變構(gòu)緩沖液首先用超濾法濃縮10倍，然后用含10毫摩爾濃度Tris-HCl(PH為7.8)、2.5摩爾濃度尿素、8毫摩爾濃度EDTA的溶液稀釋4倍。此重新激活的纖維蛋白溶解劑然后用快速瓊脂糖(Pharmacia)進行離心交換色譜純化，用(0至1摩爾濃度)氯化鈉溶液線性梯度洗脫。收集活性組分，用交聯(lián)葡聚糖G-25(Pharmacia)進行過濾脫鹽(用50毫摩爾NH4HCO3溶液)，然后冷凍干燥。最后的純度在80%至98%之間。
作為另一種方法，本發(fā)明的衍生物可以連同信號肽一起表達，從而從上清液內(nèi)收集到衍生物。
尿激酶型酰胺解活性TC-UK(Serono;batch№870402)，尿激酶原(sero研究所，batchODO1205100)及本發(fā)明的低分子量衍生物(△125，△140，△150)的酰胺解活性用生色底物S-2444(Glu-Gly-Arg-ONa;KabiVitrum)確定。這種分析方法基于TC-UK內(nèi)在的酰胺解活性及在纖維蛋白溶酶激活下這些單鏈尿激酶型纖維蛋白溶酶原活劑得到的酰胺解活性。尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑與生色底物作用所產(chǎn)生的DNA量在波長為410納米時用分光光度法用微板讀數(shù)儀(minireaclerⅡ，Dynatech)檢測。
濃度逐漸增大的各纖維蛋白溶酶原激活劑(范圍從1納克至100微克/每毫升)在含0.05摩爾濃度Tris，0.038摩爾濃度NaCl，0.01%吐溫80的Tris-HCl緩沖液(PH為8.8)在纖維蛋白溶酶存在下(12.5微克/毫升)于37℃孵育15分鐘，使其活化。同時，也包括相應的對照組(無纖維蛋白溶酶活化)。孵育后，取各活化液20微升加入含0.25毫克/毫升S-2444和100KIU/毫升aprofinin的含底物的180微升Tris-HCl緩沖液(PH為8.8)中。
這些混合物在37℃下繼續(xù)孵育30分鐘。加入50微升50%的乙酸水溶液中止反應。
采用相同的方法，參考從P.J.Gaffney博士(國家生物標準研究所，英國倫敦)得到的“制備尿激酶國際參考標準”建立校準曲線。
對每一產(chǎn)品，都通過上述校準曲線把吸光密度結(jié)果轉(zhuǎn)化成IU/毫升。
通過測量各尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑制品用Bio-rad產(chǎn)的Bradford微量分析儀(標準Ⅱ，BSA)測定蛋白含量后計算出其特異性活性(IU/毫克蛋白)。S-2444試驗和蛋白分析已有描述(Pannell，R.，和Gurewich.，V.，單鏈或雙鏈尿激酶對纖維蛋白溶酶原的激活作用。A.單鏈尿激酶具有低的催化活性(尿激酶原)的論證，blood，69，№1，22，1987;Bradford，M.M.，一種用蛋白染色原理測定微克級蛋白質(zhì)快速而靈敏的定量方法。Anal.Biochem.，72，248，1976)。
肝素中的尿激酶原型的酰胺解活性將原型尿激酶原(終濃度1000IU/ml)和新尿激酶原衍生物△125(終濃度1000IU/ml)的0.05MTris-HCl緩沖液(PH為7.4，含0.038MNaCl和0.01%Tween80)在肝素(濃度0.001-10IU/ml)存在或不存在下于37℃用血漿(終濃度10mg/ml)處理。在不同的時間間隔(5，10，15分鐘)，除去等分試樣并用已述的產(chǎn)色素的底物S-2444測量產(chǎn)生的雙鏈尿激酶原型酰胺解活性。
尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的栓溶活性(Matsuo.O.，Ryken，D.C.，和Collen.D.，體外組織纖維蛋白溶酶原和尿激酶的相對溶解纖維蛋白原、溶解纖維蛋白和溶解血栓作用的比較。Thromb.Haemost.，45 25，1981)。
在4℃下通過對血樣(收集于10毫摩爾濃度的檸檬酸三鈉中于3000轉(zhuǎn)下離心分離10分鐘得到含血小板少的正常血漿(PPP)。
含有125I標記的人纖維蛋白原的加入檸檬酸鹽的可分量入PPP(0.5毫升)通過加入CaCl(最后濃度為25毫摩爾濃度)和人凝血酶(最終濃度為2NIH/毫升)而成栓?；旌衔锍槲凉韫?內(nèi)徑為4毫米)中，然后在37℃5下成栓30分鐘。將管切成1.5厘米的小段。栓傾于Petri盤中于室溫下用0.15摩爾濃度NaCl液以不同方式洗滌5分鐘。
放射性同位素記數(shù)后，栓立刻于37℃下在含2毫升PPP和50微升含0.05摩爾濃度Tris-HCl(PH為7.4)、0.038摩爾濃度NaCl和0.01%吐溫80的溶液中孵育。
加入尿激酶類纖維蛋白溶酶原激活劑溶液，(當為尿激酶原、△125，△140，△150時，最終濃度為150IU/毫升;當TC-UK1米最終濃度為50IU/毫升)或緩沖液(Tris-HCl為0.05摩爾濃度，NaCl為0.038摩爾濃度和0.01%Tween80，PH為7.4)。
在37℃下孵育4小時后通過三份樣品的從血栓釋至血漿介質(zhì)中的放射性同位素的量計算栓溶程度。結(jié)果用基線值(無纖維蛋白溶解劑)的百分比表示。
尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的穩(wěn)定性。
TC-UK(50IU/毫升)，尿激酶原和其低分子量衍生物(150IU/毫升)在人普通含擰酸鹽的PPP中室溫下孵育24小時。然后，加入新制備的I標記的人血栓并用前述方法測量栓溶程度(Matsuo，O.，Ryken，D.C.，和Collen，D.，體外組織纖維蛋白溶酶原和尿激酶的相對溶解纖維蛋白原、溶解纖維蛋白和溶解血栓的作用比較。Thromb.Halmost.，45，225，1981)。
血漿纖維蛋白原水平。
125I標記的人血栓與各個尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑在37℃下孵育4小時后，收集血漿組份(50微升為一份)并用纖維蛋白原-纖維蛋白聚合試驗(Vermylen，C.，De Vreker，R.，和Verstraete，M.，纖維蛋白原的快速酶法測定纖維蛋白聚合時間的酶測定方法(FPT試驗)、(Clin.Chim.Acta，8，418，1963)測定其纖維蛋白原的含量。
藥代動力學研究使用體重在150-200克的雄性正常大鼠(SpragueDawley;CharlesRiuer)。
所有大鼠禁食過夜，實驗用時當天用戊巴比妥(50毫克/公斤，肌肉注射)麻醉。原型尿激酶原和新低分子量尿激酶原衍生物△125單劑量80.000IU/公斤靜脈注射(尾部血管)。對照組注射鹽水。注射后于0(注射前)，0.5，1，2，5，10，20，30分鐘從腹部主動脈取血樣并加入擰酸酸三鈉(最終濃度為0-0.11摩爾/升)抗凝。每一樣品、每一時間間隔至少包括3只大鼠。血樣離心分離(200xg.;15分鐘，4℃)，血漿用纖維蛋白一板方法(AtrupT.和Muellertz，S.，Arch.Biochem.Biophys.，40，346-351，1952)測定優(yōu)球蛋白部分的溶解纖維蛋活性并用原型尿激酶原內(nèi)標樣品校準的酶連接的免疫吸附分析(Elisa)測定尿激酶相關(guān)抗原的水平(Grondahl，HansenJ.，AgerlinN.，Munkholm，LarsenP.，BachF.，NielsenL.S.，DcmbernowskyP.和DanoK.，尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的靈敏而專一的酶連接的免疫吸附分析及其在乳腺癌病人血漿中的應用，J.Lab.Clin.Med.，111，1，42-51，(1988)。
表1低分子量尿激酶原衍生物的尿激酶型酰胺解活性分子酰胺解活性(i.U/毫克)＊不含纖維蛋白溶酶含纖維蛋白溶酶△125測不出96000△140測不出85000△150測不出105000pro-UK測不出98000TC-UK128000128000＊在纖維蛋白溶酶(12.5μg/ml)處理前和處理后尿激酶酰胺解活性用生色底物S-2444測定(Pannell，R.，和Gurewich，V.，單鏈或雙鏈尿激酶對纖維蛋白溶酶原的激活作用。A.單鏈尿激酶具有低的催化活性(尿激酶原)的論證，Blood，69，№1，22，1987)。
尿激酶原及其低分子量衍生物及人TC-UK的特異性活性的測定，參考從P.J.Gaffney博士(國家生物標準研究所，倫敦)得到的“制備尿激酶國際參考標準”建立標準曲線。
表2低分子量尿激酶原衍生物的溶解纖維蛋白和溶解纖維蛋白原活性分子血漿中125I標記基底體積的纖 24小時孵育后血栓的溶解活性維蛋白原水平栓中125I標記栓(用百分數(shù))(占百分數(shù))解活性的穩(wěn)定性△125958590△140859090△1501005085pro-UK1008580TC-UK100100
權(quán)利要求
1.一個單鏈構(gòu)型的至少含有完整尿激酶原氨基酸序列163至411的低分子量人尿激酶原衍生物。
2.一個單鏈構(gòu)型的至少含有完整尿激酶原氨基酸序列151至411的低分子量人尿激酶原衍生物。
3.權(quán)利要求1和2中的一個衍生物，其中不存在位于完整尿激酶原的氨基酸的48-135序列Kringle區(qū)域。
4.權(quán)利要求1至3中任何一項中的一個衍生物，其中至少不含有位于氨基酸序列11-47的受體結(jié)合區(qū)域或細胞結(jié)合區(qū)域。
5.權(quán)利要求2中的一個衍生物，其中完整尿激酶原氨基酸序列1-10與序列136-411相聯(lián)。
6.權(quán)利要求2中的一個衍生物，其中含完整尿激酶原氨基酸序列141-411。
7.權(quán)利要求2中的一個衍生物，其中含完整尿激酶原氨基酸序列151-411。
8.權(quán)利要求1中一個衍生物，其中含完整尿激酶原氨基酸序列163-411。
9.上述權(quán)利要求中任何一項中的一個衍生物，其氨基端加一個蛋氨酸殘基。
10.上述權(quán)利要求中任何一項中基一個衍生物，其至少接一個糖苷側(cè)鏈。
11.構(gòu)成蛋白質(zhì)的上述權(quán)利要求中任何一項中的一個衍生物由氨基酸缺失、取代或插入得到，再含有至少一個任何形式的氨基酸序列。
12.用纖維蛋白溶酶處理上述任何權(quán)利要求中的衍生物所得的一個低分子量衍生物。
13.由圖1所描述的任何一個低分子量衍生物。
14.由上述權(quán)利要求中任何一項的衍生物與適于藥用的載體組成的一個藥用組合物。
15.權(quán)利要求1-13中的任何一個衍生物作為溶血拴劑。
16.利用權(quán)利要求1-13中的任何一項中的衍生物生產(chǎn)溶血拴劑。
17.權(quán)利要求1-13的任何一個衍生物的DNA序列密碼。
18.一個生產(chǎn)權(quán)利要求17中DNA序列的方法，其中包括部位特異性誘變?nèi)四蚣っ冈虻牟襟E。
19.權(quán)利要求18中的方法，其中采用不含所要去除序列的合成寡脫氧核糖核苷酸來完成部位特導性誘變，并用標記挽救技術(shù)(marker rescue technique)來完成。
20.一個權(quán)利要求17中的DNA序列的表達載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20由載體轉(zhuǎn)變的一個宿主微生物，其中還含有助催化劑Ptrp和質(zhì)粒MS-2的Shine-Dalgarno序列。
全文摘要
低分子量尿激酶原衍生物及含有它們的藥用組合物。
單鏈構(gòu)型的至少含有完整尿激酶原氨基酸序列163—411的人尿激酶原低分子量衍生物。
較好的是，衍生物不含Kiangle區(qū)域、受體結(jié)合區(qū)域或細胞結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列。
這些衍生物可與適于藥用的載體混合制劑。這些制劑具有溶解血栓的作用。
文檔編號C12N9/72GK1037360SQ8910235
公開日1989年11月22日 申請日期1989年4月18日 優(yōu)先權(quán)日1988年4月18日
發(fā)明者安娜·布蘭達扎, 杰克蘭·蘭森, 蓋·瑪祖, 波羅·薩明托斯 申請人:法米塔利亞·卡洛·埃巴有限責任公司