專利名稱:還原型非糖基化重組人體間白細(xì)胞素—2的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及有生物活性的還原型非糖基化重組人體間白細(xì)胞素(Interleukine)2(r-hIL2)的制備方法。
天然的人IL2是刺激活性T細(xì)胞增生的淋巴因子,在其蛋白質(zhì)的氨基酸順序中有3個(gè)半胱氨酸,位于第58、105和125位。位于58和105位的半胱氨酸由一個(gè)雙硫鍵橋連接,而125位的半胱氨酸有游離的巰基(Robb,RJ et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81 6486-6490)。
通過(guò)重組DNA技術(shù),用等位基因或衍生物制備人體IL2的方法已有文獻(xiàn)報(bào)道。例如,Taniguchi,T.等人〔Nature(1983)302 305-310〕和Devos,R.等人〔Nucleic Acids Research(1983)11 4307-4323〕已描述了人體IL2基因的無(wú)性繁殖及其在微生物中的表達(dá),Ju,C等人(J.Biol.chem(1987)262,5723-5731)已獲得了IL2重組衍生物的表達(dá)。此外,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)IL2以不溶的顆粒狀累積于微生物中時(shí),它是含有3個(gè)硫醇基還原型,并且沒有活性(Japanese Patent Application JP 1257931)。因此認(rèn)為要得到具有活性的IL2,該顆粒狀累積的還原型蛋白必須經(jīng)過(guò)一個(gè)氧化過(guò)程。為此,將該蛋白溶于變性介質(zhì)中后,在控制的氧化介質(zhì)中使之形成一個(gè)需要復(fù)性的適宜的二硫鍵橋58-105。還有其它的氧化方法,例如僅用氧氣氧化(空氣自動(dòng)氧化)或有銅離子存在的氧氣氧化或弱氧化劑存在下的氧氣氧化,或用硫醇和二硫化物混合物的氧化(Tsuji,Tetal.Biochemistry(1987)263129-3134)。
經(jīng)氧化復(fù)性后,必須經(jīng)色層析純化以除去生成的氧化產(chǎn)物異構(gòu)體,它們包括分子內(nèi)58-105和105-125鍵連的異構(gòu)體及其它分子內(nèi)鍵連的異構(gòu)體。這些異構(gòu)體無(wú)活性,而且可按Wang,A等人〔Science(1984)224,1431-1433〕或Browing,JL等人〔AnalBiochem(1986)155,123-128〕的方法用反相色譜將它們分離。
因此從顆粒狀累積蛋白中制備具有適宜生物活性的同質(zhì)氧化重組IL2存在某些技術(shù)問(wèn)題,因?yàn)椴徽摬捎檬裁捶椒ǘ急仨氂屑兓膸讉€(gè)步驟,而這幾個(gè)純化步驟使所要產(chǎn)物的產(chǎn)率降低。
本發(fā)明方法不需要再氧化便可得到具有IL2生物活性的產(chǎn)物。
首先,本發(fā)明涉及制備非糖基化重組人體IL2及其等位基因或衍生物的方法,所述IL2一方面具有下述氨基酸順序
其中X代表蛋氨酸或氫原子,位于58,105和125位的三個(gè)半胱氨酸均為還原型;另一方面,所述IL2的生物活性類似于具有相同氨基酸順序并在58-105位含有一個(gè)二硫鍵橋的氧化型IL2。
所謂等位基因和衍生物,通過(guò)取代,去除或增加修飾除58,105和125位的半胱氨酸外的氨基酸順序中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸,其修飾程度以這些產(chǎn)物能保持還原型IL2特有的生物活性為限。用重組ADN方法可得上述的修飾物是共知的,例如可用導(dǎo)向誘變技術(shù),該技術(shù)已有綜述〔Lather,RF and Lecoq JP in Genetic Engineering Academic Press(1983)31-50 or Smith,M and Gillam,S,Genetic Engineering principals and methods Plenum Press(1981)31-32〕。所謂還原型指的是含有IL2的半胱氨酸殘基有游離的巰基,該巰基可用分光光度計(jì)以二硫雙吡啶作為硫醇試劑進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)用四氮唑鎓鹽的比色試驗(yàn)〔Moss-mann,TJ.Immunol.Meth.(1983)65 55-63〕測(cè)量依賴IL2CTIL-。的小鼠白血病細(xì)胞系的增生測(cè)定了按本發(fā)明方法獲得的還原型IL2的生物活性,結(jié)果與相應(yīng)的在58-105位含有二硫鍵橋的氧化型IL2的生物活性相同。
本發(fā)明還涉及制備非糖基化重組人體IL2及其同位基因或衍生物的方法,所述IL2一方面具有下述氨基酸順序
其中X代表蛋氨酸或氫原子,位于58,105和125位的三個(gè)半胱氨酸均為還原型;另一方面,所述IL2的生物活性至少為0.5x107U/mg·IL2活性的單位定義為試驗(yàn)中產(chǎn)生50%最大反應(yīng)的量。所用標(biāo)準(zhǔn)是由國(guó)家癌癥研究所(NCT)提供的樣品〔Biological Response Modifer Program(BRMP)reference human reagent IL2(Jurkat)〕。
更具體地講,本發(fā)明涉及制備非糖基化重組人體IL2的方法,所述IL2具有下述氨基酸順序
其中X代表蛋氨酸或氫原子,位于58,105和125位的三個(gè)半胱氨酸均為還原型,所述IL2的生物活性與天然的人IL2相似。所謂相似活性指的是與從白血病Jurkat細(xì)胞中分離得到的天然IL2的特殊活性相同,即1.3x107u/mg(參照BRMP),或與該特殊活性的差別最多不大于25%。按本發(fā)明方法得到的還原型IL2的氨基酸順序,根據(jù)要表達(dá)的轉(zhuǎn)化微生物(如E.coli)可任意增加一個(gè)N-端蛋氨酸。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)例中含有蛋氨酸的氨基酸順序是優(yōu)選的,但也可用含有蛋氨酸和不含蛋氨酸產(chǎn)品的混合物。
按本發(fā)明,制備非糖基化重組人體IL2的方法包括先用離液序列高的試劑將轉(zhuǎn)化微生物體內(nèi)以顆粒狀累積的IL2溶于還原介質(zhì)中進(jìn)行提取,然后沉淀純化,繼之用反相高效液相色譜儀純化,用酸洗脫。該方法的特征在于a)如果必要,將上述色層中洗脫的主要餾分(含產(chǎn)品部分)于-20℃范圍內(nèi)冷凍,然后分離水相;b)分離的水相在酸性介質(zhì)中稀釋,然后在酸性介質(zhì)中于另一反相高效液相色譜柱上層析,分離得到所述的IL2。
由于轉(zhuǎn)化微生物(如E.coli)的高效率表達(dá)而產(chǎn)生的粒狀重組IL2可用已知的方法溶于離液序列高的濃溶液(如6-8M的胍鹽溶液)中,然后用反相高效液相色譜儀(下文簡(jiǎn)稱RP-HPLC)純化。所述RP-HPLC用商售得到的載體,最好是移植的硅膠如C3,C4,C8或C18,并用酸性洗脫劑(PH在1-4間)洗脫。柱上的IL2也可用梯度洗脫系統(tǒng)洗脫,該系統(tǒng)包括有機(jī)酸如乙酸或三氟乙酸(下文稱TFA)及有機(jī)溶劑如乙腈。用分光光度計(jì)于280nm處檢測(cè)洗脫液,含產(chǎn)品的主要餾分作為任意冷凍步驟的原料,該冷凍步驟是本發(fā)明方法的一部分。所謂冷凍是指將在環(huán)境溫度下收集的所述主要餾份置于-20℃逐級(jí)降溫的環(huán)境中,使之逐步形成含水固體相,通過(guò)傾倒可除去固體水相的上清液部分。以該方法分離得到的水相經(jīng)稀釋后,在下述酸性介質(zhì)中用作RP-HPLC的原料,此乃本發(fā)明方法的一部分。所述水相的稀釋是在酸性介質(zhì)中進(jìn)行的,該酸性介質(zhì)的PH為1-4,最好為2-3。稀釋后的水相于反相柱上層析,該反相柱用商售載體如移植硅膠C3,C4,C8或C18,這些載體具有適用于蛋白的適合的孔徑,例如直徑至少為150
,IL2的洗脫包括使用含與水混溶的低級(jí)醇和有機(jī)酸的濃度逐漸增加的梯度洗脫液。
本發(fā)明方法顯而易見的特征在于任意冷凍步驟在含有約0.1%三氟乙酸的乙腈水溶液中進(jìn)行;用有機(jī)酸如檸檬酸的水溶液進(jìn)行稀釋;和所述IL2在第二次色譜層析中是用含異丙醇,水和有機(jī)酸(如檸檬酸)的溶液洗脫的。所述含有約0.1%TFA的乙腈水溶液與第一次層析中洗脫的主要餾分是一致的,它是適合于本發(fā)明所述任意冷卻步驟的優(yōu)選混合物。最好水相的稀釋在任意分離之后或在第一次層析之后立刻進(jìn)行。稀釋時(shí),最好加入2倍體積的水,其中含有0.5-2%的有機(jī)酸如甲酸,乙酸,丙酸,三氟乙酸或檸檬酸,更優(yōu)選的是加入2倍體積的含有0.5%檸檬酸的水。第二次色譜層析是本發(fā)明要求專利保護(hù)的方法的一部分,它包括將冷凍步驟之后分離得到的并經(jīng)稀釋的水相用于RP-HPLC層析,層析中使用商售載體如移植硅膠C3,C4,C8或C18,這些載體的孔徑至少為150
。最好的載體是C4VYDAC300
移植硅膠,它有以共價(jià)鏈方式移植的丁基,孔徑為300
,平均粒徑為15-20微米。按本發(fā)明方法,用梯度系統(tǒng)進(jìn)行洗脫,該系統(tǒng)含有醇如丙醇或異丙醇,有機(jī)酸如甲酸,乙酸,丙酸,三氟乙酸或檸檬酸。優(yōu)選的混合物包括異丙醇,水和0.5-2%的檸檬酸,更優(yōu)選的含0.5%的檸檬酸,并且用異丙醇濃度逐漸增加的梯度系統(tǒng)時(shí),低餾分洗脫液中異丙醇含量為約48%,而高餾分洗液中異丙醇的含量為約59%,后一洗脫液中含有還原型非糖基化活性重組人體IL2。
本發(fā)明課題也涉及通過(guò)上述方法獲得的還原型非糖基化重組人體IL2。
將得到的上述餾分靜置于0°至-20℃,它在該溫度范圍內(nèi)是穩(wěn)定的??赏ㄟ^(guò)減壓共沸蒸餾除去異丙醇,將得到的溶液置于+4℃,或立即凍干分離出本發(fā)明的IL2。
本發(fā)明還涉及主要餾分不經(jīng)過(guò)冷凍步驟和水相分離步驟的改進(jìn)制備方法。
按本發(fā)明所要求保護(hù)的改進(jìn)方法得到稀釋的主要餾分,可將其置于+4℃,它是穩(wěn)定的,并是第二次色譜層析的原料,所述第二次色譜層析是本發(fā)明要求保護(hù)的方法的一部分。
當(dāng)有硫醇基存在時(shí),按本發(fā)明得到的IL2有3個(gè)游離的巰基,對(duì)CTLl-2系的增生試驗(yàn)的特定活性為0.7-1.3x107U/mg,即相當(dāng)于天然IL2的活性。這一活性是以與天然IL2的相同方式藥用上述還原型非糖基化重組人體IL2的依據(jù),利用它的免疫調(diào)節(jié)活性及抗腫瘤活性可以治療許多疾病。所述免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性已有人描述過(guò)〔例如,參見Fletcher,M.et al.lymphokine Research 6(1987)47-57〕,它們包括T淋巴細(xì)胞的增生,NK(天然殺手)細(xì)胞和LAK(激活的淋巴因子殺手)細(xì)胞的細(xì)胞毒性的誘導(dǎo),細(xì)胞免疫性的恢復(fù),在免疫缺陷中抗感染的保護(hù)作用或免疫的調(diào)節(jié)作用??芍苯咏o藥,或結(jié)合采用Rosenberg,SA等人描述的免疫治療方法〔N.Engl.J.Med.(1985)313,1485-1492〕給藥。
同使用天然IL2相同,按本發(fā)明得到的IL2可單獨(dú)使用,或與其它免疫調(diào)節(jié)劑如干擾素α,干擾素γ和/或其它治療劑合用。
本發(fā)明的非糖基化重組人IL2可用于制備以其作為主要活性成分的藥用組合物。該組合物可以是液體或固體。本發(fā)明得到的IL2可接已知方法組方制備適用的藥用組合物,在組合物中,IL2可與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合。該組合物含有有效量的IL2和適量的適宜于人服用的載體。減壓共沸蒸餾除去異丙醇后得到本發(fā)明的IL2酸性水溶液,將水溶性填充劑加入其中,并冰凍干燥可以得到組方物。填充劑指的是一種水溶性物質(zhì),該物質(zhì)在混合物重新溶于水時(shí)不改變?cè)瓉?lái)的PH值??捎玫奶畛鋭┑睦邮翘牵缙咸烟?,核糖,蔗糖,麥芽糖,海藻糖或還原糖如甘露糖醇甘露糖醇是最好的。加入甘露糖醇的濃度取決于給藥量,當(dāng)本發(fā)明的IL2濃度為0.05-1mg/ml時(shí),其加入濃度為10-50mg/ml,最好為50mg/ml。將該溶液在無(wú)菌和無(wú)氧條件下過(guò)濾,再分裝入劑量瓶或冰凍干燥。凍干的混合物裝于小瓶中,注射時(shí)用適合于非腸道給藥的蒸餾水再配制。
本發(fā)明的組合物可以靜脈注射或滴注給藥,也可以經(jīng)肌肉,腹膜,胸膜或皮下給藥。本發(fā)明得到的組合物的有效劑量取決于給藥的途徑和要治療的疾病,對(duì)成人和兒童而言,一般為1x106U/M2/24h至40x106U/M2/24h,最好在20x106U/M2/24h范圍內(nèi)。每天的劑量也取決于給藥的持續(xù)時(shí)間,它不應(yīng)受上述劑量的限制。
就灌注給藥而言,藥物組合物特別含有還原型非糖基化重組人IL2,水和有機(jī)酸如檸檬酸。這樣的組合物可通過(guò)下法制得在適宜的載體如葡萄糖的存在下,將本發(fā)明凍干的藥用組合物溶解,所述載體的作用是使活性成份在灌注期間保持穩(wěn)定。優(yōu)選的條件在于先將蒸餾水注入凍干的混合物中配成溶液,然后將該溶液注入含葡萄糖液的灌注袋中,得到的稀釋濃度為50mg/ml,該濃度適合于給藥的劑量。
本申請(qǐng)的說(shuō)明書中的參考文獻(xiàn)包括了引用的全部出版物。
下述附圖就本發(fā)明的某些方面作出解釋。
圖1a是實(shí)例1中于8M胍溶液中的粗提物的RP-HPLC色譜分析圖;
圖1b是還原型和氧化型IL2標(biāo)準(zhǔn)的RP-HPLC色譜分析圖;
圖2是重溶解的實(shí)例1樣品的RP-HPLC色譜分析圖;
圖3是實(shí)例1中冷凍步驟后主要餾分的RP-HPLC色譜圖;
圖4是實(shí)例1中餾分“59”的RP-HPLC色譜分析圖;
圖5是實(shí)例2樣品明膠電泳的SDS-PAGE圖;
圖6a和6b是實(shí)例2樣品的多肽曲線圖;
圖7a和7b是實(shí)例2樣品的DC曲線圖;
圖8是實(shí)例3樣品對(duì)人淋巴細(xì)胞的促有絲分裂影響曲線;
圖9是獲得的關(guān)于K562和DAUDI細(xì)胞系的毒性曲線。
下述實(shí)例解釋本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1該實(shí)施例的純化原始記錄詳見本說(shuō)明書第19頁(yè)。
還原型生物活性r-hIl2粒狀物的純化通過(guò)離心由質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli菌株的培養(yǎng)物得到了粒狀物,所述質(zhì)粒含有天然IL2的密碼并能夠在細(xì)胞內(nèi)按該密碼累積IL2,例如參見Sato,T等人的描述〔J.Biochem(1987)101,525-534〕。于是將從10升發(fā)酵液中得到的細(xì)胞于Manton Gaulin勻漿器中打碎。從分離的和水洗的細(xì)胞殘?jiān)?濕重90-170g)中得到IL2,將其溶于2.5倍體積的Tris緩沖液(Hcl 20mM,PH8)中,該緩沖液含有8M胍鹽酸鹽(Gu,Hcl)和100mM二硫蘇糖醇(DTT)。通過(guò)RP-HPLC分析估計(jì)IL2溶解量(1.5-2.5g),所述RP-HPLC分析用C4VYDAC柱(0.46x15cm)300 ,5微米,流速2ml/mn,用含0.1%TFA的乙腈線性梯度洗脫液(10分鐘30-70%),用分光光度計(jì)于280nm或210nm處檢測(cè),用標(biāo)準(zhǔn)IL2標(biāo)定后計(jì)算280nm處的峰面積(圖1a和1b)。然后在DTT存在下降低Gu.HCl的濃度至2M,使該IL2沉淀出來(lái),用0.1%的TFA水溶液洗沉淀,直至上清液的PH<5.0,然后將IL2沉淀溶于含20%乙腈和0.1%TFA的水溶液中。根據(jù)RP-HPLC分析(圖2),得到的重溶解物中還原型IL2的含量大于85%,其生物活性比還原型IL2純品低0.01x107U/mg,其巰基含量為2.85SH/每分子還原型IL2。將重溶解得到的溶液的一部分(經(jīng)RP-HPLC分析約含相當(dāng)于200mg的IL2)稀釋至乙腈濃度小于10%,TFA濃度為0.1%,然后將該稀釋液用于C4VYDAC柱(5.7x30cm)上層析,用含0.1%TFA的乙腈線性梯度洗脫液(40分鐘內(nèi)從30%至80%)洗脫IL2,流速為100ml/mn,用分光光度計(jì)于280nm處檢測(cè),當(dāng)乙腈濃度約為60%時(shí)有最大吸收峰,洗脫的IL2用RP-HPLC分析。將收集的含還原型IL2的“主要餾分”用于冷凍步驟,從室溫冷至-20℃±1℃,使富含水和IL2的下層處于凍結(jié)狀態(tài)。解凍后得到溶液,用2倍體積的0.5%檸檬酸水溶液稀釋后將其用于C4VYDAC柱(5.7x30cm)上層析,用含0.5%檸檬酸的異丙醇線性梯度液(40分鐘內(nèi)從20%至70%洗脫,流速50ml/mn,用分光光度計(jì)于280nm處檢測(cè)流出液,發(fā)現(xiàn)當(dāng)異丙醇濃度為約48%時(shí)(餾分“48”)有最小吸收峰,而異丙醇濃度為約59%時(shí)(餾分“59”)有最大吸收峰(圖3)。收集餾分“59”,在0℃隔絕空氣保存至少24小時(shí)是穩(wěn)定的。
通過(guò)減壓共沸蒸餾除去異丙醇后,用RP-HPLC分析餾分“59”,得一單峰(圖4),它隨約60%的乙腈流出,而參照物氧化型IL2隨約57%的乙腈流出(圖1b)。除去異丙醇后的餾分“59”,其中IL2的濃度大于1mg/ml,PH3±0.5,可隔絕空氣于4℃保存至少一周,可直接凍干或配成藥用組合物。按CTLL-2細(xì)胞繁殖的體外試驗(yàn),給予凍干的餾分“59”,其生物活性為(1.3±0.5)x107U/mg,與天然IL2相同。
用二硫雙吡啶的比色計(jì)方法測(cè)定,凍干的餾分“59”的巰基含量是2.94SH/mol,而氧化型參照物IL2為0.76SH/mol。
從10升發(fā)酵液得到的餾分“59”中,可制得還原型的r-hIL2,通過(guò)RP-HPLC分析其量為150-300mg,含3SH基團(tuán),具有生物活性,RP-HPLC圖譜為單峰(按19頁(yè)格式記錄)。
實(shí)例2有生物活性的還原型r-IL2的純化除了主要餾分不經(jīng)過(guò)冷凍步驟的傾倒分離,而直接用2體積0.5%檸檬酸水溶液稀釋外,其余程序用實(shí)例1,按實(shí)例1收集和處理餾分“59”。
實(shí)例3有生物活性的還原型r-hIL2的理化特征將按本發(fā)明在實(shí)例1餾分“59”中得到的還原型r-hIL2測(cè)定下列性質(zhì)1)均一性在含有10%SDS的兩相(分別具有5%和15%丙烯酰胺的濃縮明膠和移動(dòng)明膠)明膠上進(jìn)行SDSPAGE電泳。先將樣品于含有1%SDS和5%巰基乙醇的緩沖液中在100℃加熱2分鐘,然后與1%SDS緩沖液一起移動(dòng),用銀著色,表明為單帶,2ug沉淀物(圖5),純度大于99%。
2)電泳測(cè)定分子量在還原介質(zhì)中測(cè)得的表觀分子量(MW)約為15kd,與計(jì)算分子量一致(圖5)。
3)氨基酸組成將25ug本發(fā)明的還原型r-hIL2溶于0.5ml水中,并放于玻璃水解管中,加入5ml含有31.7%TFA和4.8%巰基乙酸的濃鹽酸,真空下將該管密封,于155℃水解40分鐘,將水解物減壓蒸發(fā)至干,將殘留物溶于0.7ml檸檬酸鹽緩沖液(PH=3)中,于Interaction AA 511柱(0.46x15cm)上進(jìn)行氨基酸分析,該柱的PH梯度為3至5,含有Nacl的檸檬酸緩沖液(濃度0-70g/l),柱溫60℃,流速0.5ml/mn,在柱出口處樣品變成鄰苯二醛的衍生物后用熒光檢測(cè)器檢測(cè),結(jié)果見表1,為兩次水解的和2次層析的平均值,其氨基酸組成除N-端多-蛋氨酸外,與天然IL2的組成一致。
表1INTERLEUKIN2氨基酸理論值測(cè)定值GLN+GLU1817.56ASN+ASP1212.61THR1312.09SER87.05PRO 5 ND*GLY22.59ALA55.50VAL44.34MET55.59ILE99.15LEU2219.96TYR32.60PHE65.90TRP 1 NC**LYS1110.19HIS33.48ARG45.29CYS 3 NC***ND=未測(cè)定**NC=未計(jì)算
4)N-端氨基酸順序用Edman自動(dòng)降解法通過(guò)微程序分析3N-端氨基酸順序?qū)⒈景l(fā)明具有生物活性的還原型r-hIL2(15ug)用連接有HPLC120A的用于生物系統(tǒng)470A的氣相微順序分析儀分析,識(shí)別下列PTH氨基酸StagesPTHAAStagesPTHAA1Met11ThrAla2Ala12GlnPro3Pro13LeuThr4Thr14GlnSer5Ser15Leu6Ser16Glu7Ser17His8Thr18Leu9Lys19Leu10Lys20Leu20個(gè)N-端殘基的順序與天然IL2的理論連接順序一致。觀察到約10%的IL2沒有蛋氨酸。
5)具有溴化氰的肽圖將700ug本發(fā)明還原型IL2殘留物(約53nmoles)溶于4ml甲酸(濃度70%)液中,并加入5.6mg溴化氰,室溫?cái)嚢柽^(guò)夜,用水稀釋,凍干,用RP-HPLC分析,該分析用UBondapack C18柱(0.46x20cm),用含0.1%TFA的乙腈梯度洗脫液(濃度變化為0-70%)洗脫,流速1ml/mn,溫度為室溫,用分光光度計(jì)于220nm處檢測(cè)。還原型r-hIL2的肽圖(圖6a)表明與作對(duì)照的氧化型IL2的肽圖(圖6b)比較具有不同的碎片。
6)圓二色性在室溫下用Jobin YVon Mark V光譜圖測(cè)定圓二色性光譜(CD)。按實(shí)例1方法,樣品經(jīng)RP-HPLC層析之后用線性梯度異丙醇液(其中含0.5%的檸檬酸用0.1%的甲酸代替)洗脫,然后蒸去異丙醇,凍干得還原型r-hIL2樣品,將該樣品溶于乙酸中,濃度為1mg/ml。就肽吸收區(qū)(185-250nm)和芳香族吸收區(qū)(260-320nm)而言,使用的容器分別具有0.01cm和0.5cm厚。每個(gè)樣品的溶劑吸收光譜從IL2的吸收光譜中扣除。結(jié)果以橢圓率0的形式給出(每個(gè)IL2殘留物的平均重量=116)。
圖7a為遠(yuǎn)紫外區(qū)CD光譜本發(fā)明具有生物活性的還原型r-hIL2的光譜表明有第二種結(jié)構(gòu)順序存在,α螺旋線率(%)的測(cè)定表明與氧化型IL2對(duì)照相比幾乎無(wú)明顯差別(%α螺旋率#50%)。
圖7b表明近紫外區(qū)的CD光譜氧化型IL2(對(duì)照)的DC光譜表明對(duì)芳香殘基的光譜而言具有明顯的不對(duì)稱性,而本發(fā)明的還原型r-hIL2不明顯,但有差別。
實(shí)例4生物活性用體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)本發(fā)明的還原型r-hIL2的生物活性。
1)對(duì)人細(xì)胞的活性a.成淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)除了對(duì)小鼠細(xì)胞系(如可進(jìn)行IL2的生物測(cè)定的CTLL-2)有促增生活性外,通過(guò)對(duì)摻入ADN中氚標(biāo)記的胸苷的測(cè)定(圖8)表明本發(fā)明的還原型r-hIL2對(duì)正常循環(huán)的人淋巴細(xì)胞具有促有絲分裂的作用,作用的大小取決于劑量,該作用與氧化型IL2(對(duì)照)的作用相同。
b)單核細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)按下述方法進(jìn)行將人循環(huán)單核細(xì)胞在IL2存在下保溫,然后在4小時(shí)內(nèi)通過(guò)測(cè)量Cr51的鹽析來(lái)測(cè)定對(duì)癌變靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響,所述癌變靶細(xì)胞是分別由B淋巴瘤(抗NK細(xì)胞)衍生的紅白血病細(xì)胞系K562(對(duì)NK細(xì)胞敏感)和DAUDI細(xì)胞系。結(jié)果(用每106個(gè)細(xì)胞的溶解單位,即,UL/106表示)表明對(duì)癌變靶細(xì)胞而言,本發(fā)明的還原型γ-hIL2能夠增加NK的活性或誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性,作用大小取決于劑量,該作用與天然IL2已知的作用相同(圖9)。
2)對(duì)小鼠的體內(nèi)活性(腹膜巨噬細(xì)胞的刺激作用)對(duì)正常Balb/c和MRL-+/+小鼠連續(xù)腹膜內(nèi)注射次最佳劑量(100-300U)的大鼠重組干擾素r,24小時(shí)后注射本發(fā)明的還原型r-hIL2,產(chǎn)生吞噬細(xì)胞的氧化機(jī)制,該機(jī)制通過(guò)下述方法評(píng)價(jià)本發(fā)明的IL2注射24小時(shí)后殺死小鼠,從腹腔移出吞噬細(xì)胞,在佛波酯(phorbal ester,即PMA)的存在下測(cè)定化學(xué)熒光。其作用大小取決于劑量,該作用與用氧化型IL2(對(duì)照)時(shí)所觀察到的相同。
結(jié)果如下注射劑量注射IL2后的化學(xué)熒光(CPMx104)(ng/每只小鼠)還原型氧化型05±24±317±35±1390±571±510130±10140±7030350±50400±70100710±20695±25300375±25350±20實(shí)例5注射藥用組合物將相當(dāng)于本發(fā)明的餾分“59”減壓共沸蒸餾除去異丙醇,得到還原型r-hIL2的水溶液,立即用甘露醇水溶液稀釋,比率為每毫升含100ug還原型IL2和每毫升含50mg甘露糖醇,所述甘露糖醇水溶液中的空氣被氮?dú)馀懦霾⒂玫獨(dú)鈱⒃撊芤猴柡?。將上述稀釋液?.22u膜過(guò)濾,無(wú)菌下分裝于小瓶中(每瓶1ml),凍干,在氮?dú)猸h(huán)境中封瓶,放于+4℃?zhèn)溆谩?br>
實(shí)例6連續(xù)灌注的藥用組合物將相當(dāng)于本發(fā)明的餾分“59”減壓共沸蒸餾,除去異丙醇,得到還原型r-hIL2的水溶液,立即用甘露糖醇水溶液稀釋,比率為每毫升含500ug還原型IL2和每毫升含50mg甘露糖醇,所述甘露糖醇水溶液中的空氣被氮?dú)馀懦霾⒂玫獨(dú)怙柡驮撊芤骸⑸鲜鱿♂屢河?.22u膜過(guò)濾,無(wú)菌下分裝于小瓶中(每瓶1ml),凍干,在氮?dú)猸h(huán)境下封瓶,放于+4℃?zhèn)溆谩J褂脮r(shí)向每瓶注入1ml無(wú)菌蒸餾水將其溶解,將相當(dāng)于7瓶劑量的溶液(約35.166單位)注入含有500ml TravenolR葡萄糖溶液(5%灌注液)的ViaflaxR容器中。
記錄發(fā)酵細(xì)菌殘留物提取用MantonGaulin勻漿器打碎含產(chǎn)物的細(xì)胞水洗洗液溶于含胍的緩沖液中提取稀釋含胍液使產(chǎn)物沉淀用水/TFA洗滌用乙腈/TFA重溶解層析RP-HPLCC4乙腈/TFA梯度洗脫液冷凍至-20℃RP-HPLCC4異丙醇/檸檬酸梯度洗脫液減壓蒸餾除去異丙醇凍干
權(quán)利要求
1.制備非糖基化重組人體IL2(Interleukine2)及其順序的同位基因或衍生物的方法,所述人體IL2,一方面具有下述氨基酸排列順序,即X-AlaProThrSerSerSerThrLysLysThrGlnLeuGlnLeuGlnLeuGluHisLeuLeuLeuAspLeuGlnMetIleLeuAsnAsnTyrLysAsnProLysLeuThrArgMetLeuThrPheLysPheTyrMetProLysLysAlaThrGluLeuLysHisLeuGlnCysLeuGluGluGluLeuLysProLeuGluGluValLeuAsnLeuAlaGlnSerLysAsnPheHisLeuArgProAspLeuIleSerAsnIleAsnValIleValLeuGluLeuLysGlySerGluThrThrPheMetCysGluTyrAlaAspGluThrAlaThrIleValGluPheLeuAsnArgTrpIleThrPheCysGlnSerIleIleSerThrLeuThr其中X代表蛋氨酸或氫原子,位于58,105和125位的三個(gè)半胱氨酸均為還原型;另一方面具有與同一氨基酸順序的氧化型IL2相同的生物活性,氧化型IL2在58-105位有一雙硫鍵橋;該制備方法包括,先用離液序列高的試劑將轉(zhuǎn)化微生物體內(nèi)以顆粒狀累積的IL2溶于還原介質(zhì)中,進(jìn)行提取,然后通過(guò)沉淀純化,繼之用反相高效液相色譜儀純化,用酸性洗脫液洗脫;該制備方法的特征在于a)必要時(shí),將從上述色譜儀中洗脫的主要餾分冷卻至-20℃再分離出水相,b)用酸性介質(zhì)稀釋所得水相,然后于另一反相高效液相色譜柱上層析,酸性介質(zhì)洗脫,分離得到上述的IL2。
2.按權(quán)利要求1的方法,其特征在于冷凍步驟在含有約0.1%三氟乙酸的乙腈水溶液中進(jìn)行;稀釋步驟在有機(jī)酸如檸檬酸中進(jìn)行;在第二次層析中,用異丙醇,水和有機(jī)酸如檸檬酸的溶液將上述IL2洗脫下來(lái)。
3.按權(quán)利要求1或2的方法,其特征在于所述主要餾分并不經(jīng)過(guò)冷凍步驟和水相分離步驟。
4.按權(quán)利要求1至3中的任一權(quán)項(xiàng)所述的方法,其特征在于制備一種具有生物活性的產(chǎn)品,其活性至少為0.5x107u/mg。
5.按權(quán)利要求1至4中任一權(quán)項(xiàng)所述的方法,其特征在于制備一種生物活性與天然人體IL2相似的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備還原型非糖基化重組人體IL
文檔編號(hào)C12N15/26GK1042377SQ8910624
公開日1990年5月23日 申請(qǐng)日期1989年7月28日 優(yōu)先權(quán)日1988年7月28日
發(fā)明者丹尼·埃爾, 菲利普·里貝隆, 皮埃爾·伊夫斯·阿比卡西斯 申請(qǐng)人:魯索-艾克勒夫公司