專利名稱：：用固定化細(xì)胞催化氧化低碳烴的過程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用微生物催化氧化揮發(fā)性強(qiáng)的或氣態(tài)有機(jī)化合物的過程。隨著生物催化的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多以烴類為唯一碳源和能源的具有活化分子氧能力的微生物，例如可使丙烯直接氧化成環(huán)氧丙烷的甲烷菌類微生物就是這一類微生物的突出代表。Colby，Dolton等發(fā)現(xiàn)甲烷菌之所以具有這一種功能是由于含有甲烷單加氧酶(MMO)，正是由于MMO的存在才能使丙烯直接被分子氧氧化成環(huán)氧丙烷。C.T.Hou等發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的MMO不能催化這一反應(yīng)，必須在反應(yīng)體系中添加MAOH作為輔酶。輔酶主要起電子給體作用，在反應(yīng)中是逐漸消耗的，目前還找不到有效的方法進(jìn)行再生。為此C.T.Hou(US4348476)將甲烷菌細(xì)胞分別吸附在多孔玻璃球、活性碳、陶瓷、砂子等載體上制備成固定化細(xì)胞，作為活化分子氧使氣態(tài)有機(jī)化合物發(fā)生催化氧化的催化劑，該類生物催化劑特別適用于丙烯環(huán)氧化制環(huán)氧丙烷和能被甲烷單加氧酶催化的類似反應(yīng)，但是操作6小時后催化劑即失活，將失活的細(xì)胞用甲醇再生一次催化劑活性下降60%，經(jīng)三次再生后催化劑已基本失活，很難做到催化劑的連續(xù)應(yīng)用。US4368267中記載了一種低碳α-烯烴、二烯烴或乙烯基芳香化合物環(huán)氧化的生物催化過程，在微生物或微生物中提取的酶存在下將上述化合物進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)，所用微生物是甲基營養(yǎng)菌，尤其是在好氧條件下以甲烷為營養(yǎng)的微生物。本發(fā)明在包埋活細(xì)胞制得的固定化細(xì)胞作用下，氧化揮發(fā)性強(qiáng)的或氣態(tài)有機(jī)化合物，并用可給固定化細(xì)胞提供能量的相應(yīng)低碳烷烴或烯烴與空氣的混合氣對其固定化細(xì)胞進(jìn)行處理，以達(dá)到提供能量，帶走有毒產(chǎn)物，增加還原當(dāng)量，使一次投入的催化劑多次再生而不失活的目的。本發(fā)明的目的可由如下措施實(shí)現(xiàn)。將以氣態(tài)低碳烷烴或烯烴作為唯一碳源和能源，輔以無機(jī)無碳培養(yǎng)基生長的好氧細(xì)菌、酵母、真菌，在可給上述微生物提供能量的相應(yīng)的碳源氣和空氣的混合氣中用無機(jī)無碳培養(yǎng)基于20-60℃培養(yǎng)48hr-144hr，然后用海藻酸鈉溶液包埋微生物細(xì)胞，海藻酸鈉溶液的溶劑為含金屬離子的無菌蒸餾水或無機(jī)無碳培養(yǎng)基，這樣有利于細(xì)胞包埋后的生存，再將含有菌體的海藻酸鈉滴加到0.1MCaCl2溶液中，制成2mm小球，放入4℃的冰箱中增加催化劑的強(qiáng)度，最后洗去催化劑上的CaCl2加入培養(yǎng)基，充入可給微生物提供能量的相應(yīng)低碳烷烴或烯烴碳源氣與空氣的混合氣，其中碳源氣的范圍為1-99%，在搖床上培養(yǎng)48hr-120hr備用。本發(fā)明制固定化細(xì)胞所采用的微生物可以是甲烷營養(yǎng)菌甲基囊菌屬、甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬、甲基球菌屬、甲基無芽胞桿菌屬乙烷營養(yǎng)菌假單胞菌屬、土壤桿菌屬、短桿菌屬、分枝桿菌屬丁烷營養(yǎng)菌假單胞菌屬、土壤桿菌屬乙烯營養(yǎng)菌分枝桿菌屬丙烯營養(yǎng)菌諾卡氏菌、假單胞菌屬鋼綠色極毛桿菌。取一定量濕重的催化劑小球放入填充式反應(yīng)器中，空氣和下述一種的氣態(tài)或揮發(fā)性強(qiáng)的C1-C4烷烴、C2-C4烯烴或二烯烴、乙烯基芳香化合物、甲基環(huán)己烯、C＝C-C-C-Br、C＝C-C-C-Cl等，分別經(jīng)過增濕器后進(jìn)入反應(yīng)器，氣體的總流量1-10ml/min，pH為3-10，反應(yīng)溫度20-80℃，反應(yīng)6小時后，停止供應(yīng)原料氣，將反應(yīng)器的溫度調(diào)至所用菌體的最適培養(yǎng)溫度，即20-60℃，通入(上述所提及)可給微生物提供能量的相應(yīng)的低碳烷烴或烯烴碳源氣和空氣的混合氣，其中碳源氣占1-99%，以提供能量，帶走有毒產(chǎn)物，增加還原當(dāng)量，這一再生過程和反應(yīng)過程交替進(jìn)行。上述所提及的可給微生物提供能量的相應(yīng)碳源氣可以是甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯，實(shí)驗(yàn)證明，用包埋法制備的固定化催化劑經(jīng)上述方法再生，催化劑至少可再生8次而活性仍不下降。本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)，1、用海藻酸鈣包埋法制備生物催化劑，不僅方法簡便，有利于大規(guī)模生產(chǎn)，而且，固定化生物催化劑經(jīng)多次再生，催化劑活性不降。2、用填充式反應(yīng)器，可直接通入碳源氣和空氣，而不必把催化劑從反應(yīng)器中取出，即可進(jìn)行再生?，F(xiàn)進(jìn)一步通過最佳實(shí)施例來闡述發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方式實(shí)施例[1]本發(fā)明將成都微生物研究所提供的甲基單胞菌屬(Methylononas)成都761(Appl.EnvironMicrobiol.，1984，Vol.48，No.4，PP.807～812)，用無機(jī)無碳培養(yǎng)基，在甲烷∶空氣＝1∶1的氣氛中，溫度為30℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為4天。將靜止培養(yǎng)好的菌液用接種環(huán)取上層菌體放入2.7%的海藻酸鈉溶液中(溶劑為培養(yǎng)基，這有利于細(xì)胞被包埋后的生存)。用10ml的注射器，5號針頭將含有菌體的海藻酸鈉溶液滴入0.1M的CaCl2溶液中，制成直徑約2mm的小球。并在4℃的冰箱中放置5小時，用滅菌蒸餾水洗去催化劑上的CaCl2，最后用培養(yǎng)基洗一次。將洗好的催化劑小球放入250ml的三角瓶中加入適量培養(yǎng)基，充入1∶1的甲烷空氣混合氣在搖床(32℃，220rpm)上培養(yǎng)85小時備用。實(shí)施例[2]取包埋培養(yǎng)好的固定化細(xì)胞8.91g(每克固定化細(xì)胞中含有細(xì)胞5.9mg)，裝入φ1×20cm的填充式反應(yīng)器中，反應(yīng)器裝有夾層，用循環(huán)水控制反應(yīng)溫度，40℃下反應(yīng)?？諝夂捅┓謩e經(jīng)過增濕器，然后以1∶1的比例進(jìn)入反應(yīng)器，氣體的總流量為2ml/min，由于環(huán)氧丙烷的沸點(diǎn)為34.2℃，生成的環(huán)氧丙烷隨氣體從反應(yīng)器中流出被吸收在由冰水冷卻的裝有1ml水的吸收器中。反應(yīng)6小時后共生成1.6μmol的環(huán)氧丙烷，這時催化劑已失活。將反應(yīng)器的溫度改為32℃，通入1∶1的甲烷空氣混和氣，流速為2ml/min，進(jìn)行輔酶再生，再生時間為16小時。再生完畢后。將反應(yīng)器溫度調(diào)成40℃，通入反應(yīng)氣(1∶1的空氣丙烯混合氣)進(jìn)行同樣條件下的反應(yīng)。催化劑失活后再進(jìn)行同樣條件的再生。發(fā)現(xiàn)經(jīng)8次再生，催化劑活性不降。將一次投入的催化劑每次再生后所達(dá)到的活性列入表Ⅰ。</tables>實(shí)施例[3]取包埋培養(yǎng)好的固定化細(xì)胞16.4g(每克固定化細(xì)胞含有6.8mg細(xì)胞)放入250ml的三角瓶中，加入30ml培養(yǎng)基作反應(yīng)液，將其中的空氣盡可能抽盡，加入60ml丙烯，其余用氧氣充滿，在32℃、220rpm的搖床上反應(yīng)。反應(yīng)6小時后催化劑失活，共生成11.1μmol的環(huán)氧丙烷，用蒸餾水把催化劑洗凈，最后用培養(yǎng)基洗一次。加入40ml培養(yǎng)基，充入1∶1的空氣甲烷混合氣，在32℃，220rpm搖床上再生16小時。洗凈，做同樣條件下的環(huán)氧化反應(yīng)，催化劑失活后進(jìn)行同樣條件下的再生。將催化劑再生次數(shù)與活性關(guān)系列入表Ⅱ。</tables>權(quán)利要求1.一種在微生物催化劑存在下，氧化揮發(fā)性強(qiáng)的或氣態(tài)有機(jī)化合物的過程，其特征在于上述化合物和空氣在通過包埋活細(xì)胞制得的固定化細(xì)胞作用下反應(yīng)，其中包埋活細(xì)胞微生物是指以氣態(tài)的低碳烷烴或烯烴作為唯一碳源和能源，輔以無機(jī)無碳培養(yǎng)基生長的好氧的細(xì)菌、酵母、真菌，反應(yīng)完畢后，用可給微生物提供能量的相應(yīng)碳源氣與空氣的混合氣，在再生條件下，對其固定化細(xì)胞進(jìn)行再生。2.如權(quán)利要求1所述的氧化過程，其特征在于有機(jī)化合物和空氣分別通過增濕器后，進(jìn)入裝有固定化細(xì)胞的填充式反應(yīng)器，總流速1-10ml/min，pH為3-10，反應(yīng)溫度20-80℃，反應(yīng)畢后，將反應(yīng)器溫度調(diào)至20-60℃，用可給微生物提供能量的相應(yīng)碳源氣與空氣的混合氣對固定化細(xì)胞再生，其中碳源氣占1-99%，反應(yīng)與再生兩過程交替進(jìn)行。3.如權(quán)利要求1所述的氧化過程，其特征在于其中固定化細(xì)胞的制取方法包括(a)將微生物用無機(jī)無碳培養(yǎng)基，在低碳烷烴或烯烴和空氣的混合氣氣氛中培養(yǎng)，(b)取靜止培養(yǎng)好的菌液于2.7%的海藻酸鈉溶液中，(c)將含有菌體的海藻酸鈉溶液滴入0.1NCaCl2溶液中，放入4℃的冰箱中存放5小時，(d)用滅過菌的蒸餾水洗去固定化細(xì)胞上的CaCl2，然后再用培養(yǎng)基洗一次，(e)將洗好后的催化劑小球，加入適量的培養(yǎng)基，充入可給微生物提供能量的相應(yīng)低碳烷烴或烯烴和空氣的混合氣于搖床上培養(yǎng)。4.如權(quán)利要求1或2或3所述的氧化過程，其特征在于微生物是各種甲基營養(yǎng)菌、乙烯營養(yǎng)菌、丙烯營養(yǎng)菌。5.如權(quán)利要求1或2所述的氧化過程，其特征在于有機(jī)化合物是氣態(tài)或揮發(fā)性強(qiáng)的C1-C4烷烴、C2-C4烯烴或二烯烴、乙烯基芳香化合物、甲基環(huán)己烯、C＝C-C-C-Br、C＝C-C-C-Cl。6.如權(quán)利要求1或2所述的氧化過程，其特征在于再生固定化細(xì)胞的混合氣是可給微生物提供能量的相應(yīng)低碳烷烴或烯烴和空氣。7.如權(quán)利要求1所述的氧化過程，其特征在于微生物是甲烷營養(yǎng)菌甲基囊菌屬、甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬、甲基球菌屬、甲基無芽胞桿菌屬，乙烷營養(yǎng)菌假單胞菌屬、土壤桿菌屬、短桿菌屬、分枝桿菌屬，丁烷營養(yǎng)菌假單胞菌屬、土壤桿菌屬，乙烯營養(yǎng)菌分枝桿菌屬，丙烯營養(yǎng)菌諾卡氏菌、假單胞菌屬鋼綠色極毛桿菌。8.如權(quán)利要求3所述的氧化過程，其特征在于固定化細(xì)胞的直徑1-20mm。9.如權(quán)利要求3所述的氧化過程，其特征在于海藻酸鈉溶液可用含金屬離子的無菌蒸餾水配制。10.如權(quán)利要求3所述的氧化過程，其特征在于海藻酸鈉溶液可用無機(jī)無碳培養(yǎng)基配制。11.如權(quán)利要求3所述的氧化過程，其特征在于培養(yǎng)微生物的碳源氣是可給微生物提供能量的相應(yīng)甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯中的一種。12.如權(quán)利要求1或2所述的氧化過程，其特征在于丙烯和空氣分別通過增濕器進(jìn)入填充式反應(yīng)器中，在海藻酸鈣包埋甲基單胞菌屬成都761制得的固定化細(xì)胞存在下反應(yīng)制得環(huán)氧丙烷，反應(yīng)溫度為40℃。再將反應(yīng)器溫度調(diào)至32℃，用1∶1的甲烷和空氣的混合氣對固定化細(xì)胞進(jìn)行再生。13.如權(quán)利要求6所述的氧化過程，其特征在于再生固定化細(xì)胞的碳源氣是可給微生物提供能量的相應(yīng)的甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯中的一種。全文摘要本發(fā)明涉及用微生物催化氧化揮發(fā)性強(qiáng)的或氣態(tài)的有機(jī)化合物過程。本過程在海藻酸鈣溶液包埋微生物細(xì)胞制得的固定化細(xì)胞存在下，使空氣和一種揮發(fā)性強(qiáng)的或氣態(tài)的有機(jī)化合物反應(yīng)，反應(yīng)完全后，用可給固定化細(xì)胞提供能量的相應(yīng)低碳烷烴或烯烴和空氣的混合氣對其微生物催化劑進(jìn)行再生，以提供能量，帶走有毒產(chǎn)物，增加還原當(dāng)量，使一次投入的催化劑經(jīng)多次再生而不失活。海藻酸鈣包埋法，方法簡便，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。文檔編號C12P17/02GK1055201SQ9010457公開日1991年10月9日申請日期1990年7月7日優(yōu)先權(quán)日1990年7月7日發(fā)明者李樹本,高燦柱申請人:中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所