專利名稱：羧基酯酶的穩(wěn)定化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及羧基酯酶的穩(wěn)定化。
美國專利4，886，750號公開了酯酶在立體選擇性水解α-芳基丙酸酯中的使用。該文獻中，該酶的特征在于負責水解(S)-甲氧基甲基萘乙酸酯。相應的酯酶基因是由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Thai1-8菌株(CBS679.85)中得到的。已將編碼負責立體選擇性轉化(R，S)-甲氧基甲基萘乙酸酯之酶的基因克隆到大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中。發(fā)現在幾株枯草芽孢桿菌(a.O.CBS673.86)中導入多個基因拷貝可改善酯酶活性。因而該微生物和由之得到的酶在水解S-甲氧基甲基萘乙酸酯的方法中的適用性也得到了改善。
在所說的美國專利中，只能使用低底物濃度〔甲氧基甲基萘乙酸(naproxen)或羥基甲基甲丙基苯乙酸(ibuprofen)〕。與之相反，為了獲得更大的經濟效益，商業(yè)應用上要求有高產物濃度。但在進行高底物濃度試驗時，發(fā)現在這樣高底物濃度的工業(yè)生產條件下，會使酶發(fā)生不可逆的失活。例如，當加入30g/升甲氧基甲基萘乙酸酯時(pH＝9，T＝40℃，吐溫80(TM)基質)，由枯草芽孢桿菌ThaiⅠ-8得到的羧基酯酶在1小時內幾乎完全失活。即該酯酶在pH＝9和T＝40℃(有或沒有吐溫80(TM))的條件下，只穩(wěn)定幾個小時。在立體選擇性水解(R，S)-甲氧基甲基萘乙酸酯期間，酶被水解過程中形成的甲氧基甲基萘乙酸滅活。因此不能獲得高產率的甲氧基甲基萘乙酸。
該羧基酯酶可用于其他幾個立體選擇性酯酶水解反應中。但發(fā)現當以商業(yè)上有利的初始酯濃度進行反應時，這些反應的產物(酸)常常使酶失活。
歐洲專利申請0299559號中述及，可使用羧基酯酶立體特異性水解二氯苯氧基苯氧基丙酸酯(diclofopesters)，產生相應的對映體純(S)-酸。在商業(yè)上有利的轉化條件下，所形成的二氯苯氧基苯氧基丙酸會使酶失活。
其他可導致酶失活的化合物有2-萘氧基乙酸、羥基甲基甲丙基苯乙酸(ibuprofen)、2-萘酚和苯酚。
據文獻所述，因為這些酶對熱的穩(wěn)定性差，所以會逐漸失去活性。在升高的溫度下，該酶分子可發(fā)生伸展。特別是熱處理可使氫鍵斷裂(如參見R.D.Schmid，AdvancesinBiochemicalEngineering12，Ghose，Fiechler&Blakebrough(Eds)，Springer，Berlin(1979)PP.41-115)。但通過對酶的固定化或交聯，可使其熱伸展程度減少。例如，與戊二醛交聯可改善木瓜蛋白酶(Royeretal，FEMSLett.80(1977)1)和枯草桿菌肽酶(Boudrantetal，Biotechnol.Bioeng.18(1976)1719)的熱穩(wěn)定性。
有關熱穩(wěn)定化的機理目前尚不清楚。E.T.Reese和M.Manders(Biotechnol.Bioeng.22(2)1980，PP.326-336)的實驗表明，交聯(戊二醛處理)并不能提高纖維素酶的熱穩(wěn)定性和活性。N.W.Ugarova(Biokhimiya42(7)，1977，PP.1212-1220)也得到相似的結果，作者述及，用戊二醛修飾過氧化物酶，使其熱穩(wěn)定性降低2.5倍。
現有技術只提出用很特異的方法解決特定的問題(固定化和交聯技術)，而沒有提到普遍適用的方法。另外，已注意到在正常反應條件下(至多45℃)羧基酯酶并不能被熱失活，但在這些反應條件下只能被某些化合物失活。現有技術對這類失活作用無能為力。
如果知道哪個氨基酸殘基可引起蛋白質失活，則可考慮另一種化學修飾方法。如Ausubel等人(CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&SonInc，1987，NewYork)所述，在這種情況下，可通過定點誘變用一個氨基酸殘基代替另一個氨基酸殘基。在該方法中，可用絲氨酸殘基取代蛋氨酸殘基，以改善嗜堿桿菌(B.alcalophilus)絲氨酸蛋白酶的抗氧化能力(歐洲專利申請0328229號)。
已知的穩(wěn)定化技術并不能應用于羧基酯酶，因為此時失活是由相應化合物引起的，即對其失活作用的性質與其他酶不同。
本發(fā)明涉及修飾的羧基酯酶，在某些化合物如甲氧基甲基萘乙酸的存在下，其穩(wěn)定性得以提高，并可用于這些化合物的立體特異性水解作用。因此，本發(fā)明提供了一種立體特異性地水解旋光活性底物的方法，該方法包括在羧基酯酶的存在下水解底物，所說的酯酶與野生型酶相比，于40℃下與15mg/ml(S)-甲氧基甲基萘乙酸接觸1.5小時時，表現有提高的穩(wěn)定性。可通過取代或修飾野生型羧基酯酶的至少一個堿性氨基酸殘基而得到該修飾的羧基酯酶。


圖1顯示得自枯草芽孢桿菌ThaiⅠ-8(CBS679.85)之羧基酯酶基因的編碼區(qū)的核苷酸順序;
圖2顯示野生型羧基酯酶和幾種突變羧基酯酶的活性;
-·-野生型羧基酯酶-+-Lys34Glu突變型-＊-Lys81Glu突變型-X-Lys217Glu突變型圖3顯示甲醛處理對羧基酯酶活性的影響;
-·-甲醛處理后-+-甲醛和甲氧基甲基萘乙酸處理后圖4顯示使用羧基酯酶和修飾的羧基酯酶轉化甲氧基甲基萘乙酸的結果。
-·-未修飾的酶-+-戊二酸酐修飾的-＊-琥珀酸酐修飾的-□-乙二醛修飾的-×-戊二醛修飾的-◇-甲醛修飾的圖5顯示分別用羧基酯酶和修飾的羧基酯酶轉化(R，S)-二氯苯氧基苯氧基丙酸乙酯的結果。
本申請說明書中使用的術語“羧基酯酶”是指可得自芽孢桿菌菌株并能夠立體特異性地水解(S)-甲氧基甲基萘乙酸的酯酶。
羧基酯酶在高至45℃的溫度下是穩(wěn)定的。在甲氧基甲基萘乙酸等化合物存在下，該酶將很快被失活。于40℃存在15mg/ml(S)-甲氧基甲基萘乙酸時，酶活性在1.5小時內大部分喪失。酶活性的喪失伴有酶分子的聚集。已發(fā)現這種失活或去穩(wěn)定化作用并不是由于熱失活，而是與甲氧基甲基萘乙酸等化合物對酶的化學作用有關。本發(fā)明是基于羧基酯酶中帶正電荷的氨基酸殘基參予去穩(wěn)定化作用這一發(fā)現而完成的?？赡苁羌籽趸谆烈宜崤c酶表面上的游離氨基反應，從而使得甲氧基甲基萘乙酸的疏水部分干擾酶的折迭。如在甲氧基甲基萘乙酸存在下，增加了酶對蛋白水解作用的敏感性，便會出現這種伸展現象。經取代(蛋白質工程)或化學修飾這些堿性殘基后，即可除去或轉換這些氨基酸的正電荷。這樣就能阻止甲氧基甲基萘乙酸與酶的結合。就這一點來說，可知只有小的和親水性不大的化學基團能用于修飾這種酶。例如，苯甲醛對酶的穩(wěn)定性就沒有積極作用。另外，將帶正電荷的殘基改變成帶正電荷但對化學修飾不大敏感的其他殘基，如將賴氨酸換成精氨酸(如參見R.D.Schmid，AdvancesinBiochemicalEngineering12，Ghose，Fiechler&Blakebrough(Eds)，Springer，Berlin(1979)，41-115)可能會提高酶的穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明還提供了一種經過修飾的羧基酯酶，該酶是用至少含有一個能與羧基酯酶中帶正電荷堿性氨基酸殘基反應之基團的化合物處理野生型羧基酯酶而產生的。使用該酶可提高產物濃度和產率。用于處理羧基酯酶的化合物包括醛(一醛或二醛)如甲醛、戊二醛或乙二醛，酐如戊二酸酐或琥珀酸酐等。
加到含野生型羧基酯酶中之反應混合物中的化合物(穩(wěn)定劑)的濃度一般占反應混合物的0.05-10%(V/V)，優(yōu)選比例為0.1-5%(V/V)。酶穩(wěn)定化處理期間pH至少為7，優(yōu)選pH范圍為7-10。
在加入醛或酐類化合物后，基本上所有的羧基酯酶均得到穩(wěn)定化。使用甲醛、單醛或酐能使酶得到穩(wěn)定化這一事實表明，酶是受到了甲醛或酐的化學修飾而不是發(fā)生了分子內交聯。
根據本發(fā)明的另一個方面，其提供了一種新酶，具體地說是經過修飾的羧基酯酶，它是通過表達編碼所說酶的基因而得到的，它至少有一個堿性氨基酸殘基不同于相應的野生型酶，并且在應用時顯示出改善了的特性，已令人驚異地發(fā)現，某些賴氨酸、精氨酸和組氨酸殘基參予了羧基酯酶的失活。
因此，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定化的或經過修飾的酶，特別是穩(wěn)定化或修飾了的羧基酯酶，該酶是經取代相應野生型酶中的至少一個堿性氨基酸，并表達該突變型基因而產生的或借助某些化合物的作用修飾其堿性氨基酸。
在確定羧基酯酶的DNA順序后(見實施例1)，使用定點誘變技術(Ausubeletal.，1987，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&SonInc.，Newyork)使該酯酶基因發(fā)生突變而取代其中的賴氨酸、精氨酸和組氨酸殘基。以這種方法，即可用例如中性(不帶電荷的)或帶負電荷的氨基酸殘基(如谷氨酰胺、絲氨酸或谷氨酸)取代帶正電荷的堿性賴氨酸和/或精氨酸殘基。也可用這種方法，由其他殘基取代參予羧基酯酶去穩(wěn)定化的其他殘基(如組氨酸)。
經修飾的酶在工業(yè)應用如水解甲氧基甲基萘乙酸酯的生產工藝中表現有改善的功能特性。本文中所說的改善的功能特性是指因改善了穩(wěn)定性，特別是相對于野生型酶來說，改善了對某些化合物的穩(wěn)定性而得到高的轉化性能。
“羧基酯酶”是指可得自芽孢桿菌屬菌株的、能夠立體特異性水解S-甲氧基甲基萘乙酸酯的酯酶。其較好是與可得自枯草芽孢桿菌菌株的酯酶基本相同或完全相同的酶，且最好是與可得自枯草芽孢桿菌ThaiI-8菌株(CBS679.85)的酯酶基本相同或完全相同的酶。與可得自枯草芽孢桿菌ThaiI-8菌株的酯酶基本相同的酶是指編碼酯酶的DNA順序(核苷酸順序)至少與編碼得自枯草芽孢桿菌ThaiI-8菌株之酯酶的DNA順序有70%同源性。
可借用下列分析不同因素對雜合體穩(wěn)定性之影響時所得到的方程式來確定我們的實驗中涉及的同源性Tm＝81+16.6(log10Ci)+0.4(%G+C)-600/n-1.5(%誤配)(見Ausubel等人主編的CurrentProtocolsinmolecularbiology1987-1988)n＝最短探針鏈的長度Ci＝離子強度(M)G+C＝堿基組合Tm＝雜交溫度假定探針長度為300堿基，我們能夠確定一個300堿基或更長片段內至少顯示有67%同源性的同源基因。在確定同源性百分率時，我們假定芽孢桿菌的GC含量為50%(Normore，1973，inLaskinandLechevalier(ed.)，HandbookofMicrobiologyVol.Ⅱ，CRCPress，Inc.BocaRaton，Fla，)。
這就是說，本發(fā)明包括了與枯草芽孢桿菌ThaiI-8羧基酯酶至少有70%同源性的修飾的羧基酯酶。
本說明書中所列出的所有出版物和專利申請均定為本文的參考文獻。
雖然為清楚說明起見，已借助舉例描述和實施例詳細說明了本發(fā)明的技術特征，但在不背離本發(fā)明的精神和待批權利要求之范圍的前提下，本領域內普通技術人員顯然可對本發(fā)明作某些改動和改進。
下列實施例旨在進一步闡述本發(fā)明。
實施例1枯草芽孢桿菌I-85/PNAPT-7(CBS673.86)羧基酯酶之氨基酸順序的測定按下述方法測定美國專利4，886，750中所述的來源于枯草芽孢桿菌I-85/PNAPT-7(CBS673.86)之羧基酯酶的氨基酸順序。用Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA75(1977)，5463)所述的二脫氧鏈終止法測定PNAPT-7之2.2HindⅢ-HindⅢ插入段的核苷酸順序。在該順序只能檢測到一個能編碼30KD蛋白質的大的開放讀碼區(qū)?？捎稍撻_放讀碼的核苷酸順序推斷出該羧基酯酶的氨基酸順序。圖1顯示了該羧基酯酶的DNA編碼順序和相應的氨基酸順序。表示氨基酸的一字母代碼為A＝丙氨酸L＝亮氨酸R＝精氨酸K＝賴氨酸N＝天冬酰胺M＝蛋氨酸D＝天冬氨酸F＝苯丙氨酸
C＝半胱氨酸P＝脯氨酸Q＝谷氨酰胺S＝絲氨酸E＝谷氨酸T＝蘇氨酸G＝甘氨酸W＝色氨酸H＝組氨酸Y＝酪氨酸I＝異亮氨酸V＝纈氨酸實施例2羧基酯酶中賴氨酸殘基的突變將編碼枯草芽孢桿菌ThaiI-8(CBS679.85)中羧基酯酶的DNA片段(來源pNAPT-2的2.0KbBclⅠ-HindⅢ片段，參見歐洲專利申請EP-A233656)克隆到載體pTZ18R中。按照生產商(Pharmacia)推薦的方法制備單股DNA。按已知方法(Ausubeletal，上述文章)對該單股DNA進行寡核苷酸定點誘變。進行11次不同的誘變反應，從而用谷氨酰胺殘基取代羧基酯酶的11個賴氨酸殘基(見圖1)。此外還進行第12次反應，以使11個編碼不同之賴氨酸→谷氨酰胺突變的不同寡核苷酸的混合物包括在該誘變程序。按照EP-A233656中所述的方法在大腸桿菌DHI(ATCC33849)中生產由反應1-11得到的突變酯酶(所不同的是用載體pTZ18R代替pUN121)并在(S)-甲氧基甲基萘乙酸的存在下試驗其穩(wěn)定性(詳見實施例3)。將得自反應12的突變酶的混合物分配于微量滴定板中，并使用基于β-萘酚和固蘭的比色法測定突變酯酶的殘留活性，以檢驗其在甲氧基甲基萘乙酸存在下的穩(wěn)定性。用自動移液器篩選20.000個候選突變酶。選擇由12次不同的誘變反應得到的更為穩(wěn)定的突變酶，并用以進一步的定性分析。
實施例3突變羧基酯酶的穩(wěn)定性按下述方法試驗實施例2中構建的突變羧基酯酶的穩(wěn)定性將9ml含0.10g(S)-甲氧基甲基萘乙酸的溶液于40℃保溫15分鐘，然后加入1ml含24單位羧基酯酶的溶液。終混合物的組成為10g/L甲氧基甲基萘乙酸、1mMMOPS、20mM甘氨酸、2.4單位/ml羧基酯酶、pH8.75。加入酶溶液并混合之后，立即取出第1份50μl樣品(0分鐘樣品)。然后于保溫的0、15、30、45、60、90、120、180和240分鐘各取50μl樣品，并立即用含0.2%BSA的100mMMOPS緩沖液(pH8.75)稀釋至5ml。按下文“分析方法”部分所述檢測這些樣品中的羧基酯酶活性。
結果得到幾種在甲氧基甲基萘乙酸存在下提高了穩(wěn)定性的突變型酶，如其中賴氨酸34，賴氨酸81或賴氨酸217被谷氨酰胺取代的突變酶。
如所預料的，大多數構建的突變型酶均表現降低了穩(wěn)定性或活性。但研究發(fā)現，對11個可能的賴氨酸于三個位置中的每一個上進行突變均可提高酶的穩(wěn)定性，同時又可保留酶活性，此表明進行這種定點誘變是可行的。此外，在該實施例中只進行了以谷氨酰胺取代的突變。用其他殘基取代賴氨酸也能產生好的甚至更好的效果。在這方面，基于下述原因，用精氨酸取代賴氨酸將會更為有利1精氨酸具有同賴氨酸一樣的正電荷;
2.精氨酸ε-氨基比賴氨酸的氨基對烷基或羧基引起之修飾作用的敏感性小。
經結合使用可行的誘變方法已構建了更好的突變型酶。表1中顯示了三個賴氨酸→谷氨酰胺突變型及野生型酶的失活作用動態(tài)變化情況，各數據是在按上述方法逐漸增加酶與10g/L甲氧基甲基萘乙酸的保溫時間后，檢測酶活性而得出的。
表1時間(分鐘)野生型剩余活性(%)Lys34GluLys81GluLys217Glu01001001001001579936787305681637145438154606034754953902468423812014612526180649131524043888這些結果也示于圖2中。
分析方法在0.3mg/ml(S)-甲氧基甲基萘乙酸甲酯、2%Tween80(TM)、1mg/mlBSA(牛血清白蛋白)存在下，于25℃在0.1MMOPS(3-〔N-嗎啉代〕丙磺酸)(pH7.5)中檢測羧基酯酶。所用的HPLC系統(tǒng)是用乙腈0.03M磷酸鹽(34∶66)(pH3.2)，以1.5ml/分鐘流速洗脫的反相柱(Novapak CN Radial Pak Cartridge，Waters)。發(fā)現甲酯的滯留時間為6.9分鐘，甲氧基甲基萘乙酸的滯留時間為4.6分鐘。1個單位定義為在下文限定的條件下，每分鐘水解1×10-6M(S)-甲氧基甲基萘乙酸甲酯所需要的酶量。
實施例4枯草芽孢桿菌1-85/pNAPT-7和地衣芽孢桿菌T9的羧基酯酶制劑按歐洲專利申請EP-A-233656中所述培養(yǎng)枯草芽孢桿菌Ⅰ-85/pNAPT-7(CBS673.86)，并按其實施例14中所述方法分離酶。凍干超濾濃縮物。干燥材料的活性約為2400單位/克。
在另一實驗中，按EP-A-253455中所述方法將pNAPT-7轉化到地衣芽孢桿菌T9中。該菌株為蛋白酶陰性、α-淀粉酶陰性和孢子形成陰性菌株，故有利于發(fā)酵和回收羧基酯酶。按上述相似方法得到酶并證明其具有相似的活性?？砂磳嵤├?所述分析方法測定活性。
實施例5用甲醛修飾羧基酯酶制備羧基酯酶(來源于枯草芽孢桿菌Ⅰ-85/pNAPT-7(CBS673.86))，其中含有40mg/ml凍干酶、250mMMOPS(3-〔N-嗎啉代〕丙磺酸)(pH7.5)和漸增濃度的甲醛(0.01-10%)。修飾劑的濃度為其在反應混合物中的體積百分比。將溶液于20℃下放置1小時。然后取部分樣品直接測定酶活性，部分樣品在45℃下與15mg/ml(S)-甲氧基甲基萘乙酸保溫1.5小時，然后測定酶活性。結果如表2中所示。
剩余活性是指相對于沒作化學處理者，在作某些化學處理后仍保留的活性。按照實施例3所述的分析方法測定酶活性。
表2甲醛處理并與甲氧基甲醛(%)甲醛處理后的剩余甲基萘乙酸保溫后的活性(%)剩余活性(%)010020.0110570.0259970.0510080.195200.2593450.587601.064612.547455.0364110.01116結果也在圖3中示出。這一結果顯示未處理的酶在與甲氧基甲基萘乙酸于40℃保溫1.5小時后完全失活。甲醛處理的酯酶則只有部分失活。但用1%或更高濃度甲醛處理的經修飾的酶，在與甲氧基甲基萘乙酸(15mg/ml)于40℃保溫1.5小時后仍是完全穩(wěn)定的。
實施例6用甲醛修飾羧基酯酶將含有10mg/ml凍干酶、250mMMOPS(pH7.5)和2%甲醛的羧基酯酶(來源于枯草芽孢桿菌Ⅰ-85/pNAPT-7(CBS673.86))于20℃攪拌1小時。樣品對100mMMOPS(pH7.5)透析。按實施例3中所述的分析方法測定酯酶活性;剩余活性為60%。
實施例7用戊二醛修飾羧基酯酶將含有10mg/ml凍干酶、250mMMOPS(pH7.5)和2%戊二醛的羧基酯酶(來源于枯草芽孢桿菌Ⅰ-85/pNAPT-7(CBS673.86))溶液于20℃下攪拌1小時。樣品對100mMMOPS(pH7.5)透析。按實施例3中所述分析方法測定酯酶活性;剩余活性為68%。
實施例8用乙二醛修飾羧基酯酶將含有20mg/ml冰干酶、250mM碳酸鹽(pH9.2)和0.8%乙二醛的羧基酯酶(來源于枯草芽孢桿菌Ⅰ-85/pNAPT-7(CBS673.86))溶液于20℃下攪拌1小時。樣品對250mM碳酸鹽(pH9.2)透析。按實施例3中所述分析方法測定酯酶活性;剩余活性為45%。
實施例9用琥珀酸酐修飾羧基酯酶將含有10mg/ml凍干酶、0.5MMOPS(pH8.0)和0.3%琥珀酸酐的羧基酯酶(來源于枯草芽孢桿菌Ⅰ-85/pNAPT-7(CBS673.86))溶液于20℃攪拌1小時。按實施例3中所述的分析方法測定酯酶活性。剩余活性為62%。
實施例10用戊二酸酐修飾羧基酯酶將含有10mg/ml凍干酶、0.5MMOPS(pH8.0)和0.3%戊二酸酐的羧基酯酶(來源于枯草芽孢桿菌Ⅰ-85/pNAPT-7(CBS673.86))溶液于20℃下攪拌1小時。按實施例3中所述分析方法測定酯酶活性。剩余活性為72%。
實施例11用修飾羧基酯酶轉化(R，S)-甲氧基甲基萘乙酸甲酯將300mg(R，S)-甲氧基甲基萘乙酸甲酯加到10ml2%TWeen80(TM)中。將pH調到9.0。然后加入5.5單位實施例6-10中制得的經修飾的酶。滴加2.5M氫氧化銨以使pH保持在9.0。于40℃進行反應。定時用HPLC法監(jiān)測轉化程度，同時用未修飾的酶進行轉化以作為對照。結果如圖4所示，從中可以看出用修飾的酶要比用未處理的酶能達到更高的轉化率。
實施例12用戊二醛修飾的羧基酯酶轉化(R，S)-二氯苯氧基苯氧基丙酸乙酯將750mg(R，S)-二氯苯氧基苯氧基丙酸乙酯加到25ml1%Tween80(TM)中。將pH調至9.0，然后加入10單位修飾的酶。該修飾的酶是按實施例7所述制得的，不同的是其中只加入0.15%戊二醛。滴加0.1MNaOH以維持pH＝9。反應溫度為20℃。定時用HPLC法監(jiān)測轉化程度。將用未修飾酶進行的轉化作為對照。結果如圖5所示，從中可以看出用經過修飾的酶可比用未處理的酶達到更高的轉化率。
權利要求
1.修飾的羧基酯酶，它與野生型羧基酯酶相比，在應用條件下可表現出改善的特性。
2.修飾的羧基酯酶，它與野生型羧基酯酶相比，當與15mg/ml(S)-甲氧基甲基萘乙酸于40℃下接觸1.5小時時，表現有較高的穩(wěn)定性。
3.根據權利要求1或2的修飾的羧基酯酶，其中所說的野生型羧基酯酶是由至少與圖1所示DNA有70%同源性的DNA編碼的，或其中所說的野生型羧基酯酶至少與枯草芽孢桿菌ThaiⅠ-8羧基酯酶有70%同源性，且其中所說的經修飾的羧基酯酶不同于所說的野生型酯酶，在于在所說的野生型羧基酯酶中至少存在一個修飾酶中沒有的堿基氨基酸殘基。
4.根據權利要求1-3中任一項的經修飾的羧基酯酶，其中所說的堿性氨基酸殘基經用至少包含一個醛或酐基團的化合物處理野生型羧基酯酶而被改變。
5.根據權利要求4的經修飾的羧基酯酶，其中所說的化合物是醛或酐，最好是選自一組包括甲醛、戊二醛、乙二醛、戊二酸酐和琥珀酸酐的醛或酐。
6.根據權利要求1-3中任一項的經修飾的羧基酯酶，其中所說的堿性氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代。
7.根據權利要求3或6的經修飾的羧基酯酶，其中所說的堿性氨基酸殘基是賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基。
8.根據權利要求7的經修飾的羧基酯酶，其中所說的堿性氨基酸殘基是Lys34、Lys81或Lys217。
9.根據權利要求6-8中任一項的經修飾的羧基酯酶，其中所說的堿性氨基酸殘基被谷氨酰胺或精氨酸取代。
10.根據權利要求1-9中任一項的經修飾的羧基酯酶，其中所說的野生型羧基酯酶完全相同或基本上相同于可得自枯草芽孢桿菌菌株，最好是枯草芽孢桿菌ThaiⅠ-8(CBS679.85)菌株的羧基酯酶。
11.一種穩(wěn)定野生型羧基酯酶的方法，該方法包括修飾或取代野生型羧基酯酶的至少一個堿性氨基酸殘基。
12.一種穩(wěn)定野生型羧基酯酶的方法，該方法包括用能夠中和堿性氨基酸殘基的試劑處理所說的野生型酯酶。
13.根據權利要求12的方法，其中所說的試劑是醛或酐。
14.根據權利要求13的方法，其中所說的醛選自于甲醛、戊二醛和乙二醛。
15.根據權利要求13的方法，其中所說的酐是戊二酸酐或琥珀酸酐。
16.根據權利要求11-15中任一項的方法制備的修飾的羧基酯酶。
17.修飾野生型羧基酯酶以生產修飾的羧基酯酶的方法，該方法包括修飾編碼所說野生型酯酶的基因，用另一氨基酸殘基的密碼子取代至少一個堿性氨基酸殘基的密碼子，以得到修飾的基因;并且表達所得到的修飾的基因，以產生所說的修飾的羧基酯酶。
18.按權利要求17的方法制備的經修飾的羧基酯酶。
19.進行羧基酯酶的立體特異性水解的方法，該方法包括使所說的酯與進行所說的立體特異性水解有效量的權利要求1-10，16或18中任一項的修飾的羧基酯酶接觸。
20.根據權利要求19的方法，其中(R，S)-2-取代的丙酸酯，最好是甲氧基甲基萘乙酸(naproxen)、羥基甲基甲丙基苯乙酸(ibuprofen)或二氯苯氧基苯氧基丙酸(diclofop)酯被立體特異性地水解，主要產生相應的對映體(S)-酸。
全文摘要
羧基酯酶可因幾種化合物如甲氧基甲基萘乙酯或二氯苯氧基苯氧基丙酸的作用而失活。通過置換或修飾羧基酯酶的某些堿性殘基，可使該酶在應用中表現出改善了的穩(wěn)定性。從而該酶有可能以工業(yè)規(guī)模，甚至在高底物濃度下完成立體特異性水解反應。
文檔編號C12N9/18GK1046935SQ9010245
公開日1990年11月14日 申請日期1990年4月28日 優(yōu)先權日1989年4月28日
發(fā)明者約哈那·亨利卡·格帝那·馬利亞, 考乃利思·杰克巴司·凡德拉琴, 考乃利思·皮特拉斯·布羅克會金, 威海母絲·約海尼斯·瓊克斯 申請人:吉斯特·布羅卡德斯股份有限公司