專利名稱：毒蛇毒液多肽及基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制血小板聚集作用的多肽。
總地說來，本發(fā)明涉及控制細(xì)胞粘連、抑制血纖維蛋白原和其他蛋白質(zhì)與血小板結(jié)合，以及抑制血小板的聚集。血纖維蛋白原是一種存在于血漿中的糖蛋白，它參予血小板聚集和血纖維蛋白的生成。血小板是見于所有哺乳動物血液中的細(xì)胞無核片段，這些片段參予血液的凝固。已知血纖維蛋白原與受體(血小板膜糖蛋白復(fù)合物Ⅱb/Ⅲa)之間的相互作用對于正常的血小板功能是不可少的。
血管損傷時，血小板粘附在破裂的血管內(nèi)皮下表面上。這種粘附的血小板隨后釋放出具有生物學(xué)活性的成分并導(dǎo)致聚集。凝集作用是因凝血酶、腎上腺素或ADP等激動劑結(jié)合于血小板膜受體上而引發(fā)的。激動劑引起的刺激作用導(dǎo)致潛在的血纖維蛋白原受體暴露于血小板表面上，并使血纖維蛋白原與糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物相結(jié)合。
為了探討血小板之聚集和粘連作用的機(jī)理，已使用天然產(chǎn)物和合成的肽進(jìn)行過許多實(shí)驗(yàn)研究。已由各種蛇毒液中分離出血小板聚集抑制劑蛋白質(zhì)。但是，在進(jìn)行血小板聚集作用受這些蛋白質(zhì)抑制之機(jī)理的研究中，多因缺乏結(jié)構(gòu)方面的知識而受到阻礙。
最近，文獻(xiàn)詳細(xì)介紹了一種稱為trigramin的毒液肽(見Huang等，J.ofBiolChem.，262;16157-16163，1987及1987年11月16日提交的美國專利申請121972號)。據(jù)報導(dǎo)，這種肽可竟?fàn)幮缘匾种蒲w維蛋白原與血小板膜上糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物的結(jié)合。據(jù)信，這種肽含有靠近COOH末端殘基的Arg-Gly-Asp順序。
Rouslahti和Pierschbacher(Science，238491-497，1987)描述了某些粘連蛋白質(zhì)，如粘連蛋白、Vitronectin，Osteopontin、膠原、thrombospondin、血纖維蛋白原及存在于細(xì)胞外基質(zhì)和血液中的VonWillebrand因子。這些蛋白質(zhì)均含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽作為其細(xì)胞識別位點(diǎn)。該三肽可被一族結(jié)構(gòu)上相關(guān)的受體(integrin)中至少一個成員識別，所說的受體是具有兩個跨膜亞單位的異源二聚體蛋白質(zhì)。作者認(rèn)為個別蛋白質(zhì)中三肽順序的構(gòu)象可能是產(chǎn)生識別特異性的關(guān)鍵。
Chersh(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，846471-6475，1987)介紹了一種由人內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的Arg-Gly-Asp定向粘連的受體，該受體在結(jié)構(gòu)上與血小板上的Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物相似，但在抗原性和功能上則有所不同。這種受體直接參予血纖維蛋白原、VonWillebrand因子和Vitronectin在內(nèi)皮細(xì)胞上的結(jié)合過程。
Pierschbacher和Rouslahti(J.ofBiol.Chem.262，3617294-17298，1987)描述了Arg-Gly-Asp-Xaa順序的立體化學(xué)對含有三肽順序Arg-Gly-Asp肽之結(jié)合特異性的影響。他們還描述了(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，815985-5988，1987)保留連接促進(jìn)活性之粘連蛋白細(xì)胞識別位點(diǎn)的變體。四肽Arg-Gly-Asp-Ser被描述為細(xì)胞識別的大的、粘連糖蛋白-粘連蛋白中的最小結(jié)構(gòu)。美國專利4，589，881和4，614，517中介紹了某些包含-Arg-Gly-Asp--Ser一部分的肽。美國專利4，578，079中公開了一些包含-Arg-Gly-Asp-R部分的肽，其中R選自蘇氨酸、半胱氨酸或其他具有如粘連蛋白樣細(xì)胞粘連活性的氨基酸。
Ruggeri等(Proc，Natl.Acad.Sci.USA，885708-5712，1986)介紹了一系列設(shè)計(jì)長度達(dá)16個氨基，且含有抑制血纖維蛋白原與血小板結(jié)合順序Arg-Gly-Asp-Val的合成肽。
Gold等(Circulation，77，3670-677，1988年3月)描述了大劑量注射重組單鏈組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑和抗人血小板GPⅡb/Ⅲa受體之小鼠單克隆抗體(7E3)F(ab′)2片段對冠狀動脈血栓溶解和再阻塞的影響。Gold等人發(fā)現(xiàn)，與重組單鏈組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑一起注射抗血小板受體GPⅡb/Ⅲa之單克隆抗體7E3的F(ab′)2片段可加速血栓溶解并防止再阻塞。
雖然人們知道三肽Arg-Gly-Asp順序存在于某些能復(fù)制或抑制粘連蛋白及Vitronectin之細(xì)胞粘接促進(jìn)作用的多肽中，但對于多肽中其他氨基酸之結(jié)合特異性的影響卻所知甚少。申請人鑒定并提純了一些包含三肽順序Arg-Gly-Asp的多肽，這些多肽是血小板聚集抑制劑并在與三肽相聯(lián)系的特定的位置上含有半胱氨酸殘基。半胱氨酸的特殊定位，對于這些多肽抑制血小板聚集作用的能力似乎具有很重要的影響。
由于化學(xué)合成長鏈寡聚脫氧核苷酸之可靠方法和儀器的出現(xiàn)，現(xiàn)已能夠方便地進(jìn)行基因合成，而無須分離表達(dá)天然基因(Caruthers，Science，230281-285，1985;Ferretti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83599-603，1986;Wosnick等，Gene，60115-127，1987;Nassal，Gene，66279-294，1988;Bell等，Gene，63155-161，1988)。這一技術(shù)特別適用于表達(dá)并以遺傳工程方法制備小的天然蛋白質(zhì)。但是在細(xì)菌寄主中表達(dá)的許多真核生物蛋白質(zhì)均不穩(wěn)定(Taniguchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775230-5233，1980;Davis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，785376-5380，1981;Shen，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，814627-4631，1984;Lennick等，Gene，61103112，1987)。為避免所說的不穩(wěn)定問題，常用的手段是使所需的基因與編碼細(xì)菌蛋白的核苷酸順序相結(jié)合，以產(chǎn)生融合的蛋白質(zhì)，從而保護(hù)真核生物蛋白質(zhì)。
據(jù)報導(dǎo)，已將許多化學(xué)試劑和蛋白酶用于裂解融合蛋白質(zhì)上的許多氨基酸位點(diǎn)。如使用溴化氰在蛋氨酸處有效并選擇性地切斷融合蛋白質(zhì)(Savige等，MethodsinEnzymology，Hirs和Timashelff編，AcademicPress，NewYork，47459-469，1977;Nagai等，Nature，309810-812，1984;Szoka等，DNA，511-20，1986;Haffey等，DNA，6565-571，1987)。
本發(fā)明包括了血纖維蛋白原-受體拮抗物多肽，其特征在于能夠抑制血纖維蛋白原-血小板結(jié)合并具有下列結(jié)構(gòu)通式X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y(Ⅰ)其中X是H或至少一個氨基酸;Y是OH或至少一個氨基酸;且R無論是相同的或不同的，均是任何一種氨基酸。
式Ⅰ中的多肽包括了式Ⅰa的多肽H2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H(Ⅰa)其中Ch代表至少一個氨基酸;Cx代表至少一個氨基酸;且R無論是相同的或不同的，均代表一種氨基酸。
已從各種毒蛇如Trimeresurusgramineus、EchisCarinatus、Agkistrodonpiscivorus、Bitisarietans反Eristocophismacmahonii的毒液中純化了本發(fā)明的多肽。這些多肽可用于抑制血纖維蛋白原與人血小板結(jié)合并抑制血纖維蛋白原誘導(dǎo)的人血小板的聚集作用。
可按下述純化方法由蛇毒液中純化這些多肽。這些多肽均富含半胱氨酸，并含有共同順序-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-，其中R不論相同或不同，均代表任何一種氨基酸。
雖然本申請人不希望被束縛于與結(jié)合機(jī)理有關(guān)任何具體理論問題上，但申請人相信半胱氨酸的定位在決定多肽的三維空間構(gòu)象、剛性程度及結(jié)合特異性上起著重要作用。
本發(fā)明還包括編碼下列結(jié)構(gòu)通式之血小板聚集抑制劑的基因或簡并等同物X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-Cys-Y其中X是H或至少一個氨基酸，Y是OH或至少一個氨基酸;且R是任何一個相同的或不同的氨基酸。
本發(fā)明的優(yōu)選基因編碼經(jīng)修飾的小蝰蛇毒素(echistatin)。小蝰蛇毒素被限定為Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr天然蛋白質(zhì)第28位上的蛋氨酸被重組小蝰蛇毒素中的亮氨酸取代。合成基因是使用表達(dá)載體pJC264在大腸桿菌(MB-5385，ATCC貯存登記號為67873，寄存于AmericanTypeCultureCollection，12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852U.S.A.)，其中載體pJC264是將大腸桿菌CheB和CheY基因復(fù)合物的某些部分插入質(zhì)粒pUC13中構(gòu)建的(1988年11月5日提交的145，800號專利申請)。菌株微生物已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定寄存，一旦授予專利后公眾即可不受限制地獲得該已貯存的微生物。通過在表達(dá)載體中與大腸桿菌CheY基因融合而達(dá)到r-leu28-小蝰蛇毒素基團(tuán)的高水平表達(dá)。用溴化氰在插入到CheY蛋白和小蝰蛇毒素之間的蛋氨酸處裂解融合蛋白，釋放出重組leu28-小蝰蛇毒素，用反相HPLC法純化為均一性并使之重新折迭。重新折迭的r-leu28-小蝰蛇毒素在抑制血小板聚集作用上與天然小蝰蛇毒素沒有區(qū)別，這一點(diǎn)提示28位上的蛋氨酸對于這種血小板聚集抑制劑的生物學(xué)活性并不是必不可少的。
本發(fā)明還包括借助本發(fā)明的蛋白質(zhì)發(fā)揮抑制血小板之凝集作用的組合物，以及用于生產(chǎn)本發(fā)明之重組蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。
本發(fā)明還包括式Ⅰ的合成的多肽及其合成方法。
附

圖1-重組leu28-小蝰蛇毒素的核苷酸及氨基酸順序用實(shí)線標(biāo)示單個合成的寡聚脫氧核苷酸并在括號內(nèi)給出核苷酸序號。蛋白順序之N末端第一個氨基酸-蛋氨酸為溴化氰裂解位點(diǎn)。星號標(biāo)示蛋白質(zhì)C末端的終止密碼子。EcoRI位點(diǎn)位于向表達(dá)載體內(nèi)插入的5′和3′端。
附圖2-pJC264表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)下文中將詳細(xì)討論pJC264表達(dá)載體的構(gòu)建及r-leu 28-小蝰蛇毒素基團(tuán)向載體內(nèi)的插入問題。A.pJC264的結(jié)構(gòu)。箭頭標(biāo)示得自pUC13的順序。pUC13中的大腸桿菌lac啟動子-操縱子位于CheB基因的前面并用箭頭指示轉(zhuǎn)錄的方向。CheB基因(450bp)和CheY基因(263bp)分別用雙線和陰影框標(biāo)示。其中顯示了向其中插入r-leu28-小蝰蛇毒素基因的EcoRI位點(diǎn)。B.Che Y PstI位點(diǎn)和EcoRI克隆位點(diǎn)之間的DNA順序，顯示了被編碼的氨基酸。
附圖3-細(xì)菌產(chǎn)生之重組leu28-小蝰蛇毒素融合蛋白的SDS-PAGE分析使含有pJC264-小蝰蛇毒素表達(dá)載體的大腸桿菌JM109生長于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到OD260讀數(shù)為0.2時，向培養(yǎng)基內(nèi)加入IPTG(終濃度為1mM)以開始誘導(dǎo)表達(dá)。于誘導(dǎo)后不同時間取培養(yǎng)物的等分樣品在Eppendorf離心機(jī)內(nèi)離心。將細(xì)胞沉淀團(tuán)塊懸浮于含有50mMTris-HCI(pH6.8)、0.2%SDS、75mM二硫蘇糖醇、10%甘油和0.05%溴酚蘭的SDSPAGE樣品緩沖液中。樣品于100℃下加熱15分鐘并在Eppendorf離心機(jī)中離心，然后加到14%SDS聚丙烯酰胺梯度凝膠上。在凝膠上分析相當(dāng)于100μl飽和培養(yǎng)物(OD600＝1.8)的溶胞產(chǎn)物。用考馬斯亮蘭染色法檢測蛋白質(zhì)。泳道F-J分別誘導(dǎo)了0、2、4、6和16小時之培養(yǎng)物的溶胞產(chǎn)物;泳道E經(jīng)超聲處理的細(xì)胞團(tuán)塊150μl，得自誘導(dǎo)16小時后的培養(yǎng)物，泳道D得自100μl用缺少r-leu28-小蝰蛇毒素基因?qū)φ誴JC264表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞飽和培養(yǎng)物的溶胞產(chǎn)物;泳道B8μg天然小蝰蛇毒素;泳道C8μg純化的重組leu28-小蝰蛇毒素;泳道APharmacia低分子量標(biāo)志物(圖中示出了分子量);泳道KBio-Rad低分子量標(biāo)準(zhǔn)品，從上到下分子量分別相當(dāng)于92.5、66.2、45.0、31.0、21.0和14.4KDa。
附圖4-純化重組-leu28-小蝰蛇毒素中記錄的HPLC圖形并與天然小蝰毒素相比較下文對發(fā)明的細(xì)節(jié)描述中述及純化和HPLC條件。A還原的溴化氰裂解混合物;B在用于溴化氰裂解混合物的同樣條件下還原的天然小蝰蛇毒素;C得自A的純化之重組-leu28-小蝰蛇毒素的復(fù)性混合物;D天然小蝰蛇毒素。圖A和B中箭頭分別指示還原的重組-leu-28-小蝰蛇毒素和天然小蝰蛇毒素。圖C和D中箭頭分別指示復(fù)性重組-leu28-小蝰蛇毒素和天然小蝰蛇毒素的位置。
附圖5-重組體(r-leu28-echistatir)和天然(n-echistatin)小蝰蛇毒素對血小板聚集作用的抑制在發(fā)明的細(xì)節(jié)描述部分說明了血小板聚集作用的檢測條件。A存在和不存在1.5μM重組體-leu28-小蝰蛇毒素或天然小蝰蛇毒素時監(jiān)測到的聚集作用。注意作為血小板形狀改變之指征的透光率的初始降低未受影響。B存在純化的重組體(leu28)小蝰蛇毒素(方形)和天然小蝰蛇毒素(園形)時加入ADP后測定聚集的初始速率。
本文中所說的天然蛋白質(zhì)是指由相應(yīng)基因產(chǎn)生的全長度蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)是指分離表達(dá)所需蛋白質(zhì)的基因或cDNA并使用該純化的基因或cDNA去構(gòu)建將過量產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的細(xì)胞。文中所說的微觀不均一形式是指一種單一基因產(chǎn)物，即由DNA的單一基因單位產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其在轉(zhuǎn)譯后經(jīng)受結(jié)構(gòu)上的修飾。但這些結(jié)構(gòu)修飾并未導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的明顯改變。修飾作用可發(fā)生在體內(nèi)或分離及純化過程中。體內(nèi)修飾可導(dǎo)致(但不局限于)N末端的?；?、蛋白水解、糖基化或磷酸化等作用。蛋白水解作用可包括外切蛋白水解(exoproteolysis)，其中一個或多個被連續(xù)地酶促裂解產(chǎn)生比原始基因產(chǎn)物有較少氨基酸的微觀不均一產(chǎn)物。蛋白水解作用也可包括蛋白內(nèi)切水解修飾作用(endoproteolyticmodification)，此作用是由于在蛋白質(zhì)順序內(nèi)特定位點(diǎn)裂解肽的作用?？蓪?dǎo)致微觀不均一形式的純化過程中亦能夠發(fā)生類似的修飾作用。純化期間發(fā)生的最常見的修飾作用是蛋白水解作用。
本文所說的重組DNA技術(shù)是指這樣一種技術(shù)即該技術(shù)可使來源于不同細(xì)胞(通常是來源于不同生物體)的遺傳信息(即DNA)片段，在獲得DNA的生物體外端對端地連接，并使該雜交DNA摻入可產(chǎn)生由原始DNA編碼之蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)。分離遺傳信息(即DNA或mRNA)并摻入適當(dāng)?shù)目寺≥d體中，然后用以轉(zhuǎn)導(dǎo)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。
文中所說的克隆載體定義為一種DNA順序，其可允許特定的實(shí)驗(yàn)性外源DNA摻入，同時使結(jié)合的DNA被引入能以穩(wěn)定方式存在并表達(dá)由實(shí)驗(yàn)性DNA支配之蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞內(nèi)。與載體DNA結(jié)合的外來DNA構(gòu)成了由DNA重組技術(shù)得到的重組DNA分子?？寺≥d體可包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒和裝配型質(zhì)粒(cosmids)。本文中將表達(dá)載體限定為轉(zhuǎn)錄已克隆的基因拷貝并在適當(dāng)宿主內(nèi)轉(zhuǎn)譯其mRNA所需要的DNA順序。這類載體可用于在各種細(xì)胞如細(xì)菌、酵母、昆蟲及哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)原核或真核生物基因。亦可在許多病毒系統(tǒng)中表達(dá)蛋白質(zhì)。一個以適當(dāng)方法構(gòu)建的表達(dá)載體應(yīng)包含在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)、選擇標(biāo)志、一定數(shù)目的有用的限制性酶切位點(diǎn)、高拷貝數(shù)和強(qiáng)有力的啟動子。啟動子被定義為指導(dǎo)RNA聚合酶與DNA結(jié)合并啟動RNA合成的DNA順序。強(qiáng)啟動子是可使mRNA以高頻率發(fā)揮功能的啟動子。表達(dá)載體可包括(但不只限于)克隆載體、經(jīng)修飾的克隆載體、特殊設(shè)計(jì)的質(zhì)粒和病毒。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可作為(但不只限于)由限定的天然蛋白質(zhì)的基因編碼的完整蛋白質(zhì)或其片段及亞單位、或完整蛋白質(zhì)的雜合體或其片段及亞單位，條件是它們能夠保留血小板聚集抑制活性。文中所說的完整蛋白質(zhì)是指由適當(dāng)基因產(chǎn)生的全長度多肽。完整蛋白質(zhì)可以是通過純化適當(dāng)?shù)纳叨疽夯蛟谶m當(dāng)表達(dá)載體中表達(dá)相應(yīng)的重組體的基因產(chǎn)物而得到的。蛋白質(zhì)片段或亞單位是指蛋白質(zhì)的任何部分，其含有比完整蛋白質(zhì)較少些的氨基酸并能在使用天然蛋白質(zhì)的同樣條件下保留抑制血小板聚集的能力。雜合蛋白質(zhì)包括(但不僅限于)融合蛋白質(zhì)或表達(dá)存在于表達(dá)載體中的多個基因而得到的蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)被限定為這樣一種蛋白質(zhì)，即其中有限數(shù)目的氨基酸是由被表達(dá)的表達(dá)載體編碼的，且表達(dá)過程可使這些氨基酸連接到特定的血小板聚集抑制性多肽上。由多基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可包括通過肽鍵連接到第二個多肽或肽上的、能增進(jìn)血小板聚集之抑制作用的特定多肽。
已由Trimeresurusgramineus、Echiscarinatus和Agkistrodonpiscivorus、Bitisarietans和Eristocophismacmahonii等毒蛇的毒液中分離了本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽。所有這些多肽都是強(qiáng)有力的血小板聚集抑制劑。
由Echiscarinatus毒液中分離的抑制劑具有下示順序Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr下文中將該抑制劑稱為小蝰蛇毒素(Echistatin)。
由Agkistrodonpiscivorus毒液中分離的抑制劑具有下示順序Val-Gln-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Ala-Glu-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Ile-Lys-Ala-Gly-？？？-Ile-Cys-？？？-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn...
目前還沒有鑒定出某些氨基酸，也不知道第46個氨基酸以后的確切順序。但申請人確信該抑制劑落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并在下文稱之為蝮蛇毒素(Agkistrostatin)。
由Bitisarietans毒液中分離的抑制劑具有下示順序Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-Gln-Asp-Arg-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His該抑制劑在下文中稱之為巨蝰蛇毒素1(Bitistatin)。
由Bitisarietans毒液中分離出的抑制劑還具有下列的另一順序Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-Gln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His.
該抑制劑在下文中被稱為巨蝰蛇毒素2(Bitistatin2)。
由Bitisarietans毒液中分離的抑制劑還具有下示的第3種順序
Val-Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-Gln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His.
該抑制劑在下文中稱之為巨蝰蛇毒素3(Bitistatin3)。
由Eristocophismacmahonii毒素中分離出的抑制劑的順序是Gln-Glu-Glu-Pro-Cys-Ala-Thr-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Arg-Cys-Lys-Phe-Lys-Arg-Ala-Gly-Lys-Val-Cys-Arg-Val-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Trp-Asn-His.
該抑制劑在下文中稱為Eristostatin。
由Bitisarietans毒液中分離的抑制劑還可具有下列順序Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Ile-Leu-Glu-Gln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-...
尚未測知其中第20個氨基酸以后的順序。因?yàn)樵擁樞?下文稱之為巨蝰蛇毒素4〔Bitistatin4〕)與由Bitisarietans毒液中分離的其他多肽結(jié)構(gòu)相似，故確信巨蝰蛇毒素也在式Ⅰ多肽的范圍之內(nèi)。
上文中鑒定的順序均為式Ⅰ所限定之順序內(nèi)的特定實(shí)例，這些順序不應(yīng)看作是對本發(fā)明范圍的限制。借助氨基酸順序測定已對其作出限定。應(yīng)明確的是，其中存在著天然等位基因的變異。這些變異可通過整個順序中氨基酸的差異或所說順序中的缺失、取代、插入、顛換或加入一個或多個氨基酸得以證明。
實(shí)施例1方法材料Echiscarinatus毒液購自MiamiSerpentariumLaboratories，SaltLakeCity，UT。低分子量肽標(biāo)準(zhǔn)品、SephadexG-50和MonoSFPLC柱得自Pharmacia有限公司。Servalytprecote等電聚焦凝膠購自ServaFineBiochemicals有限公司，等電聚集標(biāo)志蛋白購自BDHChemicals有限公司。C18HPLC則是Vydac公司的產(chǎn)品。
血小板的制備由新西蘭白兔體內(nèi)收集兔全血并以200g離心10分鐘。在腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase，20μg/ml)和PGE1(5ng/ml)存在下，將富含血小板的上清液以800g離心15分鐘。將血小板重新懸浮在10ml洗滌緩沖液(138mM NaCl、2.9mM KCl、0.31mM Na2HPO4、1mM MgCl2、5mM HEPES，pH6.5、5mM葡萄糖、0.1%NaHCO3、1mM EGTA和0.35%牛血清白蛋白)中。加入腺苷三磷酸雙磷酸酶達(dá)終濃度20μg/ml。將已懸浮的血小板于800g離心15分鐘，然后在相同緩沖液中作第二次洗滌。再將洗過的血小板懸浮在不含EGTA的洗滌緩沖液中，濃度為2-5×108細(xì)胞/ml。
血小板聚集試驗(yàn)于37℃下用細(xì)胞聚集測定儀檢測血小板聚集作用。反應(yīng)混合物中含有洗過的血小板(2-5×108細(xì)胞/ml)、血纖維蛋白原(100μg/ml)、Ca2+(1mM)、ADP(10μM)、腎上腺素(2μg/ml)以及待測的血小板聚集抑制劑。在加入其他成分之后，再加入ADP和腎上腺素以引發(fā)聚集作用。反應(yīng)至少應(yīng)進(jìn)行2分鐘。以沒有抑制劑時觀察到的聚集作用的百分?jǐn)?shù)來表示抑制聚集的程度。
小蝰蛇毒素的提純用兔血小板聚集檢測法監(jiān)測純化過程中的活性。將凍干的Echiscarinatus毒液(1g)溶解在12ml含有20mMDTT的10mM碳酸氫銨(pH7.7)中。室溫放置15分鐘后，以45，000g離心45分鐘。棄去沉淀物，將上清液加于平衡過的2.5×125cmSephadexG-50柱上并用10mMMES(pH5.3)4℃洗脫。合并含有血小板聚集抑制活性的部分并于真空下濃縮之。在SephadexG-15柱上脫鹽后，將10-13mg蛋白質(zhì)裝添于已用10mMMES(pH5.3)平衡過的MonoSFPLC柱上。于4℃下用0至0.3MNaCl至10mMMES(pH5.3)的線性梯度分級分離結(jié)合的蛋白質(zhì)。洗脫流速為0.6ml/分。在大約0.17MNaCl時有一呈現(xiàn)抑制活性的單一峰。將合并的活性洗脫物直接加于已用0.1%(V/V)三氟乙酸(在水中)平衡過的C18反相HPLC柱上。室溫下用溶于0.1%TFA水溶液中的多相乙腈梯度洗柱，流速為0.7ml/分。乙腈濃度為17%時洗脫的含抑制活性部分為單一峰。真空離心除去揮發(fā)性物質(zhì)，然后冷凍干燥。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚集、反相高效液相層析及N末端順序測定，判定所得蛋白質(zhì)是均質(zhì)的。由1g原料中制得2.2mg我們稱之為小蝰蛇毒素(Echistatin)純化蛋白質(zhì)。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳我們使用了改良的Laemmli系統(tǒng)(Nature，227680-685，1970，已列為本文參照文獻(xiàn))。堆集和分離凝膠1.5mm分別含80%和20%聚丙烯酰胺。向分離凝膠內(nèi)加入尿素(8M)。使凝膠在85伏電壓下電泳1.5小時，然后于90伏下電泳17小時。經(jīng)考馬斯亮蘭R-250染色檢出蛋白質(zhì)。
等電聚集使用ServalytPrecote等電聚焦凝膠。樣品在LKBUltraphore裝置中以1W的恒定功率電泳。凝膠用Serva蘭W染料染色。
經(jīng)還原并羧甲基化的小蝰蛇毒素在0.28MTris和6.7M鹽酸胍存在下，用20mMDTT將小蝰蛇毒素(0.75mg蛋白質(zhì))室溫下還原1小時(反應(yīng)體積為0.6ml)。然后加入碘乙酸(0.06ml)達(dá)到終濃度0.136M，室溫下使烷基化反應(yīng)進(jìn)行20分鐘。用C18反相HPLC法由試劑中分離出經(jīng)過還原并羧甲基化的小蝰蛇毒素。
小蝰蛇毒素的胰凝乳蛋白酶裂解以底物對蛋白酶40∶1(W/W)的比例用胰凝乳蛋白酶消化小蝰蛇毒素。在0.2M碳酸氫銨(pH7.8)中使蛋白水解反應(yīng)于37℃進(jìn)行4小時。然后冷凍干燥反應(yīng)混合物，用反相HPLC法分離胰凝乳蛋白酶裂解肽。
氨基酸順序測定使用廠商提供的順序分析儀操作程序和試劑，在AppliedBiosystems470A順序分析儀中，對純化的小蝰蛇毒素和經(jīng)選擇的胰凝乳蛋白酶水解片段進(jìn)行自動的蛋白質(zhì)順序分析。借助線上(on-line)HPLC系統(tǒng)鑒定其中釋放的氨基酸衍生物。
蛋白質(zhì)測定依照Lowry等人(J.ofBiolChem.193265-275，1951，該文獻(xiàn)列為參考文獻(xiàn))的方法，使用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品測定蛋白質(zhì)含量。
結(jié)果提純通過三個層析步驟將凍干的Echiscarinatus毒液中的可溶性部分純化為均一物質(zhì)。由于毒液粗品中存在血小板聚集刺激活性，故不能可靠地測得該部分中的抑制劑。但在SephadexG-50柱上凝膠過濾后，則可觀察到單一的抑制活性峰?？蛇M(jìn)一步在MonoS柱上進(jìn)行陽離子交換FPLC層析，最后經(jīng)C18反相HPLC純化該活性部分。
1克毒液凍干品可制得2.2mg純化的小蝰蛇毒素。該物質(zhì)在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(在8M尿素存在下)及等電聚焦電泳中均出現(xiàn)單一帶。如用反相HPLC法再次層析，則產(chǎn)生與血小板聚集抑制活性物完全相符的單一對稱吸收峰。測定天然蛋白質(zhì)或經(jīng)還原并羧甲基化的蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可進(jìn)一步證實(shí)小蝰蛇毒素的均質(zhì)性。在進(jìn)行第一次氨基酸順序儀分析時觀察到的僅存的氨基酸殘基是谷氨酸。
分子量和等電點(diǎn)在8M尿素存在下進(jìn)行20%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，可見還原的小蝰蛇毒素的表觀分子量為5，800道爾頓。這與根據(jù)氨基酸順序計(jì)算的分子量相似(見下述)。在非還原條件下，蛋白質(zhì)遷移速度稍慢，相當(dāng)于表觀分子量為7，000道爾頓。令人驚奇的是，當(dāng)用羥乙基二硫化物處理天然小蝰蛇毒素時，表觀分子量只有大約4，000道爾頓。在經(jīng)羥乙基二硫化物處理的小蝰蛇毒素中見有一小帶，其可能是由不完全的衍生化作用產(chǎn)生的。
天然的和經(jīng)二硫化物處理的小蝰蛇毒素均顯示等電點(diǎn)為8.3。用二硫蘇糖醇處理后，除等電點(diǎn)為8.3的主帶外，還測出一個等電點(diǎn)7.5的小帶。
氨基酸組成還原的、羧甲基化的蛋白質(zhì)經(jīng)20小時水解之后，得到如表1所示的小蝰蛇毒素氨基酸組成。將經(jīng)這一分析獲得的組成與根據(jù)順序推算的組成相比較(見下述)。用這兩種方法得到數(shù)值大多都十分接近。經(jīng)氨基酸組成分析測得的半胱氨酸殘基含量(6.7)要比根據(jù)順序計(jì)算的含量(8)低。這可能是由于小蝰蛇毒素的不完全羧甲基化所致。
表1水解后測定的小蝰蛇毒素氨基酸組成與根據(jù)順序計(jì)算的結(jié)果的比較
注1.該值包括天冬酰胺2.該值包括谷氨酸酰胺小蝰蛇毒素對體外血小板聚集作用的影響血小板聚集研究結(jié)果表明，在抑制0.1mg/ml血纖維蛋白原存在下由ADP誘導(dǎo)的人凝膠過濾的血小板聚集作用上，Echistatin比trigramin的效力更強(qiáng)(IC50＝30nM對150nm)。
劑量為30-300nM的小蝰蛇毒素可抑制由ADP膠原、血小板激活因子或腎上腺素誘導(dǎo)的人血小板聚集作用。
富含人血小板的血漿從正常志愿者體內(nèi)靜脈穿刺抽取血液，加入0.1倍體積的3.8%檸檬酸鈉中。以400g離心12分鐘，得到富含血小板血漿(PRP)。加入ADP膠原、血小板激活因子或腎上腺素使之發(fā)生聚集，并用Sienco聚集檢測儀進(jìn)行檢測。
經(jīng)凝膠過濾的人血小板靜脈穿刺由正常志愿者體內(nèi)抽取血液注入0.1體積的酸-檸檬酸鹽-葡萄糖(85mM檸檬酸鈉、64mM檸檬酸、110mM葡萄糖)中。以400g離心12分鐘制得富含血小板血漿。加入PGE1(5μg/ml)并以800g離心12分鐘收集血小板。將血小板沉淀餅再懸浮于人血小板緩沖液(140mM NaCl、7.9mM KCl、3.2mM Na2HPO4、6mM HEPES、2%牛血清白蛋白、0.1%右旋糖、pH7.2)中，并用預(yù)先在人血小板緩沖液中平衡過的Sepharose 2B過濾之。計(jì)數(shù)血小板并用人血小板緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)至108個/ml。
氨基酸順序?qū)€原的、羧甲基化的蛋白質(zhì)進(jìn)行自動Edman降解，測得小蝰蛇毒素的氨基酸順序。如上所示，該蛋白質(zhì)有49個氨基酸，其N末端為谷氨酸，C末端為蘇氨酸。其中包含8個半胱氨殘基，即占小蝰蛇毒素中總氨基酸數(shù)的16%以上。兩次重復(fù)測定，均獲得同樣結(jié)果。當(dāng)測定天然小蝰蛇毒素的順序時，在預(yù)期有半胱氨酸殘基的順序分析儀工作周期內(nèi)未見有PTH-氨基酸峰，從而進(jìn)一步證實(shí)了這些殘基的分配。尚不清楚這些半胱氨酸殘基的二硫化物狀態(tài)。
對分離自還原并羧甲基片之蛋白質(zhì)的胰凝乳蛋白酶解肽進(jìn)行分析，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述順序測定的結(jié)果。
表Ⅱ小蝰蛇毒素胰凝乳蛋白酶解肽的氨基酸組成(括號內(nèi)數(shù)值為根據(jù)順序確定的氨基酸數(shù))C1C2C3C4C3+C4Cys(CM)2.6(4)0.7(1)1.3(3)1.5(3)Asx1.3(1)2.7(3)2.9(3)Thr1.0(1)1.0(1)1.0(1)1.4(2)Ser1.1(1)Glu2.0(2)1.1(1)Gly1.2(1)1.4(1)1.9(1)1.2(1)2.2(2)Ala1.0(1)0.8(1)Ile0.6(1)Leu0.9(1)His1.2(1)1.3(1)Phe0.9(1)Lys1.1(1)1.9(2)1.7(1)1.0(1)2.2(2)Arg1.2(1)0.7(1)1.1(1)1.1(1)Pro1.3(1)1.4(2)1.0(1)2.5(3)
小蝰蛇毒素在殘基24-26處含有順序Arg-Gly-Asp，其為某些可與血小板表面上糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物結(jié)合之蛋白質(zhì)的共有順序。該順序是血纖維蛋白原分子上推定之血小板結(jié)合位點(diǎn)的一部分。
在8M尿素存在下進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時，小蝰蛇毒素表現(xiàn)有不尋常的行為。具有表觀分子量7，000道爾頓的天然蛋白質(zhì)遷移可與根據(jù)順序分析測得分子量為5，400道爾頓者相比。在非還原條件下，具有鏈內(nèi)二硫鍵的蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的量一般比預(yù)期的量少些，而還原前SDS結(jié)合可增加到見于缺少鏈內(nèi)二硫鍵之蛋白質(zhì)的水平(Pitt-Rivers等，Biochem.J.，109825-830，1968)。因此，在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳期間還原之小蝰蛇毒素的遷移率增加，說明這種蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象中包含一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵。
室溫下用80mM二硫蘇糖醇處理小蝰蛇毒素20分鐘，即可完全破壞其對血小板聚集作用的抑制活性。在相似條件下，用80mM羥乙基二硫化物處理，可使抑制活性丟失50%。與SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳研究的結(jié)果一樣，這些結(jié)果也說明一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵在保留小蝰蛇毒素之抑制活性必需的構(gòu)象中起著重要作用。
實(shí)施例2使用實(shí)施例1中所述的蛋白質(zhì)純化和檢測方法，分離和鑒定存在于Agkistrodonpiscivorus毒液中的血小板聚集抑制物。該蛋白質(zhì)(其具有上面給出的氨基酸順序)表現(xiàn)有血小板聚集抑制物的特征。
實(shí)施例3使用實(shí)施例1中所述的蛋白質(zhì)提純和檢測方法，分離和鑒定存在于Bitisarietans毒液中的血小板聚集抑制物。該蛋白質(zhì)(其具有如上鑒定的氨基酸順序)表現(xiàn)了血小板聚集抑制物的特征。
實(shí)施例4使用實(shí)施例1中所述的蛋白質(zhì)提純和檢測方法，分離并鑒定存在于Bitisarietans毒液中的第二種血小板聚集抑制物。該蛋白質(zhì)(其具有如上鑒定的氨基酸順序)表現(xiàn)了血小板聚集抑制物的特征。
實(shí)施例5使用實(shí)施例1中所述的蛋白質(zhì)提純和檢測方法，分離并鑒定存在于Bitisarietans毒液中的第三種血小板聚集抑制物。該蛋白質(zhì)(其具有如上鑒定的氨基酸順序)表現(xiàn)了血小板聚集抑制物的特征。
實(shí)施例6使用實(shí)施例1中所述的蛋白質(zhì)提純和檢測方法，分離并鑒定存在于Eristocophismacmahonii毒液中的血小板聚集抑制物。該蛋白(其具有如上鑒定的氨基酸順序)表現(xiàn)有血小板聚集抑制物的特征。
純化具有Ⅰ式之順序的各種多肽，使之成為本發(fā)明的化學(xué)均一物質(zhì)，然后即可測定分子的氨基酸順序?；谑舰裰兴镜陌被犴樞?，人們便可以制備相應(yīng)于已公開之氨基酸順序的合成基因，并借助適當(dāng)?shù)目寺≥d體將該基因?qū)脒m當(dāng)宿主內(nèi)?；蛘?，可從產(chǎn)生毒液的細(xì)胞中得到天然基因，然后重組并克隆之，以制得純的多肽。因此，本發(fā)明的范圍不只限于本文中公開的以層析方法分離的多肽(或落入式Ⅰ所示順序內(nèi)的多肽)，而且還包括用遺傳工程技術(shù)制備的這些多肽。
實(shí)施例7DNA和質(zhì)粒構(gòu)建及對重組-leu28-小蝰蛇毒素的蛋白質(zhì)表達(dá)所有酶和DNA分子量標(biāo)志物均得自NewEnglandBiolabs。二脫氧DNA順序測定試劑盒購自UnitedStatesBiochemicalCorporationInc.感受態(tài)大腸桿菌Jm109購自Stratagene公司。所有其他試劑都是分析純或電泳純的。
使用氨基磷酸甲酯，在AppliedBiosystems380BDNA合成儀中合成所有的寡脫氧核苷酸。用濃氨水去保護(hù)后，將寡脫氧核苷酸加于PharmaciaNAP-10凝膠過濾柱上脫鹽。
除了兩個在兩條鏈的5′端有突出部分的寡脫氧核苷酸外，所有寡脫氧核苷酸均用ATP和T4多核苷酸激酶處理使之磷酸化。將激酶活化的互補(bǔ)寡脫氧核苷酸加熱到95℃，然后與經(jīng)緩慢冷卻到室溫以退火。在總體積為130μl，含有各0.5nmol雙股片段(duplex)、50mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、20mM二硫蘇糖醇、1mM ATP、50μg/ml牛血清白蛋白和4，000單位T4連接酶的反應(yīng)混合物中，于14℃下使3個雙股片段連接15小時。用10%固有聚丙烯酰胺凝膠電泳法分級分離連接混合物。由聚丙烯酰胺凝膠中切掉含leu 28-小蝰蛇毒素基因部分并進(jìn)行電洗脫。用激酶活化被洗脫的leu 28-小蝰蛇毒素基因、用苯酚/氯仿抽提、用乙醇沉淀，然后插入表達(dá)載體中。
pJC264表達(dá)載體的構(gòu)建將含有3′-436bpCheB基因和5′-263bpCheY基因(Matsumura等，J.Bact.16036-41，1984)的pLCl-28(得自B.Bachmann，E.ColiGeneticStockCenter)中的714bpHindⅢ-PstⅠ片段克隆到pUC13HindⅢ和pstⅠ位點(diǎn)中。為了除去pUC13之多接頭順序中靠近CheY基因的唯一EcoRⅠ位點(diǎn)，而刪除pstⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)間的多接頭順序。所得表達(dá)載體pJC264含有可使有用基因與CheY基因相融合的唯一EcoRⅠ位點(diǎn)(圖2)。為此目的，通過用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段充填并與合成的BamHI接頭連接，而使連接pUC13和CheB基因的HindⅢ位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)锽amHI位點(diǎn)。
在下述條件下，使三分之一按上述方法制得的合成之leu-28-小蝰蛇毒素基因與0.1μg FcoRI切割的pJC264相連接，從而使合成的重組體leu 28-小蝰蛇毒素基因(圖1)插入到pJC264的FcoRI位點(diǎn)中在總體積為20μl含50mM Tris-HCl，pH7.8、10mM MgCl2、20mM二硫蘇糖醇、1mM ATP、50μg/ml牛血清白蛋白和800單位T4DNA連接酶的反應(yīng)混合物中，于14℃下連接15小時。
受體細(xì)菌的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用三分之一含有已插入之r-leu28-小蝰蛇毒素基因的pJC264表達(dá)載體(7μl)轉(zhuǎn)化50ml感受態(tài)JM109細(xì)胞。經(jīng)限制性酶切分析選擇含有r-leu28-小蝰蛇毒素基因的克隆。根據(jù)二脫氧順序分析的結(jié)果驗(yàn)證小蝰蛇毒素之編碼順序的存在。
細(xì)胞生長和融合蛋白沉淀物的制備用過夜種菌培養(yǎng)物接種培養(yǎng)物(1% V/V)，并使之生長于含100μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到OD600讀數(shù)為0.2-0.3時加入IPTG至終濃度為1mM。繼續(xù)培養(yǎng)10小時后離心收集細(xì)胞。將得自3，000ml培養(yǎng)物的細(xì)胞團(tuán)塊懸浮在水中至終體積50ml，并使用帶有大管頭的300型Fisher Sonic Dismembrator以最大功率4℃下超聲處理10分鐘。將超聲處理后的混合物以20，000g離心15分鐘，再將細(xì)胞團(tuán)塊重新懸浮于8ml水中并在含有50%蔗糖的15mM Tris-HCl(pH7.4)和0.15M NaCl上展層。在SW28 Beckman轉(zhuǎn)子中以13，000rpm6℃離心30分鐘后，將含有不溶性CheY-Leu28-小蝰蛇毒素融合蛋白的沉淀物重新懸浮于6ml水中。
融合蛋白的裂解在13ml總反應(yīng)體積中，用溶于70%甲酸內(nèi)的60mM溴化氰裂解得自1000ml培養(yǎng)物的含融合蛋白的沉淀物。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行15小時。經(jīng)廣泛透析除去試劑并凍干。
重組-leu28-小蝰蛇毒素的提純與重新折迭首先在60℃下用8M鹽酸胍使裂解的融合蛋白變性(5分鐘)，然后在0.35MTris-堿和6M鹽酸胍存在下，用0.15M二硫蘇糖醇使之于室溫下還原(10分鐘)。在0.1%三氟乙酸存在下用0-65%乙腈經(jīng)C18反相HPLC純化還原的leu28-小蝰蛇毒素。使HPLC純化的r-leu28-小蝰蛇毒素(蛋白濃度為0.2mg/ml)在0.1M乙酸銨中氧化重新折迭。重新折迭反應(yīng)在室溫下進(jìn)行72小時，期間約每12小時渦動混合一次。
血小板聚集試驗(yàn)根據(jù)透光率的增加來檢測血小板聚集作用。簡單地說，將r-leu28-小蝰蛇毒素加至含有凝膠過濾之人血小板(2×108)細(xì)胞/ml)、血纖維蛋白原(100μg/ml)和Ca++(1mM)的反應(yīng)混合物中。在加入其他成分后1分鐘，加入ADP(終濃度為10μM)以引發(fā)血小板聚集。血小板聚集的速率或程度，以不加小蝰蛇毒素情況下測得之最大透光率的百分?jǐn)?shù)表示。
生產(chǎn)重組leu28-小蝰蛇毒素的流程大腸桿菌(其中包含質(zhì)粒pJC264-小蝰蛇毒素)誘導(dǎo)W/IPTG細(xì)胞收獲細(xì)胞溶解離心融合蛋白沉淀物溴化氰CNBr裂解的融合蛋白沉淀物變性(鹽酸胍)還原(二硫蘇糖醇)充分還原并裂解的融合蛋白沉淀物C18反相HPLC
充分還原的r-leu28-小蝰蛇毒素再次氧化/重新折迭C18反相HPLC純化的、氧化的r-leu28-小蝰蛇毒素合成基因的設(shè)計(jì)和構(gòu)建天然小蝰蛇毒素是有49個氨基酸殘基的單鏈多肽，等電點(diǎn)為8.3。設(shè)計(jì)一合成的r-leu28-小蝰蛇毒素基因并與大腸桿菌cheY基因融合。由其他蛇毒液來源分離之血小板聚集抑制劑的一級結(jié)構(gòu)揭示蛋氨酸28并不是該族抑制物中被保留的氨基酸(Huang等，J.Biol.Chem.26216157-16163，1987)。因此，小蝰蛇毒素的蛋氨酸28被亮氨酸取代，且蛋氨酸插入cheY蛋白和重組-leu28-小喹蛇毒素之間，而造成一個溴化氰裂解位點(diǎn)(圖1)。在側(cè)翼端設(shè)計(jì)兩個EcoRI粘性末端以與表達(dá)載體相接合。緊接著3′側(cè)翼EcoRI位點(diǎn)插入一終止密碼子。由三個在接合位點(diǎn)處含KpnI和AvaI限制性酶切點(diǎn)的雙股片段組裝成合成的r-leu28-小蝰蛇毒素基因。除有目的地產(chǎn)生的限制性位點(diǎn)外，結(jié)構(gòu)基因中均使用優(yōu)選的大腸桿菌密碼子。可經(jīng)限制性酶切和DNA順序分析進(jìn)一步檢證構(gòu)建好的基因。
表達(dá)載體的構(gòu)建為在大腸桿菌中表達(dá)r-leu28-小蝰蛇毒素，使用了表達(dá)載體pJC264。該載體(圖2)含有編碼大腸桿菌cheY蛋白之氨基末端88個氨基酸的基因，且前已證明該基因可在大腸桿菌中獲得大量而穩(wěn)定的表達(dá)(Matsumura等，J.Bact.16036-41，1984)。cheY基因在該載體中的表達(dá)須受來自pUC13之大腸桿菌lac啟動子-操縱子的控制(Messing，MethodsinEnzymology，Wuetal.eds，AcademicPress，NewYork，10120-78，1983)。pJC264中CheY基因之后，特有的pstI和EcoRI位點(diǎn)有利于克隆新的開放讀碼及其作為cheY融合蛋白的可誘導(dǎo)的表達(dá)。將合成的r-leu28-小蝰蛇毒素基因插入pJC264的EcoRI位點(diǎn)中，圖2中顯示了chY-小蝰蛇毒素表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。
該載體與現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)相比，其具有幾個優(yōu)點(diǎn)。cheY融合常常可得以高水平表達(dá)(詳見下文及Bailey等，J.Indust.Micro.247-52，1987)。該載體衍生于高拷貝數(shù)質(zhì)粒pUC13(Messing，MethodsinEnzymology，Wuetal.eds，Academicpress，NewYork，10120-78，1983)，并且其有效地復(fù)制可能有利于所觀察到的高表達(dá)水平。cheY融合蛋白常常是作為不溶性包涵體被發(fā)現(xiàn)的。這種不溶性可在融合蛋白質(zhì)的純化過程中得以利用。蛋白質(zhì)的不溶性也可以阻止其被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解。因?yàn)閏heY部分較小，所以有用蛋白質(zhì)的質(zhì)量比例要比融合到大的、最常用的β-半乳糖苷酶上所達(dá)到的比例要高。最后，由于cheY蛋白中沒有半胱氨酸殘基，從而避開了融合蛋白中形成不正確二硫鍵的潛在問題。
重組-leu28-小蝰蛇毒素的表達(dá)按前述方法用IPTG誘導(dǎo)重組-leu28-小蝰蛇毒素在大腸桿菌JM109中的表達(dá)。誘導(dǎo)后在不同時間用14%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析表達(dá)產(chǎn)物。誘導(dǎo)2小時后，在總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中檢測到有cheY-小蝰蛇毒素融合蛋白之預(yù)期分子量(14.5KDa)的多肽(圖3)。誘導(dǎo)6小時后，該蛋白質(zhì)的積聚量達(dá)到最高水平，至少占總細(xì)胞蛋白的20%。細(xì)胞經(jīng)超聲處理后，所表達(dá)的蛋白質(zhì)是不溶的，這說明表達(dá)期間形成了包涵體。用溴化氰裂解超聲處理的細(xì)胞沉淀物，以分離重組-leu28-小蝰蛇毒素。
重組-leu28-小蝰蛇毒素的純化和復(fù)性純化前，在6M鹽酸胍存在下用過量二硫蘇糖醇還原溴化氰裂解的蛋白質(zhì)。用反相HPLC法分離還原的蛋白質(zhì)，層析結(jié)果顯示出一滯留時間與還原的天然小蝰蛇毒素相似的峰(圖4A、B)。對該峰的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸順序分析，顯示它含有純度大于90%的重組-leu28-小蝰蛇毒素。因?yàn)镠PLC期間還原的小蝰蛇毒素是在0.1%三氟乙酸(pH2左右)中，所以預(yù)計(jì)重組-leu28小蝰蛇毒素內(nèi)硫醇-二硫化物交換反應(yīng)是很慢的。因此，可在0.1M乙酸銨存在下使凍干的小蝰蛇毒素重新折迭，而不必進(jìn)一步復(fù)性和還原。有人提出，向復(fù)性溶液內(nèi)加入硫醇/二硫化物混合物可有利于無活性蛋白質(zhì)的復(fù)性(Tam等，Nature，309376-378，1984)。我們已用0.5mM二硫蘇糖醇和1mM氧化態(tài)二硫蘇糖醇在6M鹽酸胍存在下復(fù)性了重組-leu28-小蝰蛇毒素。但在此條件下重新折迭的小蝰蛇毒素的產(chǎn)率并沒有增加。正確折迭的小蝰蛇毒素是通過反相HPLC法由未折迭的產(chǎn)物中分離的。圖4C中顯示的HPLC圖形表明，在給定的條件下有30%以上還原的小蝰蛇毒素是正確地折迭的。估計(jì)用此純化方法得到的正確折迭的純小蝰蛇毒素的量約為每升細(xì)胞培養(yǎng)物1.5mg。用比分離天然小蝰蛇毒素時稍高濃度的乙腈由C18柱上洗脫重組-leu28-小蝰蛇毒素(圖4C和4D)。這可能是重組-leu28-小蝰蛇毒素中亮氨酸取代了天然小蝰蛇毒素中蛋氨酸28的結(jié)果。用自動Edman降解法測定重組-leu28-小蝰蛇毒素的N末端氨基酸順序。發(fā)現(xiàn)N末端順序中多達(dá)32個殘留與天然小蝰蛇毒素相同，只是28位以亮氨酸取代了蛋氨酸。
重組-leu28-小蝰蛇毒素的生物學(xué)活性圖5顯示了重組-leu28-小蝰蛇毒素與天然小蝰蛇毒素之生物學(xué)活性的比較。在人血纖維蛋白原和CaCl2存在下，加入ADP后檢測小蝰蛇毒素對血小板聚集的抑制作用。如天然小蝰蛇毒素一樣，在加入ADP后重組蛋白并不影響透光率的初始減小(圖5A)，這提示抑制物沒有影響血小板的激活作用。根據(jù)聚集的速率和程度，證明重組-leu28-小蝰蛇毒素和天然小蝰蛇毒素均可抑制血小板聚集，并有相同的IC50值(圖5B)。因此，重組-leu28-小蝰蛇毒素在其影響血小板聚集的能力上似乎與天然小蝰蛇毒素完全相同。結(jié)果表明，天然小蝰蛇毒素中28位蛋氨酸的存在對于這種血小板聚集抑制劑的正確折迭和生物學(xué)活性不是必要的。
有可能使用DNA重組技術(shù)，如通過對特定DNA的位點(diǎn)特異性誘變，使單個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、加入或置換，以制備各種衍生多肽。所有這些可產(chǎn)生衍生多肽的等位基因變異和修飾作用，只要保留其基本的、特征性的血小板聚集抑制活性，便都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？梢酝ㄟ^(1)使之具有作為其第一個氨基酸的蛋氨酸(憑借插入到結(jié)構(gòu)基因前面的ATG起始信號密碼子給出)，或(2)當(dāng)?shù)鞍彼嵩诩?xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外被裂解時，仍有其正常的第一個氨基酸，或(3)與其信號多肽或結(jié)合蛋白質(zhì)而不是常規(guī)信號多肽結(jié)合在一起，其中信號多肽或連結(jié)體是可在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外環(huán)境中被裂解的(參見英國專利申請2，007，676A號)，或(4)通過以成熟形式直接表達(dá)，而不必裂解掉任何外加的、多余的多肽等方式來制備該多肽。后一方式在給定宿主可能沒有或不能有效地除去信號肽時特別重要，此時便可設(shè)計(jì)表達(dá)載體以連同信號肽一起表達(dá)蛋白質(zhì)?？傊厥杖绱水a(chǎn)生的以其各種形式存在的血小板聚集抑制劑，并將其純化到適用于治療各種血管病變的純度水平。
合成的結(jié)構(gòu)式Ⅰ的多肽可使用固相合成法，如Merrifield(J.Am.Chem.Soc.，852149，1964)所述的方法制備本發(fā)明的多肽，但也可以使用本領(lǐng)域中已知的等同的化學(xué)合成法，如Houghten(Proc.Natl.Acad.Sci.，825132，1985)所述的合成方法。通過將被保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)到適當(dāng)樹脂上從肽的C末端開始固相合成(如參見1982年1月21日公告的美國專利4，244，946號，其內(nèi)容列為本文參考文獻(xiàn))。美國專利4305872和4，316，891號中給出了這種通用合成方法的實(shí)例。Vale等人(Science2131394-1397，1981年9月)討論了-41殘基多肽及其固相合成法，其中所提到的合成方法更為詳盡的討論則可見于Marke等(J.Am.Chem.Soc.1033178，1981)的文章中。
合成多肽時，將具有其被適當(dāng)保護(hù)之α-氨基基團(tuán)的羧基末端氨基酸偶聯(lián)到氯甲基化的聚苯乙烯樹脂或類似物上。除去α-氨基保護(hù)基團(tuán)(如使用二氯甲烷中的三氟乙酸)之后，可隨時進(jìn)行下一步合成步驟?？墒褂梦墨I(xiàn)中描述的其他標(biāo)準(zhǔn)裂解試劑和條件除去特定的氨基保護(hù)基團(tuán)。
然后分步按預(yù)期次序偶聯(lián)其余的α-氨基和側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸，以得到一個連接到樹脂上的中間體化合物。合成中另一種分別加上各氨基酸的方法是可使某些氨基酸相互偶聯(lián)，然后再加到生長的固相鏈上。如何選擇適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑是本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員熟知的。
化學(xué)合成肽類的共同手段是，用適當(dāng)保護(hù)基在不穩(wěn)定的支鏈基團(tuán)位點(diǎn)上保護(hù)各種氨基酸，直到所說鏈完全組裝好之后再最后除去所說的保護(hù)基團(tuán)。另一個共同點(diǎn)是保護(hù)氨基酸或片段上的α-氨基基團(tuán)，同時該整體在羧基上相互作用，然后通過選擇性除去α-氨基保護(hù)基團(tuán)使繼后的反應(yīng)在該位置上進(jìn)行。因此，作為合成過程中的一個步驟，其共同特點(diǎn)是產(chǎn)生一種中間體化合物，該化合物包含的各個氨基酸殘基均定位于肽鏈的所需順序中，同時這些殘基均具有側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。然后基本上在同一時間除去這些保護(hù)基團(tuán)，以便在純化后得到預(yù)期的產(chǎn)品。
完成所需的氨基酸順序之后，經(jīng)用液態(tài)HF等試劑處理以由樹脂載體上除去中間體肽，所說的試劑不僅可由樹脂上裂解肽，而且可裂解所有保留的支鏈保護(hù)基團(tuán)。用凝膠滲透法，然后用半制備HPLC法純化多肽(參見Rivier等，PeptidesStructureandBiologicalFunction，pp125-128，1979)。完全可以獲得純度達(dá)93%或更高些的產(chǎn)品，并可用于臨床檢驗(yàn)和/或應(yīng)用。實(shí)踐中可用純度為98%的產(chǎn)品，但體外應(yīng)用時，較低純度也是可以接受的。因此，就本發(fā)明的目的來說，基本純的產(chǎn)品，即至少占總肽量50%(重量)的產(chǎn)品是適用的。
以下提供本發(fā)明各種多肽及合成方法的實(shí)例實(shí)施例8丁氧羰基-鄰-芐基蘇氨酸-聚丙烯酰胺〔Boc-Thr(Bzl)O-Pam〕樹脂、丁氧羰基(Boc)保護(hù)的氨基酸及所用在AppliedBiosystems430A(ABI)肽合成儀中合成所需的其他試劑均由制造廠購得。側(cè)鏈保護(hù)的Asp、Glu和His是由Bachem公司提供的。溶劑二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷得自Burdick和Jackson公司。二硫蘇糖醇(DTT)購自BethesdaRes.Labs.公司。二硫赤蘚糖醇(DTET)購自ChemicalDynamic公司，對甲苯酚和對甲苯硫酚購自AldrichChemical公司。
小蝰蛇毒素的合成使用0.5mM(0.69g)Boc-Thr(Bzl)O-Pam樹脂(在0.72mMThr/克樹脂濃度下置換)為原料，用ABI自動肽合成儀以分步法進(jìn)行合成(參見KentandClark-Lewis(1985)，SyntheticPeptidesinBiologyandMedicine，Proc.LabsystemsRes.Symp.，Eds.，Alitaloetal.，Elsevier，Netherlandspp29-57)。使用廠商提供的藥筒引入氨基酸(各2mM)。側(cè)鏈保護(hù)包括Arg(Tos)、Asp(OcHx)Cys(Meb)、Glu(OcHx)、His(Bom)、Lys〔Z(Cl)〕、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Tyr〔Z(Br)〕?！财渲蠺os是對苯磺?；HX是環(huán)己基、Meb是4-甲基芐基、Z(Cl)是2-氯芐氧羰基、Bom是芐氧甲基、Bzl是芐基、Z(Br)是2-溴芐氧羰基。除Arg(Tos)、Asn和His(Bom)外(其在雙偶聯(lián)過程中使用了溶于DMF中的羥基苯并三唑酯)，所有Boc保護(hù)的氨基酸均采用有對稱酐的雙偶聯(lián)(在CH2Cl2中進(jìn)行，然后用DMF進(jìn)行溶劑交換)。為防止三氟乙酸(TFA)去封閉期間出現(xiàn)不期望有的對Cys和Met的酸催化的氧化作用(Draper等，J.Med.Chem.Vol.16，pp1326-1329，1973)，須加入0.1%(W/V)DTE作為清除劑。連接N末端谷氨酸(Glu)后，用TFA除去Boc基團(tuán)，然后干燥得到的肽-樹脂。N末端去封閉的肽-樹脂的終重量為4.15g。
HF裂解和氧化將組合好的肽-樹脂(2.0g)懸浮于HF裝置(Peninusula Labs.有限公司，1B型)內(nèi)的3ml 1∶1(V/V)對-甲苯硫酚/對-甲苯酚混合物中。用機(jī)械真空泵將系統(tǒng)抽成真空，并使用液氮冷卻法冷凝HF(30ml)。0-5℃下攪拌1.5小時后，使用液氮阱(Iiquid nitrogen trap)真空蒸發(fā)反應(yīng)混合物(20-30分鐘)。用乙醚研制殘留物、過濾并用乙醚洗三次。將濾后的殘留物直接移入4升攪拌的稀醋酸(0.4%/H2O)溶液中。攪拌數(shù)分鐘后，用氫氧化銨將混合物的pH調(diào)到8.0。過濾除去樹脂后，將粗制氧化產(chǎn)物在5℃下放置18小時(不攪拌)，然后在室溫(19-20℃)下放置3天。用分析HPLC法監(jiān)測氧化進(jìn)程。純化前用定量Ellman試驗(yàn)(Habeeb，Methoels in Enzymology(1972)，Eds.Hirs and Timasheff，Academic Press，New York，PP457-464)監(jiān)測游離巰基基團(tuán)的消失。這一試驗(yàn)是用1ml經(jīng)過凍干以除去殘留之對位甲苯硫酚的樣品進(jìn)行的。
氧化的小蝰蛇毒素粗品的提純用乙酸(10ml)酸化粗制的氧化溶液(4l)并直接泵到C18硅膠(5×30cm，15m，300A)藥筒(Waters Associates)上。使用制備HPLC柱(Separations Technology有限公司)純化產(chǎn)品。階式梯度(增量100ml)是由可分別相繼地提高流動相濃度的1升溶液產(chǎn)生的。用于洗脫產(chǎn)品的流速為70ml/分。合并并凍干經(jīng)RP-HPLC(Vydac C18，218TP5415)檢測為均一成分(＞95%)的各部分，得到72mg產(chǎn)品。由一個達(dá)到產(chǎn)物峰的峰肩可知半純產(chǎn)品被較小極性的成分所污染。使洗脫物再次通過HPLC柱進(jìn)一步按同樣方法純化產(chǎn)品，得到小蝰蛇毒素(54mg)。按0.25mM原料樹脂計(jì)算，這一重量代表了4%總收率。用分析HPLC法證明產(chǎn)品的均質(zhì)性。同時注入合成產(chǎn)品和天然產(chǎn)品，結(jié)果出現(xiàn)單一峰。通過用6N HCl水解后作氨基酸分析(表3)和自動Edman降解(ABI 470A蛋白質(zhì)順序儀)進(jìn)一步確定蛋白質(zhì)的特征。
表3合成小蝰蛇毒素的氨基酸分析a結(jié)果(括號內(nèi)為理論計(jì)算值)Lys5.00(5)Gly5.03(5)His1.00(1)Ala2.10(2)Arg 3.87(4) Cysd7.67(8)Asp 8.13(8) Metc0.84(1)Thrb2.99(3) Leu 0.98(1)Serb1.04(1) Phe 0.95(1)Glu3.07(3)Tyr1.00(1)Pro4.08(4)Ile+allo-Ile0.99(1)a于100℃用6NHCl水解70小時后;
b校正水解期間分解率;
c未校正;
d完成酸氧化后作為磺基丙氨酸測定的。
觀察到預(yù)檢最大值為1.9%。第一步獲得高產(chǎn)率PTH氨基酸，也證并沒有發(fā)生C末端Glu(谷氨酸)變?yōu)榻构劝彼?Pyro-Glu)的環(huán)化作用。
合成小蝰蛇毒素的還原和重折迭將合成的小蝰蛇毒素(0.5mg)溶解在1ml0.07M乙酸銨(10mMDTT)(pH8.0)中，并用分析HPLC監(jiān)測還原過程。1小時后原料定量地轉(zhuǎn)化為單一的還原產(chǎn)物。使用直徑12mm，截留分子量為1，000的纖維素管系(SpectrumMedicalInd.)，對4升0.07M乙酸銨緩沖液(pH8.0)透析(24小時)還原產(chǎn)物，結(jié)果只產(chǎn)生小蝰蛇毒素。為了證明小蝰蛇毒素在重新氧化之前處于完全還原的狀態(tài)。按前述方法但于6M鹽酸胍存在下反復(fù)用DTT還原合成的小蝰蛇毒素。HPLC分析證實(shí)還原產(chǎn)物具有完全相同的保留時間。用半制備HPLC法分離還原的小蝰蛇毒素，然后經(jīng)定量Ellman分析(Habeeb，出處同上)顯示該產(chǎn)品是八氫形式的。
血小板聚集作用的檢測37℃下在計(jì)時聚集儀(Chronolog aggregometer)中檢測血小板聚集。反應(yīng)混合物含有洗過的血小板(2×108個/ml)、血纖維蛋白原(100mg/ml)、Ca2+(1mM)和待檢的血小板聚集抑制劑部分。加入其他成分后，通過加入10mMADP(1分鐘)引發(fā)聚集作用。反應(yīng)至少進(jìn)行2分鐘。用在沒有抑制劑存在下測得之聚集速率的百分?jǐn)?shù)表示聚集抑制作用的程度。合成的小蝰蛇毒素具有不同于天然小蝰蛇毒素的化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)(表4)。
表4天然和合成的小蝰蛇毒素對人血小板聚集抑制作用的影響肽 IC50(可信限95%)天然小蝰蛇毒素0.032(0.026-0.039)合成小蝰蛇毒素0.033(0.026-0.041)用得自2-4個供血者的血小板，測定使人血小板聚集速率抑制到50%所需的肽濃度(IC50)。對每個供血者的樣品均作雙份測定。
實(shí)施例9-20按照實(shí)施例8中所述的一般方法，制備多種與小蝰蛇毒素有相似順序，并屬于結(jié)構(gòu)通式Ⅰ之范圍內(nèi)的多肽。
表5用合成法制得的小蝰蛇毒素類似物及其對人血小板聚集作用的影響實(shí)例號順序 IC50(μM)(可信限95%)9phe27-小蝰蛇毒素.013(.010-.016)10phe27，leu28-小蝰蛇毒素.016(.011-.022)11trp27-小蝰蛇毒素.017(.014-.019)12pro23，phe27，leu28-小蝰蛇毒素.026(.021-.033)13leu28-小蝰蛇毒素.034(.026-.043)14phe28-小蝰蛇毒素.038(.026-.058)15asn22，phe27，leu28-小蝰蛇毒素.038(.031-.047)16(1-41)-小蝰蛇毒素酰胺.066(.048-.084)17(1-43)-小蝰蛇毒素酰胺.081(.066-.099)18metSO28-小蝰蛇毒素.088(.033-.154)
19(1-39)-小蝰蛇毒素酰胺.327(.214-.414)20(1-39)-小蝰蛇毒素.800(.580-.1.1)注phe-苯丙氨酸;pro-脯氨酸;
leu-亮氨酸;asn-天冬酰胺;
trp-色氨酸;met-蛋氨酸;
上述縮略詞限定了各種合成的多肽。實(shí)施例9-15和18中，指出了被置換的順序位號和用于取代天然殘基的殘基。例如實(shí)施例9中，天然小蝰蛇毒第27位殘基Asp被phe取代。殘基1-26和28-49與天然小蝰蛇毒素完全相同。實(shí)施例16、17、19和20是具有趨向被刪除之羧基末端殘基的順序(如實(shí)施例20中，殘基42-49已被刪除)。實(shí)施例18中metSO代表蛋氨酸亞砜。
治療實(shí)用性在任何期望抑制人或哺乳動物血小板聚集或粘連的情況下，均可給予本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的多肽可從循環(huán)中迅速排除，并且當(dāng)需要在短期內(nèi)導(dǎo)致一種強(qiáng)抗血栓形成效果時，這些多肽在抑制血小板聚集中是特別有用的。因此，可將其用于外周動脈外科(如動脈移植、頸動脈內(nèi)膜切除術(shù))及心血管外科中，因?qū)@些動脈和器官的手術(shù)操作和/或血小板和人工表面的相互作用，可導(dǎo)致血小板聚集和消耗。聚集的血小板可形成血栓和血管栓塞?？蓪⒈景l(fā)明的多肽施用于這些外科病人用以防止血栓和栓塞形成。
心血管外科中一般都使用體外循環(huán)來使血液結(jié)合氧，且常導(dǎo)致血小板粘附在體外循環(huán)裝置的表面上。粘附作用取決于血小板膜上的GPⅡb/Ⅲa與吸附于回路表面上的血纖維蛋白原之間的相互作用(Gluszko等，Amer.J.Physiol.，252H，PP615-621，1987)。由人工表面釋放的血小板顯示有受到損傷的止血功能。給予本發(fā)明的多肽可以防止粘附。
這些多肽的其他應(yīng)用包括在血栓溶解治療期間或治療后防止血小板血栓形成、血栓栓塞和再阻塞，在冠狀動脈和其他動脈血管成形術(shù)后及冠狀動脈搭橋術(shù)后防止血小板血栓形成、血栓栓塞和再阻塞。在許多臨床中心，經(jīng)受過上述處理的病人中許多都接受過比本發(fā)明的多肽有較弱的抑制血小板聚集作用的抗血小板藥物。本發(fā)明的多肽也可用于預(yù)防心肌梗塞。
這些多肽可依照任何適于向血流中大量輸入的方式給藥。為了抑制血小板的聚集作用這些多肽既可以和纖維蛋白溶酶原或鏈激酶等血栓溶解劑合并使用，也可以和肝素、乙酰水楊酸或新雙香豆素等抗凝血劑合并使用。優(yōu)選的給藥途經(jīng)是靜脈內(nèi)給藥。因?yàn)檫@些多肽易溶于水，故可以溶液形式給藥。
在一個應(yīng)用實(shí)例中，對作血管成形術(shù)的心臟病發(fā)作病人靜脈內(nèi)給予適當(dāng)量的小蝰蛇毒素?？稍谘艹尚涡g(shù)期間或術(shù)前幾分鐘給藥，且給藥量應(yīng)足以抑制血小板聚集，如使其穩(wěn)態(tài)血漿濃度達(dá)到0.05～2μM。如果病人需作血管搭橋手術(shù)，可立即停止給予小蝰蛇毒素，并且手術(shù)期間將不會產(chǎn)生由阿斯匹林或單克隆抗體(如7E8、見Cold等所述)等其他物質(zhì)引起的并發(fā)癥，其中所說的作用在停止給藥后會持續(xù)數(shù)小時。
本發(fā)明還包括一種含有重組單鏈組織型纖維蛋白溶酶原激活劑或鏈激酶及具有下列順序之多肽的組合物H2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H其中R代表任何相同或是不同的氨基酸。
本發(fā)明還包括促進(jìn)病人血栓溶解和防止再阻塞的方法，包括給病人使用一定量的重組單鏈組織型纖維蛋溶酶原激活劑和一定量具有下列順序的肽H2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H其中R可以是任何相同或不同的氨基酸。
本發(fā)明在不違背其精神實(shí)質(zhì)和基本特征的前提，亦可包括其他一些特定形式。因此，不應(yīng)將上述特定實(shí)施例看作是對本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.一種具有下列氨基酸順序的多肽X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y其中X是H或至少一個氨基酸；Y是OH或至少一個氨基酸；且R是相同或不同的任何氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有下列氨基酸順序H2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H其中Ch代表至少一個氨基酸;Cx代表至少一個氨基酸;且各R無論是相同的或不同的，均代表一個氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的稱為“小蝰蛇毒素”之基本上純的多肽，其具有下列氨基酸順序Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
4.根據(jù)權(quán)利要求1的稱為“蝮蛇毒素”之基本上純的多肽，其具有下列氨基酸順序Val-Gln-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Ala-Glu-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Gys-Lys-Phe-Ile-Lys-Ala-Gly-R-Ile-Cys-R-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn-Y
5.根據(jù)權(quán)利要求1的稱為“巨蝰蛇毒素1”之基本上純的多肽，其具有下列氨基酸順序Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-Gln-Asp-Arg-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His
6.根據(jù)權(quán)利要求1的稱為“巨蝰蛇毒素2”之基本上純的多肽，其具有下列氨基酸順序Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-Gln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-Asp-Gln-Asp-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His
7.根據(jù)權(quán)利要求1的稱為“巨蝰蛇毒素3”之基本上純的多肽，其具有下列氨基酸順序Val-Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-Gln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His
8.根據(jù)權(quán)利要求1的稱為“Eristostatin”之基本上純的多肽，其具有下列氨基酸順序Gln-Glu-Glu-Pro-Cys-Ala-Thr-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Arg-Cys-Lys-Phe-Lys-Arg-Ala-Gly-Lys-Val-Cys-Arg-Val-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Trp-Asn-His
9.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有下列氨基酸順序Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
10.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有下列氨基酸順序Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Gly-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
11.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有下列氨基酸順序Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
12.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有下列氨基酸順序Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Pro-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
13.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有下列氨基酸順序Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
14.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有下列氨基酸順序Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Phe-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
15.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其具有下列氨基酸順序Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Asn-Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
16.一種抑制血纖維蛋白原與哺乳動物血小板結(jié)合或抑制血纖維蛋白原誘導(dǎo)的哺乳動物血小板聚集的方法，其包括將哺乳動物血小板與權(quán)利要求1的多肽一起保溫。
17.一種抑制哺乳動物體內(nèi)血小板聚集的方法，其包括給哺乳動物使用權(quán)利要求1的多肽，以抑制血液中血小板聚集作用的發(fā)生。
18.一種純化具有下列順序之多肽的方法Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr其包括(a)將凍干的Echiscarinatus毒液溶解在弱堿性溶液中;(b)離心該溶液以得到上清液;(c)將所說的上清液加于柱上，并(d)確定含血小板聚集抑制活性的部分并于真空下濃縮之。
19.含有編碼下列氨基酸順序之多肽的重組DNA分子的基因H2-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H其中Ch代表至少一個氨基酸;Cx代表至少一個氨基酸;且各個R無論是相同或不同的，均代表一個氨基酸，其中所說的多肽抑制血小板聚集作用。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的基團(tuán)，其中所說的氨基酸順序是Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
21.一種可復(fù)制的微生物表達(dá)載體，其包含一個能在微生物中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的啟動子-操縱子順序，后面是編碼有下列氨基酸順序之血小板聚集抑制劑的DNAH2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H其中Ch代表至少一個氨基酸;Cx代表至少一個氨基酸;且各個R無論是相同或不同的，均代表一個氨基酸，其中所說DNA在轉(zhuǎn)化體微生物內(nèi)的轉(zhuǎn)錄是在所說之啟動子-操縱子控制下進(jìn)行的。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的表達(dá)載體，其中所說的氨基酸順序是Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr
23.一種包含被權(quán)利要求22的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化之細(xì)胞的活細(xì)胞培養(yǎng)物。
24.一種制備富含半胱氨酸之多肽的方法，所說的多肽包含下列順序H2N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H其中Ch代表至少一個氨基酸;Cx代表至少一個氨基酸;且各個R無論是相同或不同的，均代表一個氨基酸，該方法包括(a)使所說順序的C末端第一個氨基酸接到固相交聯(lián)的聚苯乙烯樹脂上，以形氨基酰基聚合物，由氨基酰基聚合物上除去C末端第一個氨基酸封閉基團(tuán)，使繼后的第二個氨基酸偶聯(lián)在C末端氨基酸殘基上，以分步方式依次偶聯(lián)后面的各氨基酸以形成多肽順序，并除去保護(hù)N末端氨基酸的N末端Boc(丁氧羰基)基團(tuán);(b)用HF和一種或多種含硫清除劑處理多肽順序;(c)洗滌經(jīng)處理的序列并由層析柱中移入大體積稀乙酸中，以盡可能地減少不期望的交聯(lián);以及(d)將由步驟(c)得到的溶液攪拌下調(diào)到pH8.0左右。
全文摘要
一種具有下列氨基酸順序的血小板聚集抑制性多肽
文檔編號C12N15/63GK1039441SQ89104408
公開日1990年2月7日 申請日期1989年4月22日 優(yōu)先權(quán)日1988年4月22日
發(fā)明者保羅·A·弗里德曼, 羅伯特·J·古爾德, 約翰·W·雅各斯, 馬克·A·波洛科夫, 杰拉德·H·賓森, 維克托·M·加斯基, 甘忠如 申請人:麥克公司