專利名稱：胃動素樣多肽的制備及表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備胃動素樣多肽、有關的重組DNA及插入了重組ONA的質(zhì)粒的方法。
此多肽可用作藥劑，特別是用于醫(yī)治胃腸病。
胃動素是一種肽激素，最早由BrownJ.C.等從豬的上部小腸粘膜分離到，并測得其氨基酸順序〔“Gastroenterology”Vol.62，pages401-404(1972)和“Can.J.Biochem.”Vol.52，pages7-10(1974)〕。豬的胃動素由22個氨基酸組成，分子量約為2700。
而本發(fā)明的發(fā)明者已成功地分離出編碼人胃動素前體的克隆CDNA，其核酸序列中有一段編碼3與豬胃動素相同的氨基酸序列。因此，顯然，人與豬的胃動素具有相同的氨基酸序列〔Jap.Pat.No.Sho63-276489(A)，相應于UnitedstatesPat.Appln.Ser.No.07/190849以及EUropeanPat.Appln.No.88107108.8〕。
作為胃動素的生理作用，已知其對消化道的高促動作用和對胃十二指腸、結(jié)腸平滑肌的收縮作用。作為高促動作用，有報導胃排空時間被縮短〔“Gastroenterology”Vol.80，pages456-460(1981)〕;作為對消化道平滑肌的收縮作用，已知胃動素能獨立于神經(jīng)系統(tǒng)對兔和人的胃十二指腸顯示很強的收縮作用。而且，沒有關于特別的付作用的報導。故可考慮將胃動素用作治療術后發(fā)生的胃腸道疾病及其診斷。與此相關，請注意，前列腺素被廣泛用于胃腸病的治療，而此藥物治療顯示相當強的付作用。
還有報導，化學合成的胃動素類似物-13位上的蛋氨酸被亮氨酸或正亮氨酸取代，具有與純天然豬胃動素同樣的生物活性〔“Scand.J.Gastroenterology”Vol.11，pages119-203(1976)等〕。據(jù)此認為，13位上的蛋氨酸對胃動素的活性幾乎沒有什么影響。
按廣泛接受的工藝方法，胃動素從豬的器官組織中抽提而得，此法很難得到大量胃動素。由于胃動素是由22個氨基酸組成的多肽，即使用化學合成法，也很難大批量生產(chǎn)。換句話說，盡管期望它成為有效的胃腸病治療劑，但由于產(chǎn)量低，胃動素實際上并未用于臨床。
因此，有各種各樣的實驗研究，借所謂“生物技術”來制備具有胃動素樣活性，且價格合理的多肽〔Jap.Pat.Nos.63-71195(A)and1-102096(A)〕。
本發(fā)明的基本目的在于提供一個制備胃動素樣多肽的方法，它比此發(fā)明之前的所有方法更為簡單易行。
本發(fā)明另一個而且是更重要的目標是提供一個極為高效的胃動素樣多肽制備法。
本發(fā)明的另一個目的是為實施這一方法提供一新的重組DNA。
本發(fā)明的再一個目的是提供一表達質(zhì)粒，重組DNA插于其中。
根據(jù)本發(fā)明，借助一制備式(1)中胃動素樣多肽的方法，即可達到上述的基本目標，Phe-Val-Pro-lle-Phe-Thr-Gly-Glu-Leu-Gln-Alg-X-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln式(Ⅰ)其中X是一除蛋氨酸和天冬氨酸以外的氨基酸殘基。
這一制備方法包括合成一含有至少6個不帶電的極性氨基酸殘基，且未端為蛋氨酸的單鏈DNA、它的互補單鏈DNA，一編碼(1)式氨基酸序列的單鏈DNA、它的互補單鏈DNA;用所得的四條單鏈合成雙鏈DNA，以編碼不帶電、極性氨基酸殘基的DNA片段及其互補鏈作前導序列;在每一所得的雙鏈DNA未端加特異性限制酶識別位點;以所述限制酶裂解一具有另一蛋白遺傳信息的質(zhì)粒;將上述雙鏈DNA片段接于裂解質(zhì)粒的每一切點上，以重建一含重組DNA的質(zhì)粒;用重建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一微生物;培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化菌株，生產(chǎn)作為嵌合蛋白的一部分的、具有式(1)所示氨基酸順序的多肽;破細胞，用溴化氰和肽鏈內(nèi)切酶處理，分離(1)式多肽;分步純化多肽。
13位上標為X的氨基酸殘基之所以申明不能是蛋氨酸和天冬氨酸其原因在于如果X是蛋氨酸，則不能得到具有胃動素樣活性的所需多肽，因為，當用溴化氰處理嵌合蛋白時，13位上的蛋氨酸將發(fā)生裂解;如果X是天冬氨酸，也不能得到所需的多肽，在用肽鏈內(nèi)切酶處理時，13位的天冬氨酸也將裂解。肽鏈內(nèi)切酶是用來除去多余的氨基酸殘基的，其因在于為了合成的方便，相應于式(1)所示多肽的單鏈DNA是分別合成的，它有一編碼天冬氨酸的密碼子(GAC)，此天冬氨酸位于氨基酸序列C未端的Lys-Gly-Glu后。依發(fā)明所述方法所得的每一多肽皆具胃動素樣生物活性，其活性水平因記號X所表示的氨基酸殘基的不同而異。作為13位上的氨基酸殘基X，以亮氨酸、纈氨酸及諸如此類的氨基酸為好。13位上的氨基酸殘基是甘氨酸或脯氨酸的多肽不盡人意，因為，以空間結(jié)構(gòu)推測，它們顯示較低的活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸和絲氨酸可作為合適的不帶電、極性氨基酸。因為，具有這些氨基酸殘基的多肽，表達效率增高。前導序列的未端氨基酸是蛋氨酸的原因在于前導序列可容易地用溴化氰處理除去。根據(jù)本發(fā)明中的方法，式(1)所示的單鏈DNA可分別合成，以使合成易行。
可將合成的、在13位上被取代了的、具有胃動素基因的雙鏈DNA分子用傳統(tǒng)方法插入諸如質(zhì)粒等載體中。例如，從大腸桿菌中取質(zhì)粒，純化之，用限制酶在特異位點酶切。用DNA連接酶把雙鏈DNA接于所切質(zhì)粒的裂解位點上，重建一含重組DNA的質(zhì)粒。進一步，根據(jù)本發(fā)明，可制備兩個或多個13取代胃動素樣基因串聯(lián)插入了的質(zhì)粒，方法是用兩種限制酶處理一插入了13取代胃動素樣基因的質(zhì)粒，在13取代胃動素樣基因上游處和質(zhì)粒上的另一處酶切，得一片段;另一含重組DNA的同種質(zhì)粒，用在內(nèi)部切第一個質(zhì)粒相同的限制酶處理，并用另一酶處理，該酶使13取代胃動素基因的下游處與前述上游處有相同的裂點。用DNA連接酶以串聯(lián)形式將所收集的片段在切點處相接，重建一質(zhì)粒。如果需要，重復此過程。在此情況中，13取代胃動素基因間最好與肽基因相連，如那些由天冬氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸組成的肽，因為，在用溴化氰從嵌合蛋白中分離出13取代胃動素樣多肽時，蛋氨酸位點將發(fā)生裂解，而在用肽鏈內(nèi)切酶(Asp-N)處理所得產(chǎn)物時，N未端的天冬氨酸也會發(fā)生裂解，于是便可得到不含多余肽殘基的13-位取代胃動素樣多肽。
用插入了一個或幾個胃動素樣基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一微生物或真核細胞，培養(yǎng)此微生物或真核細胞，可大量生產(chǎn)胃動素樣多肽。
由上可清楚看到，根據(jù)本發(fā)明的重組DNA其特征在于至少含6個不帶電的極性氨基酸殘基的前導多肽，在其C端與蛋氨酸相連，再在蛋氨酸后與13取代胃動素相連，胃動素13位上的氨基酸殘基不能是蛋氨酸和天冬氨酸。在此情況中，相應于13取代胃動素的多肽，最好有復數(shù)個并以串聯(lián)形式連接，而且每一13取代胃動素多肽間以具有天冬氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸序列的肽相連。
根據(jù)本發(fā)明的表達質(zhì)粒其特征在于，上述重組DNA是插于其中的。


圖1是一個說明，表明了制備含重組DNA的質(zhì)粒的步驟，質(zhì)粒中插入了一個胃動素基團。
圖2是與圖1相似的說明;但質(zhì)粒中以串聯(lián)形式插入了兩個胃動素樣基因。
圖3是一圖，顯示了用Magnus法測按本發(fā)明的方法所得的13-亮氨酸-胃動素(以下稱〔亮氨酸13〕-胃動素)、和按傳統(tǒng)方法所得純胃動素的消化道收縮活性，所得的結(jié)果。
現(xiàn)在，參照實例進一步在藥理活性上說明本發(fā)明。下面的例子涉及一胃動素樣多肽的制備方法，胃動素13位上的蛋氨酸被亮氨酸取代。但請注意，13位上氨基酸殘基不為蛋氨酸和天冬氨酸的其它13-取代胃動素樣多肽，都可用與例中類似的方法制備。
實施例(1)合成編碼具胃動素樣藥理活性的多肽的DNA。
已知人的胃動素有以下氨基酸序列
5101315Phe-Val-Pro-lle-Phe-Thr-Gly-Glu-Leu-Gln-Arg-Met-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln并且已知13位上的蛋氨酸對胃動素的活性幾乎沒有影響。
由此，下面式(2)所示的雙鏈DNA片斷包含了編碼〔亮氨酸13〕-胃動素氨基酸序列的核酸序列;編碼由一些不帶電的極性氨基酸殘基(蛋氨酸-蘇氨酸-蛋氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-天冬酰胺-絲氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-異亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸)組成的前導肽序列的核酸序列，此前導肽的編碼核酸經(jīng)蛋氨酸接于〔亮氨酸13〕-胃動素的編碼核酸的N端;以及編碼氨基酸序列(天冬氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-亮氨酸)的核酸序列，這最后一個核酸序列，是接在〔亮氨酸13〕-胃動素的編碼核酸的C末端上的。
式(2)5′AATTCATGACCATGATTACGAACTCAAACCAAAACCAAAACCAAAACCAAACCA3′GTACTGGTACTAATGCTTGAGTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGAAACCAGTCTTCATGTTCGTTCCGATCTTCACCTACGGCGAACTGCAGCGTCTTTTTGGTCTAGAAGTACAAGCAAGGCTAGAAGTGGATGCCGCTTGACGTCGAGGCAAGAAAAAGAGCGCAACAAAGGCCAGGACGGGATCCTTGTGATAACGTTCTTTTTCTCGCGTTGTTTCCGGTCCTGCCCTAGGACACTATTCGA
式(2)所示的雙鏈DNA的合成如下所述。
首先，用來自Pharmacia，瑞典，商品名為GeneAsembteu的DNA合成系統(tǒng)合成具有下列核酸序列的六條單鏈DNA。其中，DNA(3)與(8)、(4)與(7)、以及(5)與(6)，互為互補鏈，末端例外。
式(3)5′-AATTCATGACCATGATTACGAACTCAAACCAAAACCAAAACCAAAACCAAAACCAAAACCA式(4)5′-GATCTTCATGTTCGTTCCGATCTTCACCTACGGCGAACTGCAG式(5)5′-CGTCTGCAAGAAAAAGAGCGCAACAAAGGCCAGGACGGGATCCTGTGATA式(6)5′-AGCTTATCACAGGATCCCGTCCTGGCCTTTGTTGGGCTCTTTTTCTTG式(7)5′-CAGACGCTGCAGTTCGCCGTAGGTGAAGATCGGAACGAACATGAA式(8)5′-GATCTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTGAGTTCGTAATCATGGTCATG用多聚核苷酸激酶處理(3)-(8)式所示的每一單鏈DNA，使其5′末端磷酸化。然后使(3)與(8)、(4)與(7)以及(5)與(6)的每對互補DNA退火，制備三個雙鏈DNA。所得的雙鏈DNA用DNA連接酶以串聯(lián)形式相接，以制備上述(2)式所表示的DNA片段。
(2)將DNA片斷插入表達載體。
把按第(1)項中所述方法合成的DNA片斷插入表達載體的操作方法將參照圖1加以說明。
用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切可購到的、用于在大腸桿菌中表達的質(zhì)粒(-pkk223-3-，由瑞典Pharmacia出售)。在所得質(zhì)粒片段的端點上用DNA聯(lián)接酶接上合成的DNA片段，將質(zhì)粒片段重建成名為pkmol的環(huán)形質(zhì)粒。重建的質(zhì)粒被設計成能在Tac啟動子下游SD-序列的10個殘基后啟動一蛋白質(zhì)的合成，因而，如果將質(zhì)粒插入大腸桿菌，并以異丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)或其類似物培養(yǎng)，就可能產(chǎn)生蛋白。
請注意，重組載體上有限制酶BglⅡ和BamHⅠ的識別位點。
(3)建立有2個或多個〔亮氨酸13〕-胃動素基因的表達質(zhì)粒。
這點將參照圖2加以說明。
首先，用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ處理一按第(2)項中所述方法制得的質(zhì)粒(pKMO1)，在〔亮氨酸13〕-胃動素基因的上游、以及載體上酶切質(zhì)粒，得一片段。然后，用限制酶EcoRⅠ和BglⅡ處理另一質(zhì)粒(pKMO1)，使載體上的切點與第一個質(zhì)粒上的相同，另一切點在第一質(zhì)粒的〔亮氨酸13〕-胃動素基因的下游。用DNA連接酶將前述得自第一個質(zhì)粒的片段接于第二個質(zhì)粒片段的端點上，以重建一含兩個〔亮氨酸13〕-胃動素基因的質(zhì)粒，我們稱之為-pKMO2-。在此情況中，〔亮氨酸13〕-胃動素基因間通過編碼氨基酸序列天冬氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸的基因相連。
請注意，限制酶BamHⅠ形成的切點和限制酶BglⅡ形成的另一切點是用DNA連接酶連接起來的，因此，所得的連接部分即成為兩種限制酶均不可識別的位點。于是，通過重復進行前述酶切、連接操作，即可得一重組質(zhì)粒，它具有任意個數(shù)的〔亮氨酸13〕-胃動素基因，以串聯(lián)方式排列，且基因上游有經(jīng)蛋氨酸連接的前導多肽序列。
(4)生產(chǎn)含13-亮氨酸-胃動素的嵌合蛋白。
使用一個有插入子為四個串聯(lián)排列的〔亮氨酸13〕-胃動素基因的質(zhì)粒(PKMO4)。質(zhì)粒被大腸桿菌(JM105)攝入，所得轉(zhuǎn)化株用發(fā)酵器(D-型，由Able Co.制造)于30℃下在含氨芐青霉素(50μg/ml)的培養(yǎng)基中(例如，加入了0.5%圍涎皮氨酸的M9培養(yǎng)基)通氣培養(yǎng)。當AC60變?yōu)?.6～0.8時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，使之終濃度為1.5mM。
隨后，繼續(xù)培養(yǎng)16小時以上，并離心(8000rpm，4℃，5分鐘)收集細胞。取部分細胞用SDS聚丙烯酰胺凝膠(15%)電泳分析，發(fā)現(xiàn)所要的嵌合蛋白占總蛋白的30%。推測，這一良好的結(jié)果是由于插在質(zhì)粒中的合成DNA中的前導多肽序列極為有效地加速了包涵體的形成，這些包涵體對蛋白酶極其穩(wěn)定。
(5)〔亮氨酸13〕-胃動素的分離和純化將第(4)項所述方法得到的細胞團(100ml)懸浮在300ml 10mM的PBS-EDTA(pH8.0)中，超聲處理懸液以破碎細胞，細胞殘渣通過離心處理(18000rpm，30分鐘)使之沉淀，所得沉淀中包含了具有前導多肽和〔亮氨酸13〕-胃動素四聚體的合蛋白。
因此，將碎片(蛋白量約100mg)溶于30ml7%的甲酸中。向溶液里加入30mg溴化氰，在低于37℃的條件下反應一夜。隨后，加入(200ml)蒸餾水，并冷凍干燥除去甲酸和溴化氰。所得干粉溶于0.1%的三氟乙酸中，并除去不溶物。所得溶液在下面條件下進行高壓液相層析。
柱MicropondasphereC-18(3.9mm×15cm，WatersCo制造)流速0.8ml/min洗脫溶解在0.1%三氟乙酸中的乙酰亞硝酸的線性濃度梯度為從5%到70%(40min)分段收集高壓液相層析所得主峰部分，冷凍干燥之。取一部分干粉(100μg)溶于50mM磷酸緩沖液中(pH8.0，100μl)，向其中加入0.1μg蛋白內(nèi)切酶Asp-N(西德Behringer Manheim GmbH售)后，溶液在37℃下反應16小時以上。反應液在前述條件下進行高壓液相層析，得到作為主峰成份的所需〔亮氨酸13〕-胃動素。
這一〔亮氨酸13〕-胃動素的核酸序列以Bio-System Co.售的肽序列儀進行檢測發(fā)現(xiàn)它的序列是正確的。
通過上述過程發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)1升大腸桿菌可得到400～500mg所需的胃動素樣多肽。
生物活性試驗(測定腸道收縮活性)按Magnus法，用兔十二指腸測試驗樣品和對照樣品的腸道收縮活性〔“J.Pharm.Pharmac.”Vol.28，pages650-651(1976)〕，以例中所得的〔亮氨酸13〕-胃動素作為待測樣品，以傳統(tǒng)提取方法所得的純胃動素作為對照樣品。結(jié)果如圖3所示。
從圖中清楚地看到，已證實，當把乙酰膽堿(10-6M)引起的收縮定為100%時，由本發(fā)明中的方法所得的〔亮氨酸13〕-胃動素具有與純胃動素相同的腸道收縮活性。
權(quán)利要求
1.制備式(1)胃動素樣多肽的方法，Phe-Val-Pro-lle-Phr-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-Alg-X-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln式(I)其中X是除蛋氨酸和天冬氨酸之外的氨基酸殘基。這一方法包括合成一含有至少6個不帶電的極性氨基酸殘基，且末端為蛋氨酸的單鏈DNA、它的互補單鏈DNA、一編碼(1)式氨基酸序列的單鏈DNA、它的互補單鏈DNA；用所得的四條單鏈DNA合成雙鏈DNA，以編碼不帶電的極性氨基酸殘基的DNA片斷及其互補片段作為前導序列；在每一所得雙鏈DNA片段的末端加上特異性限制酶的識別位點；用所述限制酶裂解一具有其它蛋白遺傳信息的質(zhì)粒；將上述雙鏈DNA片段接于裂解質(zhì)粒的每一切點上，以重建一含重組DNA的質(zhì)粒；用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一微生物；培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化菌株，生產(chǎn)作為嵌合蛋白一部分的、具有(1)式所示氨基酸序列的多肽；將微生物破碎，用溴化氰和肽鏈內(nèi)切酶處理嵌合蛋白，以分離式(1)所示多肽；分步純化多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中不帶電的極性氨基酸殘基系選自由天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、和絲氨酸組成的一組氨基酸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中含合成的13-取代胃動素樣基因插入子的所述重組質(zhì)粒被兩種限制酶處理，得一質(zhì)粒片段，此片段是在13-取代胃動樣基團的上游處、及質(zhì)粒上的另一位點處被切下的;另一相同的重組質(zhì)粒用一與在內(nèi)部切第一個質(zhì)粒相同的限制酶處理，并用另一酶處理，該酶使13-取代胃動素樣基因的下游與前述上游有相同的切點，得到第二個質(zhì)粒片段，用DNA連接酶將第二個質(zhì)粒片斷連于第一個質(zhì)粒片段上，重建一質(zhì)粒，它含有2個串聯(lián)排列的13-取代胃動素基因，根據(jù)需要重復裂解、連接操作，以插入所需數(shù)目的胃動素樣基因。
4.制備胃動素樣多肽的重組DNA，它必須具有由至少6個不帶電的極性氨基酸殘基組成的前導多肽序列、至少一個相應于13取代胃動素的多肽，其中13位上的氨基酸殘基不能是蛋氨酸和天冬氨酸，后一多肽經(jīng)蛋氨酸與所述前導肽的下游相連。
5.一制備胃動素樣多肽的表達載體，其中重組DNA插于其中，此DNA必須包含由至少6個不帶電的極性氨基酸殘基組成的前導多肽序列、至少一個相應于13取代胃動素的多肽，其中13位上的氨基酸殘基不能是蛋氨酸和天冬氨酸，后一多肽經(jīng)蛋氨酸與所述前導肽的下游相連。
全文摘要
胃動素樣多肽、有關的重組DNA及插入了重組DNA的質(zhì)粒的制備方法。
文檔編號C12N15/16GK1040822SQ8910650
公開日1990年3月28日 申請日期1989年8月23日 優(yōu)先權(quán)日1988年8月24日
發(fā)明者黑野昌庸, 三谷隆彥, 高橋治雄, 田中健一, 藤村克也, 澤井喜一 申請人:株式會社三和化學研究所