專利名稱：As499酶菌提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于固氮菌類，是指綠氮酶菌的提取方法。
目前國(guó)外應(yīng)用重組DNA技術(shù)開發(fā)了12種氨基酸產(chǎn)生菌，參見(分開特許公報(bào)186、496、1982年)、(JP59-210、887、1984年)及(JP60-62、994、1985年)等，但沒有應(yīng)用重組DNA技術(shù)提取綠氮酶菌的新菌株方法，因此關(guān)于應(yīng)用重組DNA技術(shù)提取綠氮酶菌的方法尚未見報(bào)導(dǎo)。
綠氮酶菌是熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006，和野生豆科植物的根瘤菌，應(yīng)用重組DNA技術(shù)進(jìn)行氨基酸產(chǎn)生菌的定向育種，打破種、屬界限，把不同菌株的優(yōu)良性集中到一株菌上，選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、易人工生產(chǎn)的超級(jí)生產(chǎn)菌。
本發(fā)明的目的是提供一種具有固定土壤中的含氮量，運(yùn)用微生物的自由擴(kuò)散，協(xié)助擴(kuò)散，主動(dòng)運(yùn)輸功能，改良土壤的在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏的綠氮酶菌，保藏編號(hào)為0153，以及綠氮酶菌的提取方法。
本發(fā)明的主要技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的綠氮酶菌，保藏編號(hào)為0153。它的科學(xué)描述為綠氮酶菌，類似橢圓形細(xì)胞。
綠氮酶菌結(jié)構(gòu)與功能綠氮酶菌(0153)化學(xué)結(jié)構(gòu)為
構(gòu)成橢圓形細(xì)胞的化合物有兩大類，第一類為無機(jī)物，水(占80～90%)，無機(jī)鹽(占1～1.5%);第二類為有機(jī)物，蛋白質(zhì)(占7～10%)，核酸加糖類(占1～1.5%)，脂類(占1～2%)。
橢圓形細(xì)胞周圍綠點(diǎn)類似載體(酶)起自由擴(kuò)散，被選擇吸收的物質(zhì)從高濃度一邊吸到低濃度一邊;載體(酶)還起協(xié)助擴(kuò)散，將自由擴(kuò)散所不能吸收物質(zhì)，從高濃度一邊吸收到低濃度一邊，在載體的協(xié)助下，細(xì)胞消耗一定能量，主動(dòng)地選擇吸收所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。它可以把物質(zhì)從低濃度一邊吸收到高濃度一邊，也可以把物質(zhì)從高濃度一邊吸收到低濃度一邊，但是速度要比協(xié)助擴(kuò)散得多。
本發(fā)明利用載體(綠色小點(diǎn)即酶)的主動(dòng)運(yùn)輸功能，增加“特種”培養(yǎng)基(養(yǎng)料)。在加速載體(綠點(diǎn)一酶)的自身增殖的同時(shí)，又給橢圓形細(xì)胞主動(dòng)運(yùn)輸養(yǎng)料，又加速橢圓形細(xì)胞分裂增殖，生成二代酶菌，由增殖后二代酶菌去發(fā)酵傳統(tǒng)的有機(jī)肥料，去發(fā)酵農(nóng)業(yè)“廢棄物”和城市“垃圾”達(dá)到綜合利用，減少污染，改良土壤，固定土壤中的含氮量，滿足植物生產(chǎn)期所必需的營(yíng)養(yǎng)成份。
本發(fā)明提取技術(shù)的方法是指綠氮酶菌(0153)菌種來源，利用熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006，和分離野生豆科植物的根瘤菌，應(yīng)用重組DNA技術(shù)，優(yōu)選種子培養(yǎng)基為葡萄糖3%，玉米漿1.5%，稀土催酶尿素0.4%，KH2PO4 0.4%，MgSO4·7H2O 0.1%，PH6.5。進(jìn)行氨基酸產(chǎn)生菌的定向育種，把不同菌種的優(yōu)良性集中到一株菌上，選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、易人工生產(chǎn)的超級(jí)生產(chǎn)菌，它不僅可以打破種、屬的界限，而且對(duì)于闡明氨基酸產(chǎn)生菌的遺傳體系，進(jìn)行了基因定位。
應(yīng)用重組DNA技術(shù)提取綠氮酶菌(0153)材料和方法的實(shí)施例。
菌種熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006，和分離野生豆科植物的根瘤菌。
斜面培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法斜面培養(yǎng)基(g)溶菌酶(蛋殼提取)10，蛋白胨10，NaCL5，無菌水1000ml，PH6.5，將“1”的菌種移接于斜面上，30℃培養(yǎng)48小時(shí)。
種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法原種子培養(yǎng)基(g)葡萄糖30，玉米漿15，稀土催酶尿素4，KH2PO44，MgSO43，無菌水1000ml。PH6.5，取一杯已活化菌苔，接入種子培養(yǎng)基(250ml的三角玻璃瓶裝量25ml)中，30℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。
發(fā)酵培養(yǎng)及培養(yǎng)方法發(fā)酵培養(yǎng)基(g)葡萄糖200，酵母膏6，蔗糖400，玉米漿14，稀土催酶尿素6，MgSO4·7H2O0.5，KH2PO41，CaCO37.4，自來水2000ml，PH6.5，裝入無菌缸內(nèi)，進(jìn)行酶促反應(yīng)，溫度24-26℃，培養(yǎng)144小時(shí)，即生育成綠氮酶菌(0153)。
綠氮酶菌(0153)分析方法用國(guó)產(chǎn)精密PH試紙測(cè)定PH(6.5)，液體種子吸光度測(cè)定將種液用蒸餾水稀釋20倍，采用國(guó)產(chǎn)721型分光度計(jì)測(cè)定吸光度A690nm(0.38～0.51)。
用1200倍光學(xué)顯微鏡按4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、32小時(shí)、48小時(shí)、……，分期觀查，種子菌增殖情況。
培育綠氮酶菌(0153)及其培養(yǎng)基最優(yōu)化成份配比經(jīng)過L8(27)正交試驗(yàn)獲得的。
綠氮酶菌(0153)液與有機(jī)物草炭混合時(shí)所測(cè)得的分析結(jié)果為有機(jī)質(zhì)9.39%，全氮10.51%，速效氮2.80PPm，全磷0.048P2O5%，速效磷3.26PPm，速效鉀6.00%。
因此應(yīng)用綠氮酶菌(0153)液生產(chǎn)有機(jī)肥料，原料資源廣泛?？蓪?shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)“廢棄物”、城市“垃圾”，及傳統(tǒng)農(nóng)家肥、草炭等“廢棄物”的綜合利用，減少污染。用綠氮酶菌生產(chǎn)的有機(jī)肥，含氮量高(40-50)，植物所必需的微量原素，含量較全，酶促功能，光合作用直接植物綜合利用，具體蓄水功能，抗旱、抗災(zāi)、肥效長(zhǎng)、改善植物品質(zhì)，增加營(yíng)養(yǎng)成份含量。
權(quán)利要求
1.一種綠氮菌提取方法的特征在于利用保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏的綠氮酶菌菌株(0153)作為這樣的微生物及綠氮酶菌(0153)的提取方法。
2.按權(quán)利要求1所述的綠氮酶菌提取方法，其特征在于a、菌種為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006和自己分離野生豆科植物的根瘤菌;b、斜面培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法斜面培養(yǎng)基(g)溶菌酶(蛋殼提取)10，蛋白胨10，NaCL5，無菌水1000ml，PH6.5，將“1”的菌種移接于斜面上，30℃培養(yǎng)48小時(shí);c、種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法為原種子培養(yǎng)基(g)葡萄糖30，玉米漿15，稀土催酶尿素4，KH2PO44，MgSO33，無菌水1000ml，PH6.5，取一杯已活化菌苔，接入種子培養(yǎng)基(250ml的三角玻璃瓶裝量25ml)中，30℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中;d、發(fā)酵培養(yǎng)及培養(yǎng)方法為發(fā)酵培養(yǎng)基(g)葡萄糖200，酵母膏6，蔗糖400，玉米漿14，稀土催酶尿素6，MgSO4·7H20.5，KH2PO41，CaCO37.4，自來水2000ml，PH6.5，裝入無菌缸內(nèi)，進(jìn)行酶促反應(yīng)，溫度24-26℃，培養(yǎng)144小時(shí)，即生育成綠氮酶菌(0153)。
全文摘要
本發(fā)明屬于固氮菌類，綠氮酶菌(0153)的提取方法是采用熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)K1006和分離野生豆科植物的根瘤菌作為菌種，應(yīng)用重組DNA技術(shù)，優(yōu)選最佳種子培養(yǎng)基為葡萄精3％、玉米漿1.5％、稀土催酶尿素0.4％、KH
文檔編號(hào)C12N1/20GK1055388SQ9010185
公開日1991年10月16日 申請(qǐng)日期1990年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1990年4月6日
發(fā)明者溫玉成, 劉永禮 申請(qǐng)人:溫玉成