專利名稱：：消毒監(jiān)測(cè)用生物指示劑及生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種在消毒監(jiān)測(cè)中應(yīng)用的生物指示劑及其生產(chǎn)方法。近一個(gè)世紀(jì)以來，用生物學(xué)方法測(cè)定消毒效果已有很大的發(fā)展，生物指示劑在滅菌質(zhì)量控制中的作用日益為人們所重視世界無菌醫(yī)用產(chǎn)品管理法規(guī)中強(qiáng)調(diào)了使用生物指示劑的重要性，美國藥典在1985年第21版中單獨(dú)以“生物監(jiān)測(cè)器”為一章節(jié)，詳細(xì)地?cái)⑹霾⒘谐觥吧锉O(jiān)測(cè)器”的生物紙片標(biāo)準(zhǔn)。蘇聯(lián)使用染菌布片、日本用染菌濾紙為指示菌片，西德衛(wèi)生學(xué)和微生物學(xué)協(xié)會(huì)推薦以棉布為帶菌載體。我國自五十年代從蘇聯(lián)引進(jìn)染菌布片一直沿用至今。但國內(nèi)外采用的染菌布片和染菌濾紙片由于將消毒指示菌液直接滴染、浸染或噴染在布片或?yàn)V紙片上，大都存在以下缺點(diǎn)由于載體表面性質(zhì)不同，即使同一種材料，其染菌量的差異也很大，而且在消毒處理后的殘存活菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)檩d體的不溶性，留在材料縫隙中的細(xì)菌也不能全部釋放出來，影響活菌回收率，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定，重復(fù)性差。因此不易達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化，很難對(duì)消毒藥械和醫(yī)療用品無菌質(zhì)量嚴(yán)格加以控制，嚴(yán)重影響了我國消毒科研工作的進(jìn)展。為此我們認(rèn)為建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的新型生物指示劑是發(fā)展我國消毒事業(yè)的關(guān)鍵所在。本發(fā)明的目的在于避免上述技術(shù)中的不足之處而提供一種標(biāo)準(zhǔn)的、使用方便的、重復(fù)性良好的可溶性生物指示劑及其生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到消毒指示菌我們采用白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus8032)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC6538)、糞鏈球菌(StreptococcusfaeciumATCC19581)、枯草桿菌芽孢黑色變種(B.subtilisvar.nigerATCC9372)、短小桿菌芽孢(B.pumilusE601)、蠟狀桿菌芽孢(B.cereusSSI，C1/1)、嗜熱脂肪桿菌芽孢(B.stearothermophilusSSI，K31)。將四種芽孢桿菌接種于TGY瓊脂(含胨0.5%，消旋葡萄糖0.1%，酵母浸液0.3%，瓊脂1.8%)，除嗜熱脂肪芽孢桿菌培養(yǎng)于56℃、3-5天外，其余三種芽孢均在37℃下培養(yǎng)2-5天，用蒸餾水洗下菌苔，共洗三次，于4℃冰箱保存。三種細(xì)菌繁殖體均用普通瓊脂在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，菌苔用0.03M磷酸鹽緩沖液洗下，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，芽孢和繁殖體均為第四代培養(yǎng)物。將菌液加入可溶性基質(zhì)中混勻，其中可溶性基質(zhì)由0.5%-2%明膠、0.5%-2%聚乙二醇、0.5%-1%丙三醇和0.03M磷酸鹽緩沖液配制，然后以105-106個(gè)菌為一滴加在無菌透明塑料紙或透明塑料膜上，最好使每滴的量為45-55μl，然后在溫度為18-28℃、濕度為50%-70%的條件下干燥后，用塑料膜密封或收集于玻璃瓶中。下面是對(duì)該種生物指示劑(簡稱菌膜)的穩(wěn)定性、特點(diǎn)等進(jìn)行的試驗(yàn)。以10倍遞減稀釋法作活菌計(jì)數(shù)，每片菌膜含菌量用菌落形成單位(CFU)/片表示。一.菌膜間含菌量的差異用可溶性基質(zhì)制備的菌膜含細(xì)菌繁殖體為8.4×105-8.0×106CFU/片;芽孢為4.4×10-5.1×10CFU/片。以白色葡萄球菌菌膜為例經(jīng)29次試驗(yàn)共檢查菌膜159片，包括操作技術(shù)的誤差在內(nèi)，每片間活菌數(shù)的誤差率在10%以下占檢查菌膜總數(shù)的87.9%。二.菌膜活菌的回收按比例配制成的菌膜液與干燥后的菌膜分別進(jìn)行活菌數(shù)比較及t測(cè)驗(yàn)，證明制膜和干燥過程對(duì)以上幾種細(xì)菌存活影響不大，均無顯著性差異。除借狀桿菌芽孢回收率稍低(65.86%)以外，其余各種菌膜回收率均在80%以上，高者達(dá)98.65%。三.菌膜的穩(wěn)定性對(duì)保存于室溫(18-20℃)和冰箱(4℃)的白色葡萄球菌菌膜，每周作活菌計(jì)數(shù)共進(jìn)行13周的觀察，證明冰箱內(nèi)保存的菌膜較室溫保存的更為穩(wěn)定，歷時(shí)3個(gè)月后每片菌膜中的活菌數(shù)仍保持在106CFU以上。金黃色葡萄球菌于4℃下保持3個(gè)月后活菌率略有下降的趨勢(shì)，芽孢保持于冰箱中活菌數(shù)亦無明顯的變化。5種菌膜的穩(wěn)定性比較</tables>金黃色葡萄球菌菌膜在7500ppm石炭酸作用下其抵抗力不低于制膜前的菌液。在60℃環(huán)境中菌膜與菌液的穩(wěn)定性相同。用枯草桿菌芽胞黑色變種制備的菌膜經(jīng)四周保存對(duì)二氯異氰尿酸鈉的抵抗力均為7500ppm，30分鐘。金黃色葡萄球菌菌膜對(duì)7500ppm石炭酸需24-26分鐘，保存五周后其抗力不變。用1×106CFU/ml白色葡萄球菌菌液，按0.01ml/片染菌量，制備的0.5×1.0cm大小的“試驗(yàn)菌布”活菌計(jì)數(shù)為3×103CFU/片，于室溫保存一周后，每片為0.7×102CFU，冰箱保存者為1.2×102CFU，有96%-98%的活菌衰亡或損失。四.菌膜在消毒監(jiān)測(cè)上的應(yīng)用我們對(duì)各種菌膜除用于化學(xué)液體消毒劑的定性監(jiān)測(cè)外還進(jìn)行了以下方面的監(jiān)測(cè)。1.對(duì)紫外線消毒的監(jiān)測(cè)用UVR-254型紫外線強(qiáng)度計(jì)測(cè)定并調(diào)節(jié)照射距離到所需照射強(qiáng)度，將菌膜置于無菌平皿中暴露于不同照射強(qiáng)度下計(jì)算其殺滅率。2.對(duì)微波消毒的監(jiān)測(cè)將菌膜分別放到16×16×8cm大小敷料包中部，外用濕毛巾包裹，在輸出功率為650W微波作用下，白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌及糞鏈球菌于4分鐘內(nèi)死亡，嗜熱桿菌芽孢需10分鐘作用后才能全部殺死。3.對(duì)高壓蒸汽滅菌的監(jiān)測(cè)因菌膜遇水即溶化，在高壓蒸汽滅菌時(shí)將菌膜分別放在無菌空試管中，置于預(yù)消毒的物品中部，消毒后將液體培養(yǎng)基倒入菌膜管中然后培養(yǎng)，結(jié)果證明15磅20分鐘殺滅白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、枯草桿菌芽孢、蠟狀桿菌芽孢及短小桿菌芽孢，而嗜熱脂肪桿菌芽孢卻需增加到20磅或延長到30分鐘才能滅活。4.對(duì)氣體消毒劑消毒效果的監(jiān)測(cè)將菌膜分別置于無菌平皿中，在體積為0.15m3木箱和9立升干燥缸內(nèi)進(jìn)行氣體消毒試驗(yàn)(室溫20℃，相對(duì)濕度80%)選用10%戊二醛，劑量1.06ml/立升，作用40小時(shí)后對(duì)白色葡萄球菌、糞鏈球菌及蠟狀桿菌、短小桿菌、嗜熱脂肪桿菌的三種芽孢有殺滅作用。用0.05ml/立升福爾馬林經(jīng)22小時(shí)作用，除對(duì)以上五種細(xì)菌蘩殖體和芽孢有殺滅作用外，并對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌芽孢也有滅活作用。我們還應(yīng)用26克/m3酸氯作煙熏消毒試驗(yàn)，作用30分鐘對(duì)白色葡萄球菌殺滅32%，1小時(shí)后可達(dá)77%。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明用可溶性基質(zhì)制備的菌膜作生物指示劑，對(duì)紫外線、微波、高壓蒸汽及氣體消毒劑的消毒效果測(cè)定是適用的。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)1.菌數(shù)恒定2.回收率高3.試驗(yàn)的重復(fù)性好4.載體對(duì)消毒劑消耗率低5.可長期保存6.使用方便7.長途運(yùn)輸不污染環(huán)境8.成本低廉9.可標(biāo)準(zhǔn)化大量生產(chǎn)。本發(fā)明下面將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述將金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureusATCC6538)用普通瓊脂在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，菌苔用0.03M磷酸鹽緩沖液洗下，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｓ?.03M磷酸鹽緩沖液配制1×109個(gè)/ml的菌液，將可溶性基質(zhì)(明膠1%，聚乙二醇1%，丙三醇0.5%，0.03M磷酸鹽緩沖液)100ml與2ml菌液混合后，以50微升一滴加在無菌透明塑料膜上，25℃，RH50%的條件下干燥，用塑料膜密封。權(quán)利要求1.一種消毒監(jiān)測(cè)用生物指示劑，其特征在于它是由消毒指示菌和可溶性基質(zhì)制成的菌膜，可溶性基質(zhì)包括明膠、聚乙二醇和丙三醇。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物指示劑，其特征在于每個(gè)菌膜含105-106個(gè)指示菌。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物指示劑，其特征在于可溶性基質(zhì)由0.5-2%明膠、0.5-2%聚乙二醇、0.5-1%丙三醇和0.03M磷酸鹽緩沖液組成。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物指示劑，其特征在于上述菌膜密封于透明塑料紙或透明塑料膜里。5.一種消毒監(jiān)測(cè)用生物指示劑的生產(chǎn)方法，包括將消毒指示菌培養(yǎng)后，用0.03M磷酸鹽緩沖液或蒸餾水配成菌液，其特征在于將上述菌液加入可溶性基質(zhì)中，可溶性基質(zhì)由0.5-2%明膠、0.5-2%聚乙二醇、0.5-1%丙三醇和0.03M磷酸鹽緩沖液組成，然后將上述混合液滴加于無菌透明塑料紙或透明塑料膜上，干燥成菌膜后密封。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于菌膜是在溫度18-28℃、濕度50-70%的條件下干燥的。7.一種如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于滴加可溶性指示菌液時(shí)每一滴的含菌量為105-106個(gè)。8.一種如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于每一滴的量為45-55μl。全文摘要本發(fā)明涉及一種在消毒監(jiān)測(cè)中用的生物指示劑及其生產(chǎn)方法，其目的是為了能準(zhǔn)確判定消毒滅菌的真實(shí)效果，其主要技術(shù)方案是將消毒指示菌液加入一種可溶性基質(zhì)中，然后將該混合液滴加于無菌透明塑料紙或透明塑料膜上，于適當(dāng)溫度和濕度下干燥制成菌膜，用于監(jiān)測(cè)消毒滅菌的效果。文檔編號(hào)C12Q1/14GK1049029SQ9010075公開日1991年2月6日申請(qǐng)日期1990年2月19日優(yōu)先權(quán)日1990年2月19日發(fā)明者祝慶荃,袁洽劻,胡桂蘭,何來英,劉中夫申請(qǐng)人:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所