專利名稱：頭孢菌素乙酰水解酶基因及由所說(shuō)的基因編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及頭孢菌素乙酰水解酶基因、將所說(shuō)的基因引入適用于大腸桿菌宿主-載體系統(tǒng)的載體中所制備的重組DNA分子、用所說(shuō)的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞、具有由所說(shuō)的基因編碼之氨基酸序列的蛋白質(zhì)、含有所說(shuō)蛋白質(zhì)之多聚體，最好是四聚體或多聚體的酶，以及制備所說(shuō)的蛋白質(zhì)或酶的方法。
頭孢菌素類如頭孢菌素C和7-氨基頭孢烷酸(下稱7-ACA)迄今是通過(guò)去掉連接到3位羥甲基上的乙?；?下稱脫乙?；饔?而衍生的脫乙酰化合物，如脫乙酰頭孢菌素C或脫乙酰7-ACA，這些化合物可用作起始材料，以合成各種頭孢菌素抗生素，包括已在市場(chǎng)上銷售的頭孢菌素抗生素。
作為頭孢菌素脫乙?；姆椒ǎ梢杂谢瘜W(xué)和酶學(xué)方法，兩種方法中以后者更具優(yōu)越性，這一方面是因?yàn)樵摲椒稍诖蠹s中性pH和溫和溫度下完成，另一方面是因?yàn)樗橛休^少的付反應(yīng)。已經(jīng)公開(kāi)了幾種酶學(xué)方法(如日本專利公開(kāi)108，790/1984、132，294/1974和67，489/1986號(hào)，以及美國(guó)專利3，304，236號(hào))。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)從土壤中分離的一株枯草芽胞桿菌菌株可產(chǎn)生頭孢菌素乙酰水解酶，并借助對(duì)頭孢菌素的脫乙?；饔枚行У禺a(chǎn)生脫乙酰頭孢菌素。這一發(fā)現(xiàn)使本發(fā)明人產(chǎn)生這樣一個(gè)設(shè)想，即用DNA重組技術(shù)構(gòu)建一株能優(yōu)先產(chǎn)生頭孢菌素乙酰水解酶的微生物，對(duì)于工業(yè)上制備脫乙酰頭孢菌素將是很有利的。到目前為止，還沒(méi)有公開(kāi)過(guò)這樣一種能夠只大量產(chǎn)生頭孢菌素乙酰水解酶的微生物。
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入地研究，已經(jīng)成功地從最近由土壤內(nèi)分離的枯草芽胞桿菌中分離到攜帶頭孢菌素乙酰水解酶基因的DNA片段，并將其克隆到大腸桿菌中。他們還發(fā)現(xiàn)，用其中已插入了所說(shuō)之DNA片段的質(zhì)粒DNA載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，產(chǎn)生了大量的頭孢菌素乙酰水解酶。已基于上述發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了頭孢菌素乙酰水解酶基因、含有所說(shuō)之基因的重組DNA分子、用所說(shuō)之重組DNA分子轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞、具有由所說(shuō)之基因編碼之氨基酸序列的蛋白質(zhì)、含有所說(shuō)之蛋白質(zhì)的多聚體酶，以及制備所說(shuō)之蛋白質(zhì)或酶的方法。
可按照本發(fā)明從中得到頭孢菌素乙酰水解酶基因的新分離菌株，即枯草芽胞桿菌SHSO133根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在Fermehtation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology，1-3，Higashi 1 Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，305，Japan，保藏登記號(hào)為FERM BP-2755(日期1990年2月15日)。


圖1顯示頭孢菌素乙酰水解酶的氨基酸序列。
圖2顯示頭孢菌素乙酰水解酶基因的堿基序列(下排)和由之推測(cè)出的氨基酸序列(上排)。
圖3顯示頭孢菌素乙酰水解酶的已部分確定的氨基酸序列(34個(gè)氨基酸殘基)。
圖4顯示包括由圖3中劃下線之氨基酸序列推斷的所有遺傳上可能DNA堿基的四個(gè)合成寡核苷酸探針。
圖5顯示重組質(zhì)粒pCAH01的限制性酶切圖及其中DNA探針雜交的位置。
圖6顯示重組質(zhì)粒pCAH03的限制性酶切圖。
圖7顯示克隆之頭孢菌素乙酰水解酶基因的DNA序列及側(cè)翼區(qū)域。
圖8顯示小型化質(zhì)粒pCAH10的構(gòu)建，該質(zhì)粒相當(dāng)于pCAH03，但刪去了頭孢菌素乙酰水解酶基因的下游區(qū)域。
圖9顯示用于大腸桿菌中之表達(dá)質(zhì)粒pCAH21的構(gòu)建。
圖10顯示用于大腸桿菌中之表達(dá)質(zhì)粒pCAH211和pCAH212的構(gòu)建。
枯草芽胞桿菌SHSO133的特征1.染色體DNA的G+C摩爾百分比(%)43.42.形態(tài)學(xué)特征該菌株為革蘭氏陽(yáng)性、大小為0.7-0.8×1.8-2.6μm，有周毛。該菌株在有氧條件下生長(zhǎng)良好，而在無(wú)氧條件下于含葡萄糖的中性培養(yǎng)基則生長(zhǎng)較差。在細(xì)胞的中心部分形成大小為0.8×1.3-1.7μm的孢子。
3.培養(yǎng)特征(1)肉汁瓊脂平皿培養(yǎng)(30℃培養(yǎng)7天)菌落形成接種后24小時(shí)形狀不規(guī)則表面有褶折邊緣波紋狀隆起凸?fàn)铑伾榘坠鉂蓽啙峁鈱W(xué)特性不透明(2)肉汁瓊脂斜面培養(yǎng)(30℃培養(yǎng)7天)生長(zhǎng)良好形狀絲狀表面褶折顏色乳白光澤渾濁光學(xué)特性不透明稠度干酪樣(3)肉汁液體培養(yǎng)(30℃培養(yǎng)7天)表面生長(zhǎng)形成厚膜混濁輕度氣味稍帶芳香味沉淀可見(jiàn)沉淀量很少(4)肉汁明膠穿刺培養(yǎng)(24℃下培養(yǎng)30天)生長(zhǎng)沿穿刺線均勻生長(zhǎng)穿刺線絲狀液化形式24℃下第7天時(shí)液化形成0.5mm的液化層(層狀)(5)石蕊牛乳培養(yǎng)石蕊被還原。沒(méi)有凝固而快速消化酪蛋白。
4.生物化學(xué)特性(1)硝酸鹽還原陽(yáng)性(2)脫氮作用陽(yáng)性(3)MR試驗(yàn)陰性(4)VP試驗(yàn)陽(yáng)性(5)吲哚生成陰性(6)H2S生成醋酸鉛紙陰性TSI陰性Krigler陰性(7)淀粉水解陽(yáng)性(8)檸檬酸鹽的利用Koser陽(yáng)性Christensen陽(yáng)性(9)無(wú)機(jī)氮源的利用硝酸鹽陽(yáng)性銨陽(yáng)性(10)色素生成形成褐色色素(11)脲酶試驗(yàn)陽(yáng)性(12)氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性(13)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性(14)pH生長(zhǎng)范圍1.5-8.8最適6.0-8.8(15)溫度生長(zhǎng)范圍16.5℃-50.5℃最適26.0℃-36.0℃(16)OF試驗(yàn)D-葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣
(17)由糖生成酸和氣體ⅰ)在L阿拉伯糖、D-木酮糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘油和淀粉中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。
ⅱ)在D-半乳糖、乳糖、D-山梨醇和肌醇中既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣。
(18)營(yíng)養(yǎng)要求無(wú)(19)果膠降解陽(yáng)性(20)馬尿酸降解陰性(21)果聚糖生成(由蔗糖、棉子糖)陽(yáng)性(22)精氨酸水解酶陰性(23)卵磷脂酶陰性(24)厭氧條件下生長(zhǎng)在含D-葡萄糖的中性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較差。
根據(jù)上述結(jié)果，基于Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology，Vol.Ⅱ，1986將該菌株鑒定為枯草芽胞桿菌，并定名為枯草芽胞桿菌SHSO133。
本發(fā)明包括制備頭孢菌素乙酰水解酶的方法，該方法是使用被重組DNA分子轉(zhuǎn)化的重組微生物，所說(shuō)的重組DNA分子是將編碼圖1所示氨基酸序列的分離的DNA堿基序列，最好是圖2所示DNA堿基序列引入到適用于大腸桿菌宿主-載體系統(tǒng)的載體中制備的。該方法可按照代表本發(fā)明發(fā)展歷史的七個(gè)步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)，但由于本發(fā)明已揭示了編碼頭孢菌素乙酰水解酶的DNA堿基序列，所以可用更簡(jiǎn)單的程序完成本方法。
(1)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽胞桿菌(FE M BP-2755)使之產(chǎn)生頭孢菌素乙酰水解酶，從培養(yǎng)基中分離所產(chǎn)生的頭孢菌素乙酰水解酶并純化之。用適于將蛋白質(zhì)切成片段的蛋白酶消化已純化的酶，分離所得到的肽片段，然后由氨基末端檢測(cè)肽片段之一的氨基酸序列。
(2)推斷與所確定的部分氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的可能的DNA堿基序列，并用化學(xué)方法合成一組具有推測(cè)之堿基序列的寡核苷酸，用32P標(biāo)記該寡核苷酸的5′端。用該被標(biāo)記的寡核苷酸作為基因克隆的探針。
(3)從枯草芽胞桿菌中提取并純化染色體DNA，用各種限制性酶消化，在瓊脂糖凝膠上電泳，并將分離出的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。使用硝酸纖維素膜和上述步驟(2)制備的32P標(biāo)記的探針Southern雜交，以選擇與探針有同源性的DNA片段。從這些DNA片段中選擇比根據(jù)頭孢菌素乙酰水解酶蛋白質(zhì)分子推測(cè)之所需基因稍大的片段，在含有該DNA片段的瓊脂糖凝膠上切下相關(guān)區(qū)域，并提取DNA。
(4)將上述步驟(3)中得到的DNA片段插入大腸桿菌克隆載體中，并將所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化體接種到瓊脂培養(yǎng)基上以形成菌落，并與32P標(biāo)記的探針進(jìn)行菌落雜交。選擇與探針有同源性的大腸桿菌菌落并分離之。
(5)由選擇的大腸桿菌細(xì)胞中提取重組質(zhì)粒DNA并構(gòu)建限制性酶切圖。然后除去與頭孢菌素乙酰水解酶無(wú)關(guān)的區(qū)域。測(cè)定枯草芽胞桿菌衍生之編碼頭孢菌素乙酰水解酶的DNA片段之堿基序列。然后將根據(jù)已測(cè)定之DNA堿基序列推斷的氨基酸序列與頭孢菌素乙酰水解酶的部分氨基序列、分子量、末端氨基酸分析及氨基酸組成分析結(jié)果相比較，并確定頭孢菌素乙酰水解酶的結(jié)構(gòu)基因。
(6)對(duì)含有頭孢菌素乙酰水解酶的DNA片段作適當(dāng)修飾，然后引入大腸桿菌的基因表達(dá)載體中，以便使該結(jié)構(gòu)基因連接到得自大腸桿菌的啟動(dòng)子之后，以構(gòu)建用于表達(dá)的重組質(zhì)粒。
(7)將上面得到的重組表達(dá)質(zhì)粒引入大腸桿菌宿主內(nèi)，以制備可產(chǎn)生頭孢菌素乙酰水解酶的新的大腸桿菌菌株。
用于上述步驟的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且可按照標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)中已公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)程序完成之(如參見(jiàn)“Molecular Cloning”，T.Maniatis et al.，Cold Spring Harbor Laboratory(1982))。所使的材料，如酶和試劑均可從商業(yè)途徑得到并可按照說(shuō)明書(shū)使用之。
用作宿主的大腸桿菌可以是大腸桿菌的衍生株，如HB101、DH1、C600、JM103、JM105和JM109。作為克隆過(guò)程中使用的大腸桿菌載體，可使用質(zhì)粒載體如PUC13、PBR322和PAT153以及噬菌體載體如λgt10。上述宿主和載體可從商業(yè)途徑得到。
上述步驟(1)中，測(cè)定蛋白質(zhì)之氨基酸序列的方法是已知的(如可使用可由商業(yè)途徑購(gòu)得的自動(dòng)氨基酸序列測(cè)定儀)。上述步驟(2)中，可按照制造者推薦的使用方法，使用可購(gòu)得的DNA合成儀合成寡核苷酸。上述步驟(5)中，在使用已知的M13載體系統(tǒng)的情況下，可按照Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-5467(1977))的方法進(jìn)行DNA堿基序列測(cè)定。
上述步驟(6)中，為構(gòu)建用于指導(dǎo)在大腸桿菌內(nèi)有效地表達(dá)所需基因的質(zhì)粒，可將含有所需頭孢菌素乙酰水解酶結(jié)構(gòu)基因的DNA片段插入一含有在宿主內(nèi)有功能之適當(dāng)啟動(dòng)子(Lac、Tac、Trc、Trp、PL等)和Shine-Dalgarno(SD)序列的表達(dá)載體(pKK223-3、pBS、pDR540、pPL-λ等)內(nèi)，或插入還另外含有轉(zhuǎn)譯起始密碼子ATG的ATG載體(pKK233-2等)內(nèi)。將表達(dá)質(zhì)粒引入適當(dāng)宿主(如大腸桿菌JM103、JM109、HB101和C600)內(nèi)即可得到能有效地表達(dá)頭孢菌素乙酰水解酶的微生物。
可按照常規(guī)純化方法，如合用離心、柱層析法等純化被表達(dá)的頭孢菌素乙酰水解酶。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉列說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例11.頭孢菌素乙酰水解酶的分離和純化以及部分氨基酸序列的測(cè)定(1)頭孢菌素乙酰水解酶的分離和純化將由2.5%葡萄糖、0.75%玉米漿、1.0%氨基酸混合物、0.3%KH2PO4和0.8ppm MnSO4·4H2O，(pH7.0)組成的培養(yǎng)基(20升)加入一個(gè)30升體積的罐式發(fā)酵器內(nèi)。滅菌后，將預(yù)先在含0.5%葡萄糖、0.75%玉米漿、0.5%氨基酸混合物和0.02%KH2PO4(pH7.0)之培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)的枯草芽胞桿菌(FERM BP-2755)倒入培養(yǎng)基內(nèi)達(dá)到6%的接菌體積。于28℃下保溫48小時(shí)后，向培養(yǎng)液內(nèi)加入活性炭至1%，并攪拌2小時(shí)。過(guò)濾后即得到作為濾液的粗酶溶液。向粗酶溶液內(nèi)加入DEAE Sephadex A-50(Pharmacia)至0.7%，用2N NaOH將混合物調(diào)到pH8.0并攪拌1小時(shí)。過(guò)濾后，用含有0.1M NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)(4升)洗已吸附了頭孢菌素乙酰水解酶活性的DEAE Sephadex A-50，然后用含有0.4M NaCl的同樣緩沖液洗脫活性材料。用超濾裝置(Tosoh)濃縮并脫鹽后，使活性材料吸附到預(yù)先已用同樣緩沖液平衡過(guò)的充滿DEAE Sepharose CL-6B(Pharmacia)的柱上。用同樣緩沖液洗柱，再用含0.15M NaCl的相同緩沖液洗柱，然后用含有0.2M NaCl的相同緩沖液洗脫活性材料。經(jīng)超濾濃縮并脫鹽后，用高效液相層析法(下稱HPLC)進(jìn)行純化。用DEAE Toyopearlpak 650M(Tosoh)裝柱。用漸增鹽濃度的濃度梯度洗脫法洗脫活性材料。為此，由含有0.15M NaCl的相同緩沖液開(kāi)始，其后使NaCl濃度逐漸增加到0.5M。收集含被洗脫之活性的部分、超濾濃縮、然后用分子篩柱以HPLC純化。用TSK-G3000(Tosoh)作柱并用0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)作流動(dòng)相。收集被洗脫的活性部分、超濾濃縮，然后用反相柱經(jīng)HPLC純化。用Microbondapak C18(Waters)作柱并用漸增乙腈濃度的濃度梯度洗脫法進(jìn)行洗脫。為此，以含有0.1%三氟乙酸的水溶液系統(tǒng)開(kāi)始，使乙腈濃度逐步升至98%(終濃度)。于50℃減壓條件下濃縮含被洗脫之頭孢菌素乙酰水解酶的部分，并將殘留物溶解于含6M鹽酸胍的0.5M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中。向溶液內(nèi)加入EDTA(乙二胺四乙酸)到濃度為2mM，再向溶液內(nèi)加入相對(duì)于頭孢菌素乙酰水解酶200倍摩爾量的2-巰基乙醇，并于氮?dú)猸h(huán)境下于37℃還原4小時(shí)。然后，向溶液內(nèi)加入相對(duì)于頭孢菌素乙酰水解酶190倍摩爾量的碘乙酸鈉，于37℃避光反應(yīng)10分鐘以完成還原性羧甲基化作用。然后再按上述方法用反相柱經(jīng)HPLC進(jìn)行純化。按照Laemmli(Nature，227，680-685(1970))所述的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析所得的頭孢菌素乙酰水解酶部分。只在分子量為35KD的位置上檢測(cè)到一條單一的帶，此表明純化達(dá)到均質(zhì)程度。此外，基于對(duì)溶解于含7M尿素之0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中的純化之頭孢菌素乙酰水解酶用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)作10倍稀釋后可使之再活化，以及使用上述HPLC經(jīng)分子篩柱層析可在分子量為280KD的位置上洗脫該活性材料的事實(shí)，表明該以天然形式存在的頭孢菌素水酰水解酶是由同源亞單位組成的八聚體。
另一方面，使用Hedrick等人(Arch.Biochem.Biophys.，126，155-164(1968))的方法測(cè)知分子量約為150KD，且在相關(guān)位置上檢測(cè)到該活性，提示四聚體也是有活性的。
用Edman降解法和肼水解法對(duì)純化的頭孢菌素乙酰水解酶作氨基酸末端分析，鑒定出其氨基末端是蛋氨酸，羧基末端是甘氨酸。
(2)頭孢菌素乙酰水解酶的部分氨基酸序列測(cè)定將純化的頭孢菌素乙酰水解酶(1mg)溶解于含有2M尿素的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.8)(1.0ml)中，向溶液內(nèi)加入賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(0.01mg)并使混合物于37℃反應(yīng)4小時(shí)。然后以HPLC分離反應(yīng)混合物。用Microbondapak C18(Waters)作柱并用漸增乙腈濃度的濃度梯度洗脫法進(jìn)行洗脫。為此，以含0.1%三氟乙酸的水溶液系統(tǒng)開(kāi)始，并使乙腈濃度增加到98%終濃度。于214nm處進(jìn)行檢測(cè)。在分離的峰值中，收集有長(zhǎng)滯留時(shí)間的不同部分，再次使用同樣的反相柱純化，并使用氣相自動(dòng)氨基酸序列分析儀(Applied Biosystems)分析該肽的氨基酸序列以確定出如圖3所示的從該肽片段之氨基末端到第34個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
2.合成DNA探針并標(biāo)記5′末端選擇按上述步驟1制得的圖3中劃下線的氨基酸序列，并合成相當(dāng)于由該氨基酸序列推斷之遺傳上可能之DNA堿基序列的寡核苷酸池。如圖4所示，合成了四組分別定名為探針CAH-RM1、CAH-RM2、CAH-RM3和CAH-RM4的寡核苷酸。寡核苷酸的合成是使用自動(dòng)DNA合成儀ZEON-GENET A-11(Nihon Zeon)進(jìn)行的。
使用T4多核苷酸激酶和〔γ-32P〕ATP，按照Wallace等人(Nucleic Acids Res.，6，3543-3557(1979))的方法標(biāo)記所得DNA探針的5′末端。
3.由枯草芽胞桿菌中提取和純化染色體DNA并進(jìn)行Southern雜交先用溶菌酶，再用N-月桂酰肌氨酸鈉處理枯草芽胞桿菌細(xì)胞，并按照Harris-Warrick等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，72，2207-2211(1975))的方法經(jīng)CsCl-溴化乙錠平衡密度梯度超離心法由所得溶胞產(chǎn)物中提取和純化染色體DNA。用各種限制酶(各約10單位)在適當(dāng)條件下消化DNA(1μg)，在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離所得反應(yīng)物。分析限制性酶切片段的電泳圖形后，按Southern等人(J.Mol.Biol.，98，503-517(1975))的方法對(duì)凝膠作Southern雜交。室溫下用含有0.5N NaOH的1.5M NaCl溶液處理該凝膠1小時(shí)，以使DNA變性，然后在含有1.5M NaCl的1M Tris-HCl緩沖液(pH7.0)中室溫下中和1小時(shí)。將一片硝酸纖維素膜放在凝膠上，以使DNA由凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上。使用轉(zhuǎn)移了DNA的硝酸纖維素膜與標(biāo)記的探針雜交。使用4倍濃度的SSC(1X SSC∶0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、10倍濃度的Denhardt′s溶液(1X Denhardt′s溶液0.02%Ficoll，0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清白蛋白)與大約1×106cpm/ml標(biāo)記的探針于38℃下雜交過(guò)夜。室溫下用4倍濃度的SSC將膜洗幾次，然后進(jìn)行放射自顯影。另外，逐步升高洗膜的溫度并于每次洗膜后重復(fù)進(jìn)行放射自顯影。發(fā)現(xiàn)盡管在較高洗膜溫度如48℃和53℃下，仍有幾條帶顯示出陽(yáng)性信號(hào)，而且雜交帶的大小依據(jù)所用限制酶而彼此不同。顯示陽(yáng)性信號(hào)的DNA片段中，2.5-3Kb Dral消化的和4-4.5Kb HindⅢ消化的片段更適于進(jìn)行基因克隆，因?yàn)樗鼈儽阮A(yù)期的基因更大些。
4.克隆頭孢菌素乙酰水解酶基因(1)構(gòu)建基因庫(kù)向按上述步驟3提取并純化的枯草芽胞桿菌染色體DNA中加入限制酶DraⅠ(約120單位)并于37℃保溫90分鐘。然后用等體積苯酚提取反應(yīng)物，并向所得水相內(nèi)加入乙醇以沉淀DNA。將所得DNA溶解在TE緩沖液〔10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0〕(60μl)，在瓊脂糖凝膠上電泳分離所得溶液，并切下相當(dāng)于2-4Kb大小的凝膠區(qū)域。使用可由市場(chǎng)上購(gòu)得的試劑盒(Bio 101，GENECLEAN)由凝膠中洗脫并回收DNA片段，然后溶解于TE緩冰液(30μl)中。
另一方面，使用pUC13作為構(gòu)建基因文庫(kù)的載體。將pUC13(10μg)與限制酶SmaⅠ(約100單位)混合，于37℃保溫140分鐘，然后于65℃下處理10分鐘。向該混合物內(nèi)加入磷性磷酸酶(BAP)(約20單位)并于65℃下繼續(xù)反應(yīng)80分鐘。按上述方法用苯酚提取并用乙醇沉淀DNA，最后將DNA溶解于TE緩沖液(50μl)中。
將含有DraⅠ消化之枯草芽胞桿菌染色體DNA片段的溶液(7.5μl)與含有SmaⅠ-BAP處理之載體pUC13片段的溶液(2.5μl)合并，并將混合物與T4DNA連接酶于6℃下保溫20小時(shí)，以連接各片段，得到重組DNA。按照Hanahan等人(J.Mol.Biol.，166，557-580(1983))的方法用所得重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101菌株。然后在置于含40μg/ml氨芐青霉素之L-肉汁〔1%bacto-胰蛋白胨、0.5酵母浸膏、0.5%NaCl(pH7.3)〕瓊脂培養(yǎng)基上的硝酸纖維素膜上形成菌落。以這些菌落作為枯草芽胞桿菌的基因庫(kù)。
(2)經(jīng)菌落雜交選擇頭孢菌素乙酰水解酶陽(yáng)性克隆將上述步驟(1)中在硝酸纖維素膜上形成的菌落復(fù)制到另一片硝酸纖維素膜上。將該復(fù)制膜置于含有40μg/ml氨芐青霉素的L-肉汁瓊脂培養(yǎng)基上并于37℃保溫3小時(shí)。然后，將膜轉(zhuǎn)移到含250μg/ml氯霉素的L-肉汁瓊脂培養(yǎng)基上并于37℃保溫過(guò)夜。然后基本上按照Grunstein等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，72，3961-3965(1975))的方法進(jìn)行菌落雜交。為此，用0.5N NaOH處理該膜(10-15分鐘)以溶解菌落并使DNA變性。然后，用1M Tris-HCl緩沖液(pH7.2)將膜中和5-10分鐘并繼續(xù)用含有1.5M NaCl的1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)處理10-15分鐘。將膜于減壓下80℃烘烤2小時(shí)以使DNA固定在膜上，之后使固定的DNA與標(biāo)記的探針CAH-RM2雜交。該反應(yīng)于38℃下在含有4倍濃度的SSC、10倍濃度的Denhardt溶液和大約2×106cpm/ml標(biāo)記之探針的溶液中進(jìn)行16小時(shí)。然后于室溫下將該膜用4倍濃度的SSC洗3-4次，再于38℃下洗2分鐘并進(jìn)行放射自顯影(曝光條件-80℃，3小時(shí))。為了檢測(cè)洗滌溫度與放射自顯影圖譜上信號(hào)之強(qiáng)度的相關(guān)性，逐漸升高洗滌溫度并在不同溫度下記錄放射自顯影結(jié)果。分別在43℃、48℃和53℃下各洗2分鐘。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30，000個(gè)菌落中有3個(gè)即使在高洗滌溫度下仍表現(xiàn)出陽(yáng)性信號(hào)。將這些菌落在含40μg/ml氨芐青霉素的L-肉汁(5ml)培養(yǎng)液中37℃保溫過(guò)夜并按照Birnboim等人(Nucleic Acids Res.，7，1513-1523(1979))的方法制備重組質(zhì)粒。用在載體DNA(pUC13)上有其切割位點(diǎn)的限制酶如EcoRⅠ、HindⅢ和PvuⅡ切割這些質(zhì)粒。然后在瓊脂凝膠上電泳分離被切割的各片段，并與標(biāo)記的探針進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)重組質(zhì)粒中的兩個(gè)含有與DNA探針清晰雜交的限制酶消化的片段。兩個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒間雜交片段的大小不同，因此被插入到載體DNA中的DNA片段也彼此不同。據(jù)此可區(qū)分這兩個(gè)重組質(zhì)粒并分別定名為pCAH01和pCAH02。
5.鑒定陽(yáng)性克隆及檢測(cè)堿基序列(1)鑒定陽(yáng)性克隆在試圖用各種限制酶裂解，以制備重組質(zhì)粒pCAH01和pCAH02之限制性酶切圖的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pCAH01具有兩個(gè)不同的DraⅠ消化的片段，而質(zhì)粒pCAH02至少有三個(gè)已插入到載體DNA之SmaⅠ位點(diǎn)中的不同的DraⅠ消化的片段，并且DNA探針與三個(gè)DraⅠ片段中的一個(gè)雜交。因此，將重組質(zhì)粒pCAH01用于下一步驟中。圖5中顯示了質(zhì)粒pCAH01的限制性酶切圖及DNA探針雜交的位置。
由于質(zhì)粒pCAH01含有兩個(gè)衍生于枯草芽胞桿菌染色體DNA的外源DraⅠ片段(1.8Kb和2.5Kb)，而且只有2.5Kb片段與DNA探針雜交，因此由質(zhì)粒中刪除1.8Kb DraⅠ片段。由質(zhì)粒pCAH01中除去含有2.5Kb片段的DraⅠ-PstⅠ片段(2.6Kb)，并插入到載體質(zhì)粒pUC13的SmaⅠ-PstⅠ位點(diǎn)上，以得到一小型化的重組質(zhì)粒pCAH03(5.3Kb)。重組質(zhì)粒pCAH03的限制性酶切圖示于圖6中。
(2)測(cè)定堿基序列由重組質(zhì)粒pCAH03中除去已與DNA探針雜交的0.24Kb EcoRⅠ-HindⅢ片段，并按照Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，74，5463-5467(1977))的方法測(cè)定其堿基序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該EcoRⅠ-HindⅢ片段中有與上述步驟1中得到頭孢菌素乙酰水解酶之部分氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的堿基序列，此表明該片段含有頭孢菌素乙酰水解酶基因的一部分?；谫|(zhì)粒pCAH03的限制性酶切圖譜進(jìn)一步測(cè)定DraⅠ和HindⅢ位點(diǎn)間(0.38Kb)及EcoRⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)間(1.45Kb)的堿基序列，而揭示出如圖7所示的DraⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)間約2Kb的堿基序列。這一點(diǎn)證明了存在編碼含318個(gè)氨基酸殘基之蛋白質(zhì)的堿基序列，且所說(shuō)的氨基酸序列中含有由轉(zhuǎn)譯起始密碼子ATG編碼的蛋氨酸。另外，由上述堿基序列編碼的假定蛋白質(zhì)在其分子量、氨基末端和羧基末端氨基酸、以及經(jīng)賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶消化之片段的氨基酸組成上均與頭孢菌素乙酰水解酶有良好的一致性，因此可以相信該蛋白質(zhì)必定是頭孢菌素乙酰水解酶。據(jù)此證明了頭孢菌素乙酰水解酶的結(jié)構(gòu)基因完全包含在質(zhì)粒pCAH03上的枯草芽胞桿菌衍生的DNA片段中。
6.構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒已克隆的質(zhì)粒pCAH03上的得自枯草芽胞桿菌的DNA片段含有一個(gè)頭孢菌素乙酰水解酶以外的區(qū)域，因此按照?qǐng)D8中所圖示的方法刪除此被認(rèn)為與基因之表型表達(dá)無(wú)關(guān)的區(qū)域。
為了驅(qū)動(dòng)在大腸桿菌中有效地高表達(dá)外源性基因，一般是構(gòu)建一個(gè)其中所需結(jié)構(gòu)基因直接被連接在由具有高表達(dá)效率之啟動(dòng)子、SD序列和轉(zhuǎn)譯起始密碼子ATG組成之序列后面的表達(dá)質(zhì)粒。因此，為了在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)生大量頭孢菌素乙酰水解酶，可按照?qǐng)D9中圖示的方法，使用含有啟動(dòng)子、SD序列和ATG的載體來(lái)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建過(guò)程中，可按下述方法制備頭孢菌素乙酰水解酶結(jié)構(gòu)基因。將含有整個(gè)所需基因的區(qū)域克隆到M13mp系列的載體中，以得到一單股DNA。按照所謂的引物擴(kuò)展方法，使用指定編碼頭孢菌素乙酰水解酶之氨基末端序列上除蛋氨酸外之幾個(gè)氨基酸的寡核苷酸作為引物，得到一個(gè)其中只有頭孢菌素乙酰水解酶結(jié)構(gòu)基因部分為雙鏈的DNA片段。
圖10顯示構(gòu)建經(jīng)修飾之表達(dá)質(zhì)粒的方法，所說(shuō)的質(zhì)粒與按圖9所示方法制備的表達(dá)質(zhì)粒相比，表現(xiàn)提高了拷貝數(shù)，且攜帶四環(huán)素(Trc)抗性標(biāo)志而不是氨芐青霉素(Arp)抗性標(biāo)志。
下面對(duì)各步驟作更為詳細(xì)地描述。
(1)構(gòu)建小型化質(zhì)粒為了縮短頭孢菌素乙酰水解酶結(jié)構(gòu)基因(圖8中縮寫(xiě)為CAH)的下游區(qū)，用EcoRV和BamHⅠ切割質(zhì)粒pCAH03，純化所得到的約4.1Kb DNA片段，然后使用DNA聚合酶Klenow片段填充因BamHⅠ消化所產(chǎn)生的3′短縮之末端(圖8)。進(jìn)一步純化之后，用T4DNA連接酶連接，以構(gòu)建含有頭孢菌素乙酰水解酶基因的小型化質(zhì)粒pCAH10。
(2)制備用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的單股DNA用SacⅠ和SalⅠ切割上述步驟(1)中制得的小型化質(zhì)粒pCAH10，純化所得到的約1.5Kb片段并作為SacⅠ-SalⅠ片段回收之。另一方面，用SacⅠ和SalⅠ切割雙股噬菌體M13mp11DNA。然后將上述SacⅠ-SalⅠ片段加到后者中，用T4DNA連接酶連接，以構(gòu)建含有完整頭孢菌素乙酰水解酶基因的雙股噬菌體M13-CAH DNA。繼之，按Messing(Methods in Enzymology，101.20-78(1983))的方法制備其單股DNA。
(3)引物延伸基本上按照Goeddel等人(Nucleic Acids Res.，8，4057-4074(1980))的方法，除去位于頭孢菌素乙酰水解酶起始位點(diǎn)(ATG)上游的、得自枯草芽胞桿菌的蛋白質(zhì)非編碼區(qū)，以制備一個(gè)含有頭孢菌素乙酰水解酶結(jié)構(gòu)基因的區(qū)域。合成一條具有相當(dāng)于頭孢菌素乙酰水解酶氨基末端第二個(gè)氨基酸谷氨酸至第7個(gè)氨基酸脯氨酸之堿基序列的寡核苷酸，以其作為用于引物延伸的引物并定名為CAH-P1。然后將引物CAH-P1(3pmole)加到上述步驟(2)中制備的噬菌體M13-CAH的單股DNA中，將此混合物加熱到60℃保持20分鐘，然后放置至室溫。繼之向混合物中加入dATP、dCTP、dGTP和dTTP(各0.25mM)和DNA聚合酶Klenow片段(2單位)，并在含7mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)、7mM MgCl2、0.1mM EDTA和20mM NaCl的反應(yīng)混合物(20μl)中，于37℃使引物延伸進(jìn)行2小時(shí)。反應(yīng)后進(jìn)行苯酚提取和乙醇沉淀。將DNA溶解于小量蒸餾水中，向其中加入S1核酸酶(4單位)，并在含有30mM乙酸鈉(pH4.6)、100mM NaCl和1mM ZnSO4的反應(yīng)混合物(40μl)中37℃保溫30分鐘，以消化剩余的單股DNA。對(duì)含所得雙股DNA片段的溶液進(jìn)行苯酚提取，然后用乙醇沉淀，并按照上述方法用DNA聚合酶Klenow片段處理該DNA，以進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)。
(4)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒本實(shí)施例用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的載體pKK233-2(氨芐青霉素抗性)購(gòu)自Pharmacia公司。該載體是ATG載體的成員，它含有Trc啟動(dòng)子并可經(jīng)限制酶NcoⅠ消化和充填3′短缺末端后直接在起始密碼子ATG之后被切割。如圖9所示，用PstⅠ切割上述步驟(3)中制得的含頭孢菌素乙酰水解酶結(jié)構(gòu)基因的DNA片段，并分離和純化1.27Kb DNA片段。另一方面，用NcoⅠ切割含Trc啟動(dòng)子的pKK233-2并用DNA聚合酶Klenow片段處理。然后用PstⅠ切割所得片段，得到約4.6Kb的DNA片段?；旌仙鲜鰞善尾⒂肨4DNA連接酶連接之，用所得混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103菌株，并選擇在含40μg/ml氨芐青霉素之L-肉汁瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落。將這些菌落在L-肉汁培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜，收集細(xì)胞，從細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，并測(cè)定ATG載體與含頭孢菌素乙酰水解酶基因之片段的接合處附近的堿基序列。結(jié)果得到一個(gè)某中不包括氨基末端蛋氨酸之頭孢菌素乙酰水解酶的結(jié)構(gòu)基因已緊接ATG密碼子后面被插入的表達(dá)質(zhì)粒，并定名為pCAH21。并將攜帶該表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌定名為大腸桿菌JM103/pCAH21。
表達(dá)質(zhì)粒pCAH21的復(fù)制系統(tǒng)得自pBR322。因此，為了增加該質(zhì)粒的拷貝數(shù)以提高在大腸桿菌中的表達(dá)水平，將其復(fù)制區(qū)域(ori)換成得自pAT153的相應(yīng)區(qū)域。同時(shí)將抗藥標(biāo)志由氨芐青霉素抗性(Arp)換成四環(huán)素抗性(Trc)。圖10中圖解顯示了修飾該質(zhì)粒的過(guò)程。首先用BamHⅠ切割質(zhì)粒pCAH21并用DNA聚合酶Klenow片段處理。然后用ScoⅠ切割所得片段，得到含Trc啟動(dòng)子、頭孢菌素乙酰水解酶基因和5S核糖體RNA之T1T2終止子(5SrrnBT1T2)的約2.4Kb DNA片段。用可從市場(chǎng)上購(gòu)得的質(zhì)粒pAT153作為載體質(zhì)粒。用EcoRⅠ切割質(zhì)粒pAT153，用DNA聚合酶Klenow片段處理，然后再用DraⅠ切割之。再者，為了防止載體的自身連接，可用堿性磷酸酶處理，并制備含有源于pAT153之復(fù)制區(qū)域和四環(huán)素抗性基因的約2.5Kb DNA片段。然后混合上述兩個(gè)DNA片段并用T4DNA連接酶連接之，用所得混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103菌株，并選擇在含20μg/ml四環(huán)素之L-肉汁瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落。這些菌落在L-肉汁中培養(yǎng)過(guò)夜后收集細(xì)胞，由細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA并經(jīng)限制酶裂解法分析之。結(jié)果得到連接方向不同的兩種重組質(zhì)粒。將其中頭孢菌素乙酰水解酶基因的方向與四環(huán)素抗性基因方向相同的質(zhì)粒定名為pCAH211，并將另一個(gè)其中兩基因之插入方向相反的質(zhì)粒定名為pCAH212。另外，將攜帶這些重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株分別定名為大腸桿菌JM103/pCAH211和大腸桿菌JM103/pCAH212。
7.在大腸桿菌中表達(dá)頭孢菌素乙酰水解酶基因(1)表達(dá)頭孢菌素乙酰水解酶基因?qū)⒋竽c桿菌JM103/pCAH211或大腸桿菌JM103/pCAH212接種在含20μg/ml四環(huán)素的2倍濃度之L-肉汁培養(yǎng)液(50ml)(在0.5L體積的燒瓶中)上，并于37℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。取一等份培養(yǎng)液(0.5ml)離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)(0.5ml)中并用超聲波發(fā)生器破碎之。離心該溶液得到的上清被用作含所需酶的樣品溶液。另一方面，將離心上述步驟1中制得的枯草芽胞桿菌之培養(yǎng)液所得上清液用作進(jìn)行比較所需的酶溶液。頭孢菌素乙酰水解酶不僅作用于頭孢菌素C和7-ACA，而且還可作用于醋酸對(duì)位硝基酚(下稱pNPA)，以生成有色物質(zhì)對(duì)硝基苯酚(下稱pNP)?？捎梅止夤舛确z測(cè)pNP，因而可采用以pNPA為底物的方法作為檢測(cè)頭孢菌素乙酰水解酶活性的簡(jiǎn)單方法。反應(yīng)于30℃下在含有0.02%pNPA、0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.8)和上述酶溶液的混合物(3ml)中進(jìn)行，并用分光光度計(jì)檢測(cè)400nM吸光率以確定酶活性。在pH6.8、30℃溫度條件下，每分鐘產(chǎn)生1μM pNP所需的酶量被定義為1單位(U)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每份大腸桿菌JM103/pCAH211和大腸桿菌JM103/pCAH212之培養(yǎng)液的酶活性分別為9.9U/ml和12.4U/ml。而枯草芽胞桿菌的酶活性為0.36U/ml。
此外，構(gòu)建了一個(gè)其中以衍生于大腸桿菌色氨酸操縱子的Trp啟動(dòng)子和SD-ATG序列代替表達(dá)質(zhì)粒pCAH211之Trc啟動(dòng)子和SD-ATG序列的質(zhì)粒。經(jīng)轉(zhuǎn)化作用將該質(zhì)粒插入大腸桿菌JM109中之后，按上述相似方法培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體，渢每份培養(yǎng)液的酶活性為75.5U/ml。
使用大規(guī)模培養(yǎng)裝置如發(fā)酵罐，在適當(dāng)培養(yǎng)條件下，于適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶這些表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌，可使頭孢菌素乙酰水解酶的產(chǎn)量得以增加。
(2)頭孢菌素C和7ACA的脫乙?；饔靡灶^孢菌素C或7ACA作為底物，用大腸桿菌JM103/pCAH212產(chǎn)生的酶溶液使之脫乙?；Ｏ蚝?0mM底物的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)(1.0ml)內(nèi)加入酶溶液(0.2ml)后，使反應(yīng)于37℃下進(jìn)行40分鐘，并加入0.2M醋酸鹽緩沖液(pH4.0)(1.2ml)終止反應(yīng)。所得溶液過(guò)HPLC柱后，檢測(cè)脫乙酰頭孢菌素C或脫乙酰-7ACA。用Cosmosil 5C8(Nacalaitesque)作柱并用逐漸增加甲醇濃度的濃度梯度洗脫法洗脫。為此，使用含20mM NaH2PO4和5mM四正丁基氫氧化銨(TBAH)，甲醇濃度升高至20%的溶液。在254nm處檢測(cè)脫乙?；a(chǎn)物。頭孢菌素乙酰水解酶的活定義如下于37℃和pH7.0條件下，每分鐘產(chǎn)生1微摩爾產(chǎn)物所需要的酶量定義為1個(gè)單位(U)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于頭孢菌素C和7ACA來(lái)說(shuō)，每份大腸桿菌JM103/pCAH212之酶溶液的培養(yǎng)液酶活性為7.4U/ml。
(3)重組頭孢菌素乙酰水解酶的結(jié)構(gòu)經(jīng)檢測(cè)大腸桿菌中所產(chǎn)生之頭孢菌素乙酰水解酶活性形式和亞單位的分子量，得到與上述步驟1中相同的結(jié)果，表明重組頭孢菌素乙酰水解酶也以與天然形式相似的八聚體形式存在。
此外還用反相柱以HPLC純化該重組頭孢菌素乙酰水解酶。以Edman降解和肼水解法進(jìn)行末端分析，揭示該酶的氨基和羧基末端分別是蛋氨酸和甘氨酸，此與其天然形式的末端氨基酸相同。另外用自動(dòng)氨基酸序列分析儀檢測(cè)氨基酸序列，表明直到第25個(gè)氨基酸的氨基酸序列與根據(jù)結(jié)構(gòu)基因推斷者(圖2)完全相同。
如上面實(shí)施例中所詳細(xì)描述的，本發(fā)明人已進(jìn)一步證實(shí)，經(jīng)克隆由枯草芽胞桿菌產(chǎn)生之編碼頭孢菌素乙酰水解酶的基因，并使用可在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的載體構(gòu)建含該基因的重組質(zhì)粒，可以更為有效地產(chǎn)生頭孢菌素乙酰水解酶。這就為該酶的廣泛應(yīng)用提供了前提條件。另外，含有已克隆之頭孢菌素乙酰水解酶基因的DNA片段為更有利地利用頭孢菌素乙酰水解酶的功能提供了一個(gè)極為有力的工具。
勘誤表 CPCH916280W
權(quán)利要求
1.編碼圖1所示氨基酸序列的DNA堿基序列。
2.向用于大腸桿菌宿主-載體系統(tǒng)的載體內(nèi)引入權(quán)利要求1的DNA堿基序列而制得的重組DNA分子。
3.用權(quán)利要求2的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。
4.具有圖1所示之氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
5.具有圖1所示之氨基酸序列且在該氨基酸序列的氨基末端含有蛋氨酸的蛋白質(zhì)。
6.由權(quán)利要求3的大腸桿菌產(chǎn)生的根據(jù)權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)。
7.由權(quán)利要求3的大腸桿菌產(chǎn)生的根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)。
8.由權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)之多聚體組成的酶。
9.由權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)之多聚體組成的酶。
10.由權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)之多聚體組成的酶。
11.由權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)之多聚體組成的酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的酶，其為所說(shuō)之蛋白質(zhì)的四聚體或八聚體。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的酶，其為所說(shuō)之蛋白質(zhì)的四聚體或八聚體。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的酶，其為所說(shuō)之蛋白質(zhì)的四聚體或八聚體。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的酶，其為所說(shuō)之蛋白質(zhì)的四聚體或八聚體。
16.制備權(quán)利要求4之蛋白質(zhì)的方法，特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求3的大腸桿菌細(xì)胞并由培養(yǎng)液中回收所說(shuō)的蛋白質(zhì)。
17.制備權(quán)利要求5之蛋白質(zhì)的方法，特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求3的大腸桿菌細(xì)胞并由培養(yǎng)液中回收所說(shuō)的蛋白質(zhì)。
18.制備權(quán)利要求8之酶的方法，特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求3的大腸桿菌細(xì)胞并由培養(yǎng)液中回收所說(shuō)的酶。
19.制備權(quán)利要求9之酶的方法，特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求3的大腸桿菌細(xì)胞并由培養(yǎng)液中回收所說(shuō)的酶。
20.制備權(quán)利要求12之酶的方法，特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求3的大腸桿菌細(xì)胞并由培養(yǎng)液中回收所說(shuō)的酶。
21.制備權(quán)利要求13之酶的方法，特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求3的大腸桿菌細(xì)胞并由培養(yǎng)液中回收所說(shuō)的酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了頭孢菌素乙酰水解酶基因、將所說(shuō)的基因插入用于大腸桿菌宿主-載體系統(tǒng)之載體內(nèi)而制得的重組DNA分子、用所說(shuō)的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞、具有由所說(shuō)之基因編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、由所說(shuō)之蛋白質(zhì)的多聚體組成的酶、以及制備所說(shuō)的蛋白質(zhì)或酶的方法，所說(shuō)的頭孢菌素C和7-ACA轉(zhuǎn)化為其脫乙?；a(chǎn)物如脫乙酰頭孢菌素C和脫乙酰7-ACA的酶，這些脫乙?；a(chǎn)物可用作制備各種衍生之頭孢菌素抗生素的中間體。
文檔編號(hào)C12P35/00GK1058045SQ9110323
公開(kāi)日1992年1月22日 申請(qǐng)日期1991年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1990年4月27日
發(fā)明者光島健二, 瀧本明生, 八木滋雄, 園山高康 申請(qǐng)人:鹽野義制藥株式會(huì)社