專利名稱：制備具有逆病毒基因表達能力和翻譯后加工能力的質(zhì)粒的方法和產(chǎn)生的質(zhì)粒及其表達產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備表達載體的方法和產(chǎn)生的質(zhì)粒及由該制備方法獲得的表達產(chǎn)物，該載體允許同時進行逆病毒基因表達和翻譯后加工。更詳細地說，本發(fā)明涉及一種制備質(zhì)粒的方法，該方法通過應(yīng)用重組體DNA技術(shù)引起逆病毒gag和pol基因表達，同時通過其中蛋白酶引起上述表達產(chǎn)物本身的加工，和大量產(chǎn)生三種由gag基因編碼的核心蛋白質(zhì)，包括p17、p24和p15，及三種由pol基因編碼的酶，包括蛋白酶，逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，各自和獨立以成熟或活性蛋白質(zhì)分子的形式。以及由上述方法獲得的質(zhì)粒及其表達產(chǎn)物。本發(fā)明也提供具有nef基因高表達能力的質(zhì)粒和其表達產(chǎn)物的Nef蛋白質(zhì)分子。
逆病毒是類屬于逆病毒家族的種屬名稱，其特征在于如同被膜，單鏈RNA基因組和逆轉(zhuǎn)錄酶那樣的一般特征。這種病毒為直徑80-100nm的球形，其基因組由分子量約3×106的兩個線性(+)鏈RNA分子組成。這兩個分子形成轉(zhuǎn)化二聚體。
更詳細地說，逆病毒科進一步分成下述三個亞科腫瘤病毒，慢病毒和泡沫病毒(R.E.F.Matthews Edt.“Classification and Nomenclature of Viruses-Fourth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses”，pp124-pp128，S.Karger〔swiss〕，1982)。分類作為腫瘤病毒，也稱為RNA腫瘤病毒的已知病毒包括人的T細胞白血病病毒，貓白血病毒鼠類肉瘤病毒、莫洛尼氏鼠類白血病毒、牛白血病毒、豬白血病毒、鳥類白血病病毒、鳥類肉瘤病毒、鳥類成髓細胞瘤病毒和勞氏相關(guān)的病毒。歸入引起慢性病毒感染的通常稱為慢病毒這一類的已知病毒包括1型和2型人的免疫缺乏病毒(下文分別稱為“HIV-1”和“HIV-2”)，猿猴免疫缺乏病毒、引起羊腦脊髓炎的維斯納(Visna)病毒、引起南非羊肺炎的梅迪(meadi)病毒、羊的關(guān)節(jié)炎腦炎病毒、馬感染性貧血病毒和牛淋巴結(jié)炎病毒(“Current Topics in AIDS，”Vol.1，pp.95-117，John Wiler & Sons，1987;Advances in Virus Research，Vol.34，P.189-215，1988)。歸入泡沫病毒這一類的病毒，使象人、猴、牛和貓這樣的哺乳動物感染。由這些宿主分離出的泡沫病毒和合胞體病毒是眾所周知的。按照本文使用的術(shù)語逆病毒可理解為包括所有病毒，已知的和未知的，也可如上面所述描述成的逆病毒。
不僅從逆病毒在人和其他動物中引起嚴重的和往往是致命的疾病感染觀點來看，逆病毒是重要的，而且對于判斷如肉瘤那樣的疾病以及對于制備用于研究和遺傳工程中物質(zhì)來說，逆病毒也是有用的。因此，已出版了很多有關(guān)這些病毒的文獻。眾所周知，在1980年以前，作為用于致癌基因機制的模型已研究過逆病毒，并且逆病毒與新的和奇怪的慢病毒感染疾病有連帶關(guān)系，這種疾病引起不能治愈的繼發(fā)疾病。自從1981年在美國發(fā)現(xiàn)AIDS疾病以來，為了制定治療療和預(yù)防AIDS的方法，關(guān)于各種逆病毒的研究已利用包括流行病學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)和分子生物學(xué)在內(nèi)的全部技術(shù)領(lǐng)域進行深入細致的研究。已經(jīng)積累了大量有用的關(guān)于AIDS的報告(Advancesin Virus Research，Vol.34，PP.189-215，1988;Annual Review of Immunology，Vol.6，PP.139-159，1988;Microbial Pathogenesis，Vol.5，PP.149-157，1988;“HIV and Other Highly Pathogenic，Viruses”PP.33-41，Academic Press，Inc.，1988;“The control of Human Retrovirus Gene Expression”.PP.79-89，Cold Spring Harbor Laboratory，1988;Cytological Engineering，Vol.7(Suppl.1)，PP.S5-S15，1988)。
在慢病毒中，病毒基因組在病毒微粒核心中形成一種帶有逆轉(zhuǎn)錄酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和引物tRNA的復(fù)合體。該病毒基因組含有約10個不同的基因，包括三個堿性主基因，該基因?qū)Σ《驹鲋硜碚f是必不可少的病毒微粒成分進行編碼，即對核心蛋白質(zhì)的前體編碼的gag(群特異性抗原)基因，對三種不同酶的前體編碼的pol(聚合酶)基因和對被膜糖蛋白的前體編碼的env(被膜)基因;這些基因按gag、pol和env順序從5′端到3′端排列。慢病毒，例如HIV也含有罕見的基因vif，這些基因以gag、pol、vif和env的特殊順序排列。pol基因的5′端區(qū)部分與gag基因的3′端區(qū)部分重疊約240個堿基，并具有不同的解讀密碼;在這種重疊部分翻譯過程中發(fā)生移碼。在分子量為55kd的前體蛋白質(zhì)翻譯之后，從總長度約1.5kb(包括重疊部分)的完整基因區(qū)發(fā)生切割，即被蛋白酶加工，而這被認為能形成三種蛋白質(zhì)，即按上述列舉的順序是P17、P24和P15，它們分別用作基質(zhì)蛋白質(zhì)、衣殼和核蛋白殼。具有總長度約3kb的完整基因區(qū)的表達產(chǎn)生上述酶前體(分子量100kd)，該酶前體以一種能夠表示為NH2-蛋白酶-整合酶-COOH的融合蛋白質(zhì)形式出現(xiàn)，于是，這種融合蛋白質(zhì)本身在產(chǎn)生的現(xiàn)有蛋白酶的作用下，在相同分子中通過病毒和蛋白酶的作用被切斷或被劈開，而這種被稱為加工的過程被認為能將融合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成單個的成熟蛋白質(zhì)(活性蛋白質(zhì))，即單獨酶，包括蛋白酶(P12)、逆轉(zhuǎn)錄酶(P66和P51)和整合酶(P32)(Journal of Virology，Vol.62，No.5，PP.1808-1809，1988)。
上述所有酶在病毒增殖過程中和產(chǎn)生的感染中起重要作用，而且下述功能已被確定或推測蛋白酶參與翻譯后加工、核心形成及病毒微粒成熟，而這對于由病毒衍生的病毒是很特異的。已知逆轉(zhuǎn)錄酶有三種不同的酶活性。這樣，逆轉(zhuǎn)錄酶起到依賴于RNA的DNA聚合酶催化基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA的作用，這是病毒增殖過程的基本步驟。同時，酶的核糖核酸酶H活性特別消化所形成的RNA-DNA異源雙鏈的RNA鏈，而依賴于DNA的DNA聚合酶活性產(chǎn)生雙鏈DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶在遺傳重組中一般用作工具。整合酶是一種對DNA鏈起作用的核酸內(nèi)切酶，并且識別和催化線性或環(huán)形病毒雙鏈DNA部分的切斷，這已從整合成宿主染色體DNA的病毒基因組錄制到，并因此被認為參與原病毒形成過程(“HIV and Other Highly Pathogenic Viruses”，PP.33-41，Academic Press，Inc.，1988;“The Control of Human Retrovirus Gene Expression，”PP.79-89，Cold spring Harbor Laboratory，1988;Cell Technology(in Japanese)，Vol.7(Suppl.1)，PP.S5-S15，1988;AIDS Journal(in Japanese)，Vol.1，No.3，PP.291-300，1988;Aids，Vol.2(Suppl.1)，PP.S29-40，1988;KAGAKU-TO-SEIBUTSU(in Japanese)，Vol.27，No.4，PP.218-227，1989)。
總長度約0.4kb的nef基因區(qū)編碼分子量約27kd的負調(diào)節(jié)因子，而該調(diào)節(jié)因子被認為能通過對HIV基因組的表達的抑制作用阻止HIV增殖，并因而涉及到潛伏性感染(“Virology”，edited by B.N.Fields，et al.，Vol.2，PP.1534-1535，published by Raven press〔U.S.〕，1990)。
為了發(fā)展用于人和動物的疫苗及診斷藥物，在世界不同地區(qū)已廣泛進行大量生產(chǎn)基因產(chǎn)物(下文稱為“抗原”)。作為一個典型例子，在下面概述AIDS病毒抗原的大量生產(chǎn)。在大量生產(chǎn)研究中主抗原包括env基因的糖蛋白gp160前體及其加工的產(chǎn)物gp120和gp41(“Forefront of Countermeasures Against AIDS”，edited and authored by Toshiaki Komatsu，Vol.2，pp.477-495，published by CMC，1989)。為了生產(chǎn)gp160，例如已報導(dǎo)使用液泡病毒(vacuolovirus)載體和昆蟲細胞(proceedings of National Academy of Sciences“USA”，Vol.84，PP.6924-6928，1987)，重組體牛痘病毒和BSC-40或海拉(Hela)細胞(Nature，Vol.320，PP.537-540，1986;Nature，Vol.330，PP.259-262，1987)和腺病毒載體和A549細胞(“Vaccine 89”，PP.207-217，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)。也有用插入的并與gp120基因區(qū)和CHO細胞株連接的質(zhì)粒表達gp120基因區(qū)的報導(dǎo)(Science，Vol.233，PP.209-212，1986)，及用大腸桿菌(Escherichia coli)生產(chǎn)gp120的報導(dǎo)(Science，Vol.234，pp.1392-1395，1986)。另外，與這方面有關(guān)的已知技術(shù)歸入一類并簡短地列舉如下(下文歐洲專利公開No.縮寫為〔EP〕，聯(lián)邦德國專利公開No.縮寫為〔DE〕，美國專利申請No.縮寫為〔US〕，PCT的國際專利公開No.縮寫為〔WO〕法國專利公開No.縮寫為〔FR〕)(1)目的在于大量表達基因，如gag、pol和env(下文描述用于每個被使用的宿主)的技術(shù)大腸桿菌(EP331961、EP322394、DE3727137、DE3724016、EP293792、US88-168486、US88-218304、US87-110348、EP255190、WO87/07296、DE3711016、EP227169、EP199301、EP219106);
酵母(DE3804891、EP322394、US88-168486);
(2)為生產(chǎn)用基因，如gag、pol和env插入重組體牛痘病毒的技術(shù)日本專利公開No.1-148183、FR2620030、FR2607518、FR2600079、FR2587720、FR2596711、EP256677、WO87/06260、WO87/06262;
(3)由病毒載體產(chǎn)生env基因表達的技術(shù)使用多形瘤病毒(日本專利公開No.1-39991)和液泡病毒(EP272858、EP265785);以及(4)為產(chǎn)生AIDS病毒抗原表達，如帶有乙型肝炎病毒抗原的融合蛋白質(zhì)的技術(shù)(EP278940)。
除了可用作活疫苗的一種有效成分的重組體病毒的生產(chǎn)技術(shù)以外，例如包括大量表達，除宿主外的基因產(chǎn)物的分泌物和翻譯后的加工的三部分是十分重要的，以便借助于表達載體在工業(yè)生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)中保證低生產(chǎn)成本和高質(zhì)量，并且必須在構(gòu)建表達載體中研究這三個部分。正如上所述的現(xiàn)有技術(shù)概況所知，許多研究人員研究了大量表達，而分泌生產(chǎn)體系(Nippon Nogeikagaku Kaishi(in Japanese)，Vol.60，No.5，PP.1035-1063，1990)的發(fā)展正在廣泛地和積極地進行。但是，與翻譯后的加工計劃相比，盡管它的重要性在于節(jié)省基因產(chǎn)物提純過程中的勞動和改進該產(chǎn)物的純度，卻一點也沒有給予注意。因此顯然，發(fā)展翻譯后允許加工的表達體系具有重要意義。由于Nef蛋白質(zhì)在診斷AIDS和解釋危象機制方面以及從其抗原性和功能觀點看在治療方面都是有用的，因此確定大量生產(chǎn)技術(shù)是所期望的。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明進行了廣泛的研究，結(jié)果成功地導(dǎo)致由逆病毒gag和pol基因編碼的6種蛋白質(zhì)的大量表達，并導(dǎo)致對其加工。更詳細地說，本發(fā)明通過完成制備質(zhì)粒來實現(xiàn)，該質(zhì)粒允許以高和穩(wěn)定的產(chǎn)率及低成本大量生產(chǎn)三種病毒核心蛋白質(zhì)，包括P17、P24和P15的逆病毒gag基因產(chǎn)物及三種酶，它們是pol基因產(chǎn)物，包括蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，各自和單獨地以成熟的和活性的蛋白質(zhì)分子形式。這種成就通過充分使用重組體DNA技術(shù)制備一種與所制備的那種病毒的基因cDNA片段連接的質(zhì)?？赡苓_到，以便在誘導(dǎo)大量表達基因內(nèi)或在基因直接表達載體內(nèi)通過匹配翻譯密碼含有作為一種主要成分的逆病毒的蛋白酶基因，產(chǎn)生以高產(chǎn)率表達上述基因產(chǎn)物的質(zhì)粒，并用已表達的蛋白酶標記該基因產(chǎn)物本身的加工。直接表達意指不使逆病毒基因以帶有一種不同蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)形式間接表達，這種不同蛋白質(zhì)由在載體中已預(yù)先組合的基因產(chǎn)生。此外，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，通過插入和連接上述基因cDNA將所構(gòu)建的質(zhì)粒引入一個宿主細胞中能夠獲得一種轉(zhuǎn)化體，而且又能穩(wěn)定地極大量地產(chǎn)生上述核心蛋白質(zhì)和由上述cDNA編碼的酶，不是作為融合蛋白質(zhì)而是作為具有特殊活性的各自成熟的蛋白質(zhì)，在培養(yǎng)產(chǎn)物時，使用如下所述的用于培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體的兩步培養(yǎng)法。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種加工是在蛋白酶的特殊活性作用下形成融合蛋白質(zhì)部分，該融合蛋白質(zhì)是上述基因的一種表達產(chǎn)物，即上述加工是逆病毒蛋白酶基因內(nèi)在現(xiàn)象。此外，發(fā)現(xiàn)如此加工的上述蛋白質(zhì)是易于大量產(chǎn)生和提純的，具有極好的高純度和均勻性，而尤其酶活性和抗原性二者的特點在于只有逆病毒才有的高基質(zhì)特殊性。發(fā)明人也完成了大量產(chǎn)生具有一種極特殊抗原性的Nef蛋白質(zhì)。本發(fā)明是在這些研究結(jié)果的基礎(chǔ)上完成的。
按照本發(fā)明，提供一種制備質(zhì)粒的方法和所產(chǎn)生的質(zhì)粒及其表達產(chǎn)物，該質(zhì)粒能夠大量表達或大量產(chǎn)生和加工分別由與逆病毒有關(guān)的gag、pol和nef基因編碼的各類蛋白質(zhì)。這種質(zhì)粒和核心蛋白質(zhì)，包括P17、P24和P15及象蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶這樣的酶以及是質(zhì)粒表達產(chǎn)物的Nef蛋白質(zhì)，作為用于研究防止和治療逆病毒感染疾病的物質(zhì)是十分有用的，以及在象遺傳工程、蛋白質(zhì)工程、分子生物學(xué)這樣的領(lǐng)域作為試劑，和發(fā)展醫(yī)療藥物及抗逆病毒感染疾病的抗病毒劑，作為用于制備疫苗的抗原，診斷藥物及抗體都是十分有用的。


圖1是一個曲線圖，它圖示說明大腸桿菌的原提取我把逆轉(zhuǎn)錄酶活性值，該E.coli(大腸桿菌)是用攜帶HIV pol基因的質(zhì)粒pPG280進行轉(zhuǎn)化的，和用不具有HIV pol基因的載體pUR290進行轉(zhuǎn)化的;圖2是一個圖形，它圖示說明用從HIV載體獲得的人血清進行Western印跡分析的結(jié)果，及用攜帶HIV pol基因的質(zhì)粒pPG280和用不具有HIV pol基因的載體pUR290轉(zhuǎn)化的E.coli的粗提物的結(jié)果;圖3是一個曲線圖，它圖示說明由E.coli衍生的逆轉(zhuǎn)錄酶在陰離子交換柱上的洗脫曲線;圖4是一個曲線圖，它圖示說明用Affi-Gel Heparin色譜法提純逆轉(zhuǎn)錄酶。
本發(fā)明有下列組成部分(Ⅰ)選擇逆病毒基因和制備cDNA片段對于逆病毒基因來說，可以使用象反轉(zhuǎn)座子的gag和pol這樣的基因。更準確地說，就HIV來說，例如，使用在編碼核心蛋白質(zhì)P17、P24和PP15的gag區(qū)內(nèi)的基因和在編碼蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及整合酶的pol區(qū)內(nèi)的基因。這些基因表達需要使用蛋白酶基因，所制備的逆病毒基因cDNA片段，以使至少或最少含從上面列舉的逆病毒基因中作為例子的蛋白酶基因區(qū)，通過在匹配讀碼中向一個能夠被高度表達的基因鏈合被使用。在基因表達中，利用重組體DNA技術(shù)，其中逆病毒基因組是RNA，這些基因在轉(zhuǎn)化成互補DNA后被使用。這種cDNA可以通過或者克隆一種原病毒基因組或者克隆一種結(jié)合病毒的基因DNA來制備。另一方面，必不可少的cDNA也可以從cDNA庫得到，這種cDNA庫使用傳統(tǒng)技術(shù)直接從基因組病毒RNA制成。但是，任何依賴于直接使用逆病毒的制備技術(shù)都帶來連帶的感染危險。因此，為了避免直接用病毒處理的危險并為了在上述制備方法中省力，推薦使用已知的和公開可以買到的已克隆逆病毒基因組cDNA。更詳細地說，如以前所述，各種逆病毒的克隆，它們的順序，限制性內(nèi)切酶圖的制備早已被全世界研究人員報導(dǎo)過，而由于安全和方便的因素，它們達到利用可能是有希望的。所得到的克隆例如包括質(zhì)粒pSRA2(Journal of Virology，Vol.36，pp.50-61，1980)，它具有鳥類肉瘤病毒基因組，HIV-1原病毒基因組克隆，即質(zhì)粒pNL3-1、pNL3-2和pNL4-3(Journal of Virology，Vol.59，pp.284-291，1986)，HIV-1 pol基因克隆，即E.coli菌株UT481/pNLH402(存放在日本發(fā)酵研究所(Fermentation Research Institute)，入藏號FERM BP-2417)的質(zhì)粒pNLH402，E.coliJM109/pCV91(存放在在日本發(fā)酵研究所，入藏號FERM BP-3195)和E.coli JM109/pNLH122(存放在日本發(fā)酵研究所，入藏號FERM BP-3196)。cDNA片段可以利用傳統(tǒng)方法由這些質(zhì)粒制備，例如借助于限制性內(nèi)切酶消化來自上述質(zhì)?？寺〉乃鑵^(qū)的DNA和通過苯酚提取、氯仿處理或乙醇沉淀提純所產(chǎn)生的產(chǎn)物來制備。可以參考基因組DNA克隆限制性內(nèi)切酶圖恰當?shù)剡x擇用于切斷DNA片段的限制性內(nèi)切酶。因此，例如為了切斷來自上述pNLH402的整個pol基因區(qū)的DNA片段，可以使用限制性內(nèi)切酶HindⅢ(Journal of Virology，Vol.59，pp.284-291，1986)。
(Ⅱ)逆病毒基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建和用移入這樣構(gòu)建的質(zhì)粒制備轉(zhuǎn)化體通過將按照上述所制備的逆病毒基因組cDNA片段插入到一個大量表達的基因或一個用傳統(tǒng)方法制備的基因直接表達載體中來構(gòu)建逆病毒基因表達質(zhì)粒。在這里所用的術(shù)語“質(zhì)?！?，對本發(fā)明來說，用一種簡便符號表達廣泛的詞義，意指一種表達逆病毒基因的復(fù)制子。因此，任何下述已知的或可購買的表達載體可用來構(gòu)建這樣的質(zhì)粒整個細菌科的pSN508系的質(zhì)粒載體(美國專利No.4703005)，質(zhì)粒載體pJM105(日本專利公開62-286930)和酵母的pBH103系載體(日本專利公開63-22098)，減毒的水痘病毒載體(日本專利公開53-41202)，減毒的Marek′s病病毒載體(歐洲專利公開No.334530)，Eschrichia coli質(zhì)粒載體pUR290系(EMBO Journal，Vol.2，PP.1791-1794，1983)，pSN5182(Journal of Bacteriology，Vol.157，PP.909-917，1984)和pT7-7(Proceedings of the National Academy of Sciences〔USA〕，Vol.82，PP.1074-1078，1985)。重要的是，在構(gòu)建表達載體時將上述基因與一種能被高度表達的基因連接。因此，例如當使用上面提到的質(zhì)粒pUR290系時，上述基因最好應(yīng)在質(zhì)粒的lacz基因下方插入，或者在質(zhì)粒pSN5182的情況下，上述基因最好應(yīng)在質(zhì)粒psts基因下方插入，或者在pT7-7情況下，上述基因最好應(yīng)在寡肽基因下方插入，該寡肽基因是在T7啟動子控制下由pT7-7產(chǎn)生的。需要的是，蛋白酶應(yīng)當用靶子產(chǎn)物通過或不通過移碼來共同表達。例如，在HIV-1和HIV-2情況下，當cDNA與pol基因相適應(yīng)時，其中蛋白酶在pol基因區(qū)被編碼的猿免疫缺乏疾病或莫洛尼氏鼠類白血病毒應(yīng)當被連接，以便與包含在有高度表達能力的質(zhì)粒內(nèi)的基因匹配。從另一方面來說，鳥類肉瘤病毒蛋白酶在gag基因區(qū)編碼，該gag基因區(qū)具有來自pol基因的不同讀碼，而相類似人的T-細胞白血病病毒或牛白血病毒的蛋白酶基因還有不同于pol和gag兩種基因的其他讀碼。在這些情況下，需要小心，以保證逆病毒基因的有效表達。能夠通過引入這樣構(gòu)建的表達載體來制備轉(zhuǎn)化體的合適宿主細胞，包括任何能夠增殖和表達那種表達載體的細胞，而且同時，從這種宿主細胞中，能夠易于引入已構(gòu)建的表達載體并且為使用應(yīng)嚴格選擇其可靠的檢查。例如當使用上述pSN系質(zhì)粒作為表達載體時，希望用E.coli C75菌株(Microbiology Research Inst.Registation No.10191)作為宿主細胞，這就允許通過引入這種載體，利用抗藥性作為標志來選擇轉(zhuǎn)化體。當使用pUR290系或pT7-7時，需要使用E.coli UT481(Journal of Bacteriology，Vol.163，PP.376-384，1985)，或E.coli BL21(DE3)(Journal of Molecular Biology，Vol.189，No.1，PP.113-130，1986)，這就允許通過引入這些載體，利用抗氨芐青霉素作為標志選擇轉(zhuǎn)化體。可以用傳統(tǒng)方法，例如氯化鈣法(Journal of Molecular Biology，Vol.53，PP.154-162，1977)可以完成將表達載體引入這樣的宿主細胞。用引入上述gag或pol基因表達質(zhì)粒而獲得轉(zhuǎn)化體是通過利用標志選自陽性菌落。在轉(zhuǎn)化體菌落確定之后，提取表達載體DNA并用限制性內(nèi)切酶進行消化，將獲得的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳。然后可以測量插入DNA片段尺寸并確定與逆病毒基因相應(yīng)的DNA片段存在。例如，當包含來自質(zhì)粒pNLH402的整個pol基因區(qū)的DNA片段插入表達載體pUR290時，有約4kb DNA的EcoRⅠ片段在DNA的限制性消化中可以被發(fā)現(xiàn)，該DNA由上述載體轉(zhuǎn)化的細胞獲得。
(Ⅲ)確定由轉(zhuǎn)化細胞克隆的逆病毒基因表達和通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體大量產(chǎn)生逆病毒蛋白質(zhì)例如，可以通過利用Western印跡技術(shù)分析細胞原提取物來完成確定由轉(zhuǎn)化細胞克隆的逆病毒基因表達。例如原提取物可通過在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)和誘發(fā)轉(zhuǎn)化體，用低速離心分離收集細胞，用十二烷硫酸鈉和2-巰基乙醇處理收集的細胞，對它進行高速離心分離并收集上清液來制備。Western印跡技術(shù)可以按照常規(guī)方法使用各種購買的材料以下述步驟進行將上述原提取物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳;通過使用轉(zhuǎn)印跡裝置將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素薄膜上;為阻斷將該薄膜浸入明膠液中，例如借助于其免疫反應(yīng)檢測表達的蛋白質(zhì)。因此，例如當薄膜上的樣品是一種HIV pol基因產(chǎn)物時，可以通過用從人HIV載體獲得的初級血清培育該薄膜來檢測，接著洗滌并用含過氧化物酶共軛標記的抗人IgG抗體的次級抗體培育;通過在添加過氧化氫溶液和顯色劑時形成一種著色帶檢測pol基因產(chǎn)物的存在。在被表達的基因源于除HIV之外的逆病毒場合，一種合適的逆病毒抗血清用于代替人HIV載體血清作為初級血清，用抗人或動物IgG抗體作為次級抗體。
在已確定gag或pol基因的表達后，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體如下所述實現(xiàn)大量產(chǎn)生各種核心蛋白質(zhì)和象蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及整合酶的這樣的酶為了制備大規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的菌種，例如，當轉(zhuǎn)化體是E.coli時，該轉(zhuǎn)化體在LB培養(yǎng)基中在30-40℃溫度下培養(yǎng)12-35小時，直至細菌濃度達到2×109-8×109細胞/ml，然后，這種菌種接種到所制備的新鮮培養(yǎng)基中，并進行以兩個步驟進行的主培養(yǎng)步驟，一個預(yù)培養(yǎng)和一個后培養(yǎng)，為了增殖細胞和加大表達載體進行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)適合在10-40℃溫度下進行1-24小時，或者最好在15-37℃下進行2-12小時。當達到特定的細胞濃度時，停止預(yù)培養(yǎng)，例如在E.coli情況下，當培養(yǎng)液達到OD600nm為0.1-2.0時。接著，剛一結(jié)束這種預(yù)培養(yǎng)步驟，該培養(yǎng)系統(tǒng)就轉(zhuǎn)向第二個或后培養(yǎng)步驟。后培養(yǎng)步驟的條件必須精心選擇，以保證正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯基因及正確的翻譯后修飾，并可以進行基因加工，以產(chǎn)生獨立的和單個的成熟活性蛋白質(zhì)，并且也為了避免由于宿主蛋白水解酶的作用產(chǎn)生所需要的基因產(chǎn)物的降解和失活。后培養(yǎng)步驟最好應(yīng)在低于預(yù)培養(yǎng)步驟的溫度下進行，即在10-40℃溫度下培養(yǎng)1-40小時，更好在15-37℃溫度下培養(yǎng)3-35小時。根據(jù)所用顆粒狀表達載體，例如可通過在后培養(yǎng)步驟開始時導(dǎo)致培養(yǎng)基中磷酸鹽離子減少或通過向培養(yǎng)基中添加一種誘發(fā)物來加速或誘發(fā)表達。使用上述兩步驟培養(yǎng)能夠產(chǎn)生逆病毒核心蛋白質(zhì)和象蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的這樣的酶，不是以融合蛋白質(zhì)形式，而是作為獨立的活性蛋白質(zhì)，即作為獨立的和單個的成熟蛋白質(zhì)，通常產(chǎn)率高達1-30mg/升培養(yǎng)基。
(Ⅳ)核心蛋白質(zhì)和如蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及整合酶這樣的酶的提純通過傳統(tǒng)方法的任何組合可以完成這種過程。合適的工藝方法包括例如通過使用沉淀和離心過濾提取已合成的蛋白質(zhì);利用超聲波處理制備粗提取物，高壓處理或均化器處理，以分裂細胞;利用在二氧化硅或活性炭上吸附洗脫，鹽析或有機溶劑沉淀;及利用超離心法、柱色譜法或電泳進行高級提純。例如，可借助于密度梯度離心分離法，接著用二氧化硅和活性炭吸附洗脫分餾來提純合成的蛋白質(zhì)(日本專利公開63-297)。
由本發(fā)明方法獲得的表達載體可以封裝在安瓶、小瓶或其他小容器中或引入宿主中的形式提供。由本發(fā)明的表達載體大量產(chǎn)生的核心蛋白質(zhì)和如蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及整合酶這樣的酶可以液體、干粉末或吸附在濾紙或薄膜上，和封裝在膠囊、小瓶或其他小容器中的形式提供。當以粉末形式提供時，該蛋白質(zhì)在使用前通過適當?shù)厝芙庠谡麴s水中可以所需的量重組。當以吸附在濾紙或薄膜上提供時，應(yīng)當用按說明規(guī)定的溶劑弄濕后使用。
(Ⅴ)nef基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建、大量產(chǎn)生、確定、提純及Nef蛋白質(zhì)的使用這些可以由類似上述(Ⅰ)至(Ⅳ)中列舉的那些過程來實現(xiàn)。但是，因為除gag和pol之外，nef基因被固定在HIV基因組中和翻譯后產(chǎn)生的Nef蛋白質(zhì)不需要加工，因此，對于產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)，如一種簡單類型的蛋白質(zhì)，它是更合理的，并有省力的效果。因此，在不考慮大量產(chǎn)生Nef蛋白質(zhì)中的加工時，它能夠?qū)е乱砸环N簡單蛋白質(zhì)的nef基因的大量表達。更準確地說，通過nef基因cDNA片段與一種大量表達基因或一種基因直接表達載體插入連接來制備nef基因表達質(zhì)粒。nef基因cDNA片段可以由在HIV基因組或nef基因cDNA中具有nef基因區(qū)的質(zhì)粒pNL4-3(Journal of Virology，Vol.59，PP.284-291，1986)或質(zhì)粒pNLH152(存放在日本發(fā)酵研究所，入藏號為FERM BP-3179)制備。
使用本發(fā)明的方法可達到如下益處(1)按照本發(fā)明，可同時進行逆病毒基因的大量表達和加工，以及在大量產(chǎn)生逆病毒抗原或使用表達載體的酶，在本方法中避免使用很危險的逆病毒本身，從生物危害的觀點來看，生產(chǎn)是安全的，并且容易操作。
(2)可達到HIV蛋白質(zhì)的極高產(chǎn)率，例如1-3mg蛋白質(zhì)/升細菌培養(yǎng)，包括各種核心蛋白質(zhì)、酶和Nef蛋白質(zhì)。
(3)雖然借助本發(fā)明的方法逆病毒的各種核心蛋白質(zhì)、蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶以帶有大量基因表達產(chǎn)物的融合蛋白質(zhì)被表達，它們可不以融合蛋白質(zhì)狀態(tài)，而作為已加工的單個的成熟蛋白質(zhì)產(chǎn)生，但本發(fā)明方法比上述基因的簡單表達更有效和更實用。此外，考慮到上面(1)和(2)中提到的效果，這樣的一種方法也是更經(jīng)濟的，所需要的低成本生產(chǎn)。
(4)由于本發(fā)明方法方便地以低成本和大量地產(chǎn)生具有對逆病毒基質(zhì)的極高特殊性的酶和高純度逆病毒抗原，因此，能預(yù)料到本發(fā)明方法不僅會有助于遺傳工程的大進展，而且也會有助于對逆病毒感染疾病的基礎(chǔ)研究的大進展，這些逆病毒感染疾病，例如AIDS、成人T細胞白血病、鳥類肉瘤或白血病和貓白血病，也會有助于特殊和選擇性治療及預(yù)防藥物，以及鑒別這些藥物的發(fā)展，并且也會有助于增進人體保健和保健學(xué)及生活原料工業(yè)的發(fā)展。
(5)本發(fā)明制備質(zhì)粒的方法能夠用于發(fā)展更有效和更合理的大量產(chǎn)生這些基因產(chǎn)物的技術(shù)，所述質(zhì)粒允許各種逆病毒基因和各種反轉(zhuǎn)座子基因大量表達及翻譯后加工。
現(xiàn)在參照下列非限制性實施例更詳細地描述本發(fā)明的方法。
在下述實施例中以如下方法測定逆轉(zhuǎn)錄酶活性將反應(yīng)混合物配制成含50mmol tris-Hcl(pH8.3)、50mmol氯化鉀、10mmol氯化鎂、3mmol二硫蘇糖醇、0.1W/V%NONIDET p-40(由美國Shell Oil制造)、20μg/ml(rA)n(dT)12-18(Pharmacia〔瑞典〕)、0.5mmol dTTP(脫氧胸苷三磷酸)和1Ci〔3H〕dTTP(脫氧胸苷三磷酸)。將5μl樣品加入總體積為50μl的反應(yīng)混合物中，并在37℃培育10分鐘。然后該混合物立即在冰上冷卻，并經(jīng)過濾紙DE81(由英國Wattman制造)過濾。用5%磷酸鈉溶液充分洗滌過濾物，用水漂洗，然后用乙醇漂洗并干燥。
借助于液態(tài)閃爍計數(shù)器測定放射性。
實施例1攜帶慢病毒pol基因的表達載體的構(gòu)建將5μg攜帶HIV原病毒基因組DNA的質(zhì)粒pNL4-3DNA(Journal of Virology，59(2)284-291，1986)加到5μl HindⅢ和20μl5×RM(50mmol tris-HCl〔pH7.5〕、35mmol MgCl2、300mmol NaCl)中，用蒸餾水稀釋至總體積為100μl并在37℃培育1小時。然后用TE(10mmol tris-HCl〔pH7.5〕、1mmol EDTA)飽和的苯酚提取溶液。在乙醇沉淀之前，用氯仿處理水層。將沉淀物溶解在10μl TE中，并將1μl這種溶液加到0.1μg(1μl)被HindⅢ劈開的質(zhì)粒pHSG398DNA中，并用堿性磷酸酶處理。再添加2μl的10×絡(luò)合形成的緩沖劑(660mmol tris-HCl〔pH7.6〕、66mmol MgCl2、100mmol DTT和1mmol ATP)和1μl T4DNA連接酶，并用蒸餾水將總體積增加到20μl。將混合物在15℃培育12小時。用這種反應(yīng)液按照氯化鈣法轉(zhuǎn)化E.coli菌株JM103(Journal of Molecular Biology，53154，1970)，并在含20μg氯霉素/ml LB培養(yǎng)基平皿(1W/V%Bacto-胰胨、0.5W/V%Bacto-酵母提取物、1W/V%NaCl和1.5W/V%瓊脂)上選擇抗氯霉素菌落。通過傳統(tǒng)方法從抗氯霉素克隆提取質(zhì)粒DNA，而通過選擇含約4.0kb片段的克隆得到克隆pNLH 402，該片段源于通Hind Ⅲ切斷的質(zhì)粒pNL4-3 DNA。
將5μl量的Hind Ⅲ和10μl量的5×RM加到5μl(5μg)質(zhì)粒pNLH402 DNA中，該混合物用蒸餾水稀釋至總體積為50μl?；旌衔镌?7℃培育1小時，并在苯酚提取和氯仿處理之后，混合物進行乙醇沉淀。將產(chǎn)生的沉淀物加到10μl 5XRM和5μl Bgl Ⅱ中，并用蒸餾水稀釋至總體積50μl，借此沉淀物完全溶解?；旌衔镌僭?7℃培育1小時，在苯酚提取和氯仿處理之后，將產(chǎn)生的產(chǎn)物進行乙醇沉淀。將這樣獲得的DNA溶解在10μl TE中。
同時，將5μl Hind Ⅲ和10μl5×RM加到5μg表達載體pUR290DNA(The EMBO Journal，2(2)1791-1794，1983)中?；旌衔镉谜麴s水稀釋至50μl，在37℃培育1小時，在苯酚提取、氯仿處理和乙醇沉淀之后，加入10μl5×RM(Nacl濃度500mmol)和5μl BamHⅠ。再加入35μl蒸餾水，以使沉淀物完全溶解，然后溶液在37℃培育1小時。在苯酚提取和氯仿處理之后，將用乙醇沉淀出的DNA溶入10μl TE中。
用Hind Ⅲ和BamHⅠ消化的pUR 290 DNA(1μl)與用Hind Ⅲ Ⅰ和Bgl Ⅱ消化的pNLH 402 DNA(1μl)混合，添加2μl 10x絡(luò)合形成的緩沖劑和1μl T4DNA連接酶。用蒸餾水將總體積增加至20μl，并在15℃反應(yīng)12小時。按照上述氯化鈣法，用該反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli菌株UT481(Journal of Bacteriology，163376-387，1985)。在含20μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基平皿上選擇抗氨芐青霉素菌落，通過測量由EcoRⅠ卵裂的插入片段尺寸選擇含源于pNL4-3的約3.8kb的片段的克隆。這樣獲得克隆UT481/pPG280。更詳細地說，在這種克隆中，約3.8kbHIV pol基因區(qū)被認為是綁在質(zhì)粒pUR290的lacZ基因的3′端上，而lacZ和pol基因產(chǎn)物的融合蛋白質(zhì)(約230kd)起始表達，加工后產(chǎn)生各種分離酶。
實施例2通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生慢病毒蛋白酶，逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶轉(zhuǎn)化體克隆UT481/pPG280于37℃在含20μg氨芐青霉素/ml(1W/V%Bacto-胰胨、0.5W/V%Bacto-酵母提取物和1W/V% NaCl)的LB培養(yǎng)基中培育18小時，將所產(chǎn)的細胞加入含20μg氨芐青霉素/ml以1∶100稀釋的新鮮LB培養(yǎng)基中并進行預(yù)培養(yǎng)。當培養(yǎng)基的OD 600nm達到0.5時，添加1mmol IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，出自Sigma〔U.S.A〕)，并在25℃培養(yǎng)18小時。用離心分離(5000rpm，5分鐘)收集細菌并懸浮在1/25體積的40mmol tris-HCl(pH8.0)(0.1mmol EDTA，5mmol mgCl2，0.1W/V% Triton X-100和10mmol 2-巰基乙醇)中。在超生波處理(5個30秒脈沖;19.5KHZ，300W)之后，通過離心分離(19000rpm，60分鐘)分離上清液。為了確定在這種粗提取液中HIV pol基因產(chǎn)物的存在，測量該原提取液中逆轉(zhuǎn)錄酶活性。結(jié)果示于圖1。如預(yù)料，觀察到有特殊意義的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。也進行了Western印跡技術(shù)分析將4W/V%十二烷基硫酸鈉(SDS)和1W/V% 2-巰基乙醇加到收集的細菌細胞，在煮沸5分鐘并離心分離(10000rpm，5分鐘)后，將上清液在0.1W/V% SDS-10W/V%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。在借助于轉(zhuǎn)印跡裝置(由美國BioRad制造)將印跡弄到硝化纖維素薄膜上之后，按照傳統(tǒng)阻斷方法將薄膜浸入了W/V%明膠液中。然后，作為初級反應(yīng)用由HIV載體獲得的人血清培育薄膜，在洗滌之后，作為次級反應(yīng)用過氧化物酶標記結(jié)合的抗人IgG血清(由BioRad制造)培育薄膜。最后，在洗滌后將薄膜浸入顯色液中，以引起顏色形成。在室溫保持15分鐘，然后用蒸餾水洗滌，所述顯色液是通過將0.41ml DAB(3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物)和5μl的30W/V%過氧化氫溶液加到50ml TBS(20mmol tris-HCl〔pH7.4〕500mmol NaCl)中制備。結(jié)果示于圖2。雖然在用不攜帶HIV pol基因(E.coli菌株UT481/pUR290，以載體pUR290為基)的載體轉(zhuǎn)化的細胞的原提取液中未觀察到與人HIV載體血清反應(yīng)的特殊帶，但在菌株UT481/pPG280的轉(zhuǎn)化細胞的提取液中卻觀察到分子量為66kd和51kd的逆轉(zhuǎn)錄酶，32kd的整合酶和12kd的蛋白酶的帶，即HIV pol基因產(chǎn)物。用離子交換MonoQ(由瑞典Pharmacia制造)的柱色譜表明，逆轉(zhuǎn)錄酶已分離，即如圖3所示示，逆轉(zhuǎn)錄酶從β-半乳糖苷酶斷開，因為在由β-半乳糖苷酶活性完全分離部分中能發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶活性。這就表示盡盡管HIV pol基因產(chǎn)物以帶有β-半乳糖苷酶、蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶區(qū)的融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生，但這種融合蛋白質(zhì)特別通過蛋白酶的作用被分離，該蛋白酶本身是pol基因產(chǎn)物并積累在細胞中。
實施例3一種能產(chǎn)生大量慢病毒蛋白酶的載體的構(gòu)建將1μl Hind Ⅲ和10μl5×RM加到5μg實施例1中制備的pol基因表達質(zhì)粒pPG280的DNA中，并用蒸餾水將混合物稀釋到總體積為100μl?；旌衔镌?7℃培育1小時，在苯酚提取和氯仿處理后，混合物進行乙醇沉淀。將所得到的沉淀物加到5μl5×RM(-NaCl)和5μl BalⅠ中，并用蒸餾水稀釋到總體積為50μl，借此使沉淀物溶解?；旌衔镌?7℃再培育1小時，在苯酚提取和氯仿處理后，所得到的產(chǎn)物進行乙醇沉淀。將所得到的沉淀物加到5μl10×聚合酶緩沖劑(670mmol Tris HCl〔pH8.8〕、67mmol MgCl2、166mmol(NH4)2SO4、100mmol2-巰基乙醇和67mmol EDTA)、5μl10×dNTP溶液(dATP、dGTP、dTTP和dCTP各為3.3mmol)和1μl T4DNA聚合酶中，并用蒸餾水稀釋到總體積為50μl，借此使沉淀物溶解?；旌衔镌?7℃培育15分鐘，在苯酚提取和氯仿處理后，所得到的產(chǎn)物進行乙醇沉淀。向通過將所得到的沉淀物溶入10μl TE和2μl10×絡(luò)合形成的緩沖劑中所制備的溶液的混合物再加入1μl T4DNA連接酶，并用蒸餾水使總體積達到20μl。混合物在37℃進一步培育12小時。按照上述氯化鈣方法用該反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli菌株UT481。在含20μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基平皿上選擇抗近芐青霉素菌落，通過利用EcoRⅠ消化作用測量插入的片段尺寸來選擇含由pNL4-3產(chǎn)生的0.55kb片段的克隆。這樣就獲得克隆UT481/pLB550-3。
用BglⅡ和KpnⅠ切斷大量產(chǎn)生HIV-1(慢病毒)pNLH402(實施例1)的蛋白酶的載體的結(jié)構(gòu)，將所得到的約1.7kb DNA片段用NlaⅣ進一步切斷。將這樣制備的約1.2kb DNA片段插入克隆載體pCU19的HinCⅡ部分，以獲得pUN40。將這樣獲得的pUN40用BamHⅠ和PstⅠ切斷，將所得到的1.2kb DNA片段插入用BamHⅠ和PstⅠ切開的表達載體pUR291(The EMBO Journal，2(2)1791-1794，1983)和pT7-7(Proc.Natl.Acid.Sci.，USA，821074-1078，1985)中，以分別構(gòu)成pPG401和pTP440。然后用BalⅠ和PstⅠ切斷pPG401，在T4DNA聚合酶處理后，引起自鏈合而獲得pPG421。另一方面，用BalⅠ和PstⅠ切斷pTG440，在T4DNA聚合酶處理后，引起自鏈合而獲得pTP442。這些pPG401、pPG421、pTP440和pTP442表達蛋白酶HIV-1。對于pPG401和pPG421，菌株UT481和JM103用作表達宿主。對于pTP440和pTP442，用菌株BL21(DE3)作為表達宿主。
實施例4由轉(zhuǎn)化細胞大量產(chǎn)生慢病毒蛋白酶在LB培養(yǎng)基(含20μg氨芐青霉素/ml)中，于37℃將轉(zhuǎn)化體克隆UT481/pLB550-3培養(yǎng)18小時，將所得到的細胞加到以1∶100稀釋的新鮮LB培養(yǎng)基(含20μg氨芐青霉素/ml)中，并在37℃進行預(yù)培養(yǎng)。當培養(yǎng)基的OD600nm達到0.5時，添加1mmol IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，Sigma〔U.S.A〕)，并在37℃繼續(xù)培養(yǎng)6小時。用離心分離(5000rpm，5分鐘)收集細菌，并添加4W/V%十二烷基硫酸鈉(SDS)和1W/V%2-巰基乙醇。在煮沸5分鐘并離心分離(10000rpm，5分鐘)后，將上清液在0.1W/V%SDS-15W/V%聚丙烯酰胺凝膠上電泳。隨后，借助于實施例2中所述的Westrn印跡技術(shù)分析收集的細菌。雖然在UT481/pUR290的原提取物中沒有觀察到與人HIV載體血清反應(yīng)的特殊帶，但在UT481/pLB550-3的提取液中觀察到12kb蛋白酶的帶。特別是以適量蛋白酶產(chǎn)生的pLB550-3是pPG280的數(shù)倍。在這個克隆中，0.55kb HIV pol基因被認為是綁扎在質(zhì)粒pUR290的lacZ基因的3′端上，而lacZ-pol基因產(chǎn)物被認為以分子量約140kb的融合蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生，加工后產(chǎn)生約12kb的蛋白酶。
實施例5一種攜帶致癌病毒蛋白酶和pol基因的表達載體的構(gòu)建將5μg攜帶勞氏肉瘤病毒cDNA的質(zhì)粒pSRA2DNA(Journal of Virology，36，PP.50-61，1980)加到5μl BamHI和20μl5×RM中，并用蒸餾水稀釋到總體積為100μl，然后將其在37℃培育1小時。在這個反應(yīng)后，混合物在1W/V%低熔點瓊脂糖凝膠上進行電泳，并消化含1.8kb DNA片段的凝膠部分。然后，在苯酚提取和氯仿處理后，將所得到的產(chǎn)物進行乙醇沉淀。將沉淀物溶入10μl TE中，并將1μl這種溶液加到0.1μg(1μl)用BamHⅠ切開并用堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒pUR291DNA中。進一步添加2μl10×絡(luò)合形成的緩沖劑和1μl T4DNA連接酶，并用蒸餾水使總體積增加到20μl。然后反應(yīng)混合物在15℃培育12小時。接著，按照氯化鈣方法用該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化Escherichia coli UT481菌株，并在含20μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基平皿上選擇抗氨芐青霉素菌落。使用普通方法從抗氨芐青霉素克隆中提取質(zhì)粒DNA，并且通過選擇含由質(zhì)粒pSRA2產(chǎn)生的1.8kb片段并產(chǎn)生lacZ-gag融合蛋白質(zhì)的克隆獲得克隆pSR281。
將5μg質(zhì)粒pSRA2 DNA加到5μl pstⅠ和20μl 5×RM(750mmol NaCl)中，并用蒸餾水稀釋到總體積為100μl，然后將其在37℃培育1小時。在反應(yīng)后，該混合物在1W/V%低熔點瓊脂糖凝膠上進行電泳，消化1.8kb DNA片段。然后，在苯酚提取和氯仿處理后，將所得到的產(chǎn)物進行乙醇沉淀并溶解到10μl TE中。類似地，用PstⅠ切開M13mP18的雙鏈噬菌體DNA并用堿性磷酸酶處理。將1μl(0.1μg)這種DNA加到1μl上述3.1kb DNA片段、2μl 10×絡(luò)合形成的緩沖劑和1μl T4DNA連接酶中，并用蒸餾水稀釋到總體積為100μl，然后將其在15℃培育12小時。接著，按照氯化鈣方法使用重組子噬菌體DNA轉(zhuǎn)染E.coli菌株TG1，在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷，Sigma〔U.S.A〕)的2YT培養(yǎng)基平皿(1.6W/V%Bacto-胰胨、1W/V%Bacto-酵母提取物、0.5W/V%NaCl和1.5W/V%Bacto-瓊脂)上形成噬菌斑。
轉(zhuǎn)染TG1菌株在2YT培養(yǎng)基(1.6W/V%Bacto-胰胨、1W/V%Bacto-酵母提取物和0.5W/V%NaCl)中繁殖，直到培養(yǎng)基的OD600nm達到0.3，將一些所得的噬菌斑的非染色質(zhì)克隆接種。繼續(xù)培育幾小時，然后按照普通方法制備單鏈和雙鏈DNA。通過用PstⅠ和BamHⅠ消化所獲得的雙鏈DNA選擇含由pSRA2產(chǎn)生的3.1kb片段的克隆M13sr31。由pSRA2產(chǎn)生的3.1kb片段編碼gag基因3′端、終止密碼子TAG和pol基因。在終止密碼子前插入一個堿基形成具有匹配翻譯碼組的gag-pol融合基因的表達。這樣，通過使用一個體外誘變用具(Amersham〔英國〕制造)獲得克隆M13sr32，在M13sr31上的終止密碼子TAG前通過插入一個堿基獲得含有順序ATAG。
將5μg M13sr32的雙鏈DNA加到5μl pstⅠ和20μl 5×RM中，并用蒸餾水稀釋到總體積為100μl，然后將其在37℃培育1小時。在反應(yīng)后，混合物在1W/V%低熔點瓊脂糖凝膠上進行電泳，消化含3.1kb DNA片段的凝膠。在苯酚提取和氯仿處理后，所得到的產(chǎn)物進行乙醇沉淀。將沉淀物溶入10μl TE中，并將1μl這種溶液加到1μl(0.1μg)通過pstⅠ消化并用堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒pSR281DNA(見前文)中。再添加2μl 10×絡(luò)合形成的緩沖劑和1μl T4DNA連接酶，并用蒸餾水使總體積增加到20μl。然后混合物在15℃培育12小時。接著，按照氯化鈣方法用這種反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化E.coli UT481菌株，并在含20μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基平皿上選擇抗氨芐青霉素菌落。用普通方法從抗氨芐青霉素菌落中提取質(zhì)粒DNA，通過使用pstⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒確定由M13sr32產(chǎn)生的3.1kb片段的存在和方位，然后獲得被認為是表達蛋白酶和pol基因產(chǎn)物的克隆UT 481/pSR271。
當用pstⅠ切開pSR281時，在由pSRA2產(chǎn)生的并包含在質(zhì)粒pSR281內(nèi)的1.8kb區(qū)中除去與由M13sr32產(chǎn)生的3.1kb片段重疊的1.3kb區(qū)。
實施例6致癌病毒蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體克隆UT481/pSR271在LB培養(yǎng)基(含20μg氨芐青霉素/ml)中、在37℃培育18小時，將所得到的細胞加到以1∶100稀釋的新鮮LB培養(yǎng)基(含20μg氨芐青霉素/ml)中，并進行預(yù)培養(yǎng)。當培養(yǎng)基的OD600nm達到0.5時，添加1mmol IPTG，并在25℃繼續(xù)培養(yǎng)18小時。用離心分離(5000rpm，5分鐘)收集細菌，并懸浮在1/25體積的40mmol tris-HCl(pH8.0)(0.1mmol EDTA、5mmol MgCl2、0.1W/V%Triton X-100和10mmol 2-巰基乙醇)中。在超聲波處理(5個30秒脈沖，19.5kHz、300W)后，用離心分離(19000rpm，60分鐘)分離上清液。為了確定RSV基因產(chǎn)物在這種原提取液中的存在，測量原提取液中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。如所預(yù)料，觀察到顯著的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。也進行Western印跡技術(shù)分析將4W/V%十二烷基硫酸鈉(SDS)和1W/V%2-巰基乙醇加到收集的細菌中。在煮沸5分鐘并離心分離(10000rpm，5分鐘)后，上清液在0.1W/V%SDS-15W/V%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。在使用轉(zhuǎn)移印跡裝置(BioRad〔U.S.A〕制造)將印跡弄到硝化纖維素膜(S&S〔西德〕制造)上后，按照普通印跡方法將該膜浸入3W/V%明膠溶液中。然后，作為初級反應(yīng)，用抗RSV兔血清培育該膜，洗滌后作為次級反應(yīng)，用結(jié)合抗兔IgG血清的過氧化物酶標志(BioRad制造)培育。最后，在洗滌后將膜浸入通過將0.4ml DAB(3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物)和15μl 30W/V%過氧化氫溶液加到50ml TBS(20mmol tris-HCl〔pH7.4〕、500mmol NaCl)中制備的產(chǎn)色液中，以引起顏色形成，在室溫保持15分鐘，然后用蒸餾水洗滌。雖然在轉(zhuǎn)化細胞UT481/pUR290(以不具有RSV基因的載體pUR290為基)的原提取液中沒有觀察到與抗RSV兔血清反應(yīng)的特殊帶，但在UT481/pSR271提取液中觀察到RSV逆轉(zhuǎn)錄酶帶。盡管RSV蛋白酶和pol基因產(chǎn)物以帶半乳糖苷酶、蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的融合蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生，但這種融合蛋白酶特別通過蛋白酶的作用被切開，蛋白酶自身是gag基因產(chǎn)物，并認為積累在細胞中。在克隆UT481/pSR271中，3.6kb勞氏肉瘤病毒gag和pol基因區(qū)被認為是綁扎到質(zhì)粒pUR291的lacZ基因的3′端，建議將lacZ、gag和pol基因產(chǎn)物以融合蛋白質(zhì)(約230kb)形式表達，然后將其加工，以釋放出酶，例如蛋白酶(P15)、逆轉(zhuǎn)錄酶(P92、P65)和整合酶(P32)。
實施例7逆轉(zhuǎn)錄酶的提取如在實施例2中所述，于25℃在91LB培養(yǎng)基(含20μg氨芐青霉素/ml)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的E.coli克隆UT481/pPG280，當培養(yǎng)基的OD600nm達到0.5時，添加1mmol IPTG。繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集后將細胞懸浮于120ml的40mmol tris-HCl(pH8.0)(含0.1mmol EDTA、5mmol MgCl2、0.1W/V% Triton X-100和10mmol 2-巰基乙醇)緩沖劑中。用超聲波處理分裂細菌細胞并進行離心分離(19000rpm，60分鐘)，分離出上清液作為原提取液。
實施例8逆轉(zhuǎn)錄酶的提純將Polymine P(BRL〔U.S.A〕制造)以0.1W/V%的合適量加到原提取液中，然后在4℃攪拌30分鐘并離心分離(16000rpm，20分鐘)。
將硫酸銨加到上清液中。用離心分離(16000rpm，20分鐘)除去由這種40%飽和溶液中產(chǎn)生的沉淀物，獲得137ml上清液。再將硫酸銨加到80%飽和溶液中，將這樣產(chǎn)生的沉淀物溶于50ml上述的40mmol tris-HCl緩沖劑中，然后逆著含50mmol NaCl的相同緩沖劑進行滲析。
實施例9逆轉(zhuǎn)錄酶的高級提純使用DEAE Bio-Gel A(BioRad〔U.S.A〕)和Affi-Gel Heparin柱色譜(BioRad)進行高級提純。將實施例8的滲析樣品施加到用40mmol tris-HCl(pH8.0)(含0.1mmol EDTA、5mmol MgCl2、0.1W/V%Triton X-100、10mmol 2-巰基乙醇和50mmol NaCl)平衡的30ml DEAE Bio-Gel A柱上。然后將洗脫的樣品施加到用上述緩沖劑平衡的30ml Affi-Gel Heparin柱上，并用150ml含梯度為50mmol-400mmol的氯化鈉的緩沖劑洗脫。結(jié)果示于圖4。將含逆轉(zhuǎn)錄酶活性的餾分29至38匯集。將匯集的餾分逆著20mmol磷酸鈉緩沖劑(pH6.8)(含0.1mmol EDTA、5mmol MgCl2、0.1W/V% Triton X-100和10mmol 2-巰基乙醇)滲析，并進一步用HPLC在羥磷灰石柱(KB柱，Koken〔日本〕)上提純。特別是在樣品吸附在柱上后，用線梯度20-400mmol的磷酸鈉進行洗脫，匯集含逆轉(zhuǎn)錄酶活性的餾分。于是獲得提純的逆轉(zhuǎn)錄酶。通過使用SDS-PAGE確定這樣獲得的逆轉(zhuǎn)錄酶純度超過95%。相對于原提取液產(chǎn)率為31%。提純的逆轉(zhuǎn)錄酶由具有基本相同摩爾比的P64和P51組成，確定兩個亞單位N末端氨基酸順序為Pro-Ile-Ser-Pro-Ile-Glu-Thr-Val-Pro-Val-Lys-Leu-Lys-Pro-Gly……，因此，與由核苷酸順序預(yù)測的氨基酸順序一致。
實施例10高度表達AIDS病毒核心蛋白質(zhì)的載體的構(gòu)建用PvuⅡ切斷攜帶HIV-1原病毒基因組DNA的質(zhì)粒pNL4-3(Journal of Virology，59(2)284-291，1986)的DNA，收集所產(chǎn)生的約2.1kb DNA片段。將該片段插入質(zhì)粒pUC9的HinCⅡ部分。這樣引入的其5′端與BamHⅠ部分側(cè)面連接的片段稱為pCV91。
在用BamHⅠ和BalⅠ切斷pCV91后，收集所產(chǎn)生的約1.5kb DNA片段，并插入用SalⅠ、T4DNA聚合酶和BamHⅠ順序處理的表達載體pUR292(The EMBO Journal，2(2)1791-1794，1983)中，以制備pPG912。此外，用BglⅡ切斷pPG912，并在T4DNA聚合酶處理后，引起自鏈合，使pPG912轉(zhuǎn)化成pPG922，其中四個堿基引到BglⅡ部分上。
在pPG912和pPG922中，完全含從HIV-1gag基因區(qū)的P24區(qū)到pol基因的蛋白酶區(qū)整個范圍的DNA片段在碼組中連接到lacZ基因的3′端。HIV-1的基因產(chǎn)物以帶半乳糖苷酶的融合蛋白質(zhì)形式表達，而然后，進行一種基于所表達的蛋白酶的加工，對于pPG912借助于從gag到pol的移碼，或?qū)τ趐PG922不移位，產(chǎn)生核心蛋白質(zhì)P24。在pPG912中也產(chǎn)生P15。
在用BamHⅠ和ClaⅠ切斷上述表達質(zhì)粒pPG912和pPG922后，收集所產(chǎn)生的約1.5kb DNA片段，并引入用BamHⅠ和ClaⅠ切開的表達載體pT7-7(Proc.Natl.Acid.Sci.，USA，821074-1078，1985)中，以制備pTG11和pTG12。然后，用BamHⅠ切開pTG11和pTG12，用T4DNA聚合酶處理，就引起自鏈合，以制備pTG110和pTG120。這表明HIV蛋白質(zhì)區(qū)與以帶有寡肽的融合蛋白質(zhì)形式的pPG912和pPG922源完全相同，這種寡肽是在T7啟動子控制下由pT7-7產(chǎn)生的。使用蛋白酶加工融合蛋白質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)生p24和p15。
使用E.coli菌株JM103(Nucleic Acid Research，9(2)309-321，1981)作為構(gòu)建質(zhì)粒的宿主;使用E.coli菌株UT481(Journal of Bacteriology，163376-384，1985)作為pPG912和pPG922蛋白質(zhì)表達的宿主;使用E.coli菌株BL21(DE3)(Journal of Molecular Biology，189(1)113-130，1986)作為pTG100和pTG120蛋白質(zhì)表達的宿主。每升E.coli培養(yǎng)液提純的P24和P15的各自產(chǎn)率示于表1。
實施例11AIDS病毒的高度表達核蛋白質(zhì)載體的構(gòu)建用HindⅢ切斷實施例10制備的表達質(zhì)粒pPG912的gag-pol基因，以再產(chǎn)生約0.9kb DNA片段。然后通過該片段以所希望的方位引入表達載體pUR290(The EMBO JOurnal，2(2)1791-1794，1983)的HindⅢ部分制備質(zhì)粒pPG930。在pPG930中，完全含從HIV-1gag區(qū)的P15區(qū)到pol基因的蛋白酶區(qū)的所有范圍的DNA片段在碼組中連接到pUR290上的IacZ基因的3′端。HIV基因產(chǎn)物以帶β-半乳糖苷酶的融合蛋白質(zhì)形式表達。這種融合蛋白質(zhì)借助于移碼進行一種基于蛋白酶的加工，導(dǎo)致產(chǎn)生P15核蛋白。
通過上述0.9kb HindⅢ片段以所希望的方位引入表達載體pT7-7的HindⅢ部分制備另外的質(zhì)粒pTG21。此外，用SalⅠ切斷pTG21，并在T4DNA聚合酶處理后，引起自鏈合而獲得pTG210，這表明，相同的HIV蛋白質(zhì)區(qū)象pPG930的HIV蛋白質(zhì)區(qū)一樣，是以帶有在T7啟動子控制下由pT7-7產(chǎn)生的寡肽的融合蛋白質(zhì)形式。這種融合蛋白質(zhì)通過移碼進行一種基于蛋白酶表達的加工，于是產(chǎn)生P15。
使用菌株JM103作為構(gòu)建質(zhì)粒的宿主;使用菌株UT481作為pPG930蛋白質(zhì)表達的宿主;使用菌株BL21(DE3)作為pTG210蛋白質(zhì)表達的宿主。每升E.coli培養(yǎng)液提純的P15的相應(yīng)產(chǎn)率示于表1。
表1每升培養(yǎng)液提純的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率表達質(zhì)粒 宿主 P24(mg) P15(mg)pPG912 UT481 5 0.7pPG922 UT481 5 -pPG930 UT481 - 1pTG110 BL21(DE3) 19 3pTG120 BL21(DE3) 10 -pTG210 BL21(DE3) - 5測定提純的P24和P15的N末端氨基酸順序為Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Leu-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His-Gln-Ala-Ile-……(對于P24)，Ile-Gln-Lys-Gly-Asn-Phe-Arg-Asn-Gln-Arg-Lys-Thr-Val……(對于P15)，因此，與由各自核苷酸順序預(yù)測的氨基酸順序一致。
實施例12通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體提取AIDS病毒核心蛋白質(zhì)P24轉(zhuǎn)化體克隆UT481/pPG922于37℃、在含20μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基(1W/V%Bacto胰胨、0.5W/V%Bacto酵母提取物和1W/V%NaCl)中培養(yǎng)18小時，然后將1/100體積加到新鮮LB培養(yǎng)基(含20μg氨芐青霉素/ml)中，并在37℃溫度下預(yù)培養(yǎng)。當培養(yǎng)基的OD600nm達到0.5時，添加1mmol IPTG(異丙基-硫代半乳糖苷Sigma〔美國〕制造)，并在37℃溫度下繼續(xù)培養(yǎng)8小時。通過離心分離(5000rpm，10分鐘)收集細菌細胞，并懸浮在50mmol磷酸鈉(pH7.0)中，在超聲波處理(5個3分鐘脈沖，19.5kHz，300W)后，用離心分離(19000rpm，60分鐘)分離上清液。
P24的粗提純將硫酸銨加到原提取液中，以便達到35%的飽和，然后在攪拌后，將通過離心分離(16000rpm，20分鐘)獲得的沉淀物溶入30ml20mmol丙二酸鈉(pH5.3)并在所形成的液體中滲析。
P24的提純使?jié)B析的樣品通過用20mmol丙二酸鈉(pH5.3)平衡的MonoS柱(Pharmacia〔瑞典〕制造)，并用梯度為0-1mol的氯化鈉洗脫。匯集含P24的餾分并逆著20mmol tris-HCl緩沖劑(pH8.4)滲析。在滲析后，將該液施加到用上述緩沖劑平衡的MonoQ柱(Pharmacia〔瑞典〕制造)上，并用梯度為0-1mol的氯化鈉洗脫，以獲得提純的P24。
實施例13提取P15轉(zhuǎn)化體克隆BL21(DE3)/pTG210于37℃、在含20μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時，然后將1/100體積加到新鮮LB培養(yǎng)基(含20μg氨芐青霉素/ml)中，并在37℃培養(yǎng)。當培養(yǎng)基的OD600nm達到0.5時，添加1mmol IPTG，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)5小時。收集細菌細胞并懸浮在1/50體積的20mmol磷酸鈉(pH7.0)中，并在超聲波處理(6個30秒脈沖，19.5kHz，300W)后，用離心分離(19000rpm，60分鐘)分離上清液，作為原提取液。
P15的粗提純將硫酸銨加到原提取液中，以便達到60%的飽和，在攪拌后，該混合物進行離心分離(16000rpm，20分鐘)。將所得到的沉淀物溶解到20mmol磷酸鈉緩沖劑(pH7.0)中，然后逆著相同的緩沖劑滲析。
P15的提純將滲析的樣品施加到用20mmol磷酸鈉(pH7.8)平衡的磷酸纖維素柱(Wattman〔英國〕制造)上，然后用梯度為0-1mol的氯化鈉洗脫。匯集含P15的餾分并逆著20mmol磷酸鈉緩沖劑(pH7.0)滲析。將滲析的樣品施加到羥磷灰石柱(KB柱，Koken，Ltd.制造)上，并用梯度為20-70mmol的磷酸鈉洗脫。將含P15的餾分匯集并逆著20mmol磷酸鈉緩沖劑(pH7.0)滲析。然后將這種樣品施加到MonoS柱上，用梯度為0-1mol的氯化鈉洗脫。匯集含P15的餾分，以獲得提純的P15。
實施例14攜帶AIDS病毒gag-pol基因的表達質(zhì)粒的構(gòu)建用HindⅢ切斷HIV-1原病毒DNA克隆pNL4-3，并將得到的約1.2kb DNA片段插入克隆載體pHSG398(Takara Shuzo〔日本〕制造)的HindⅢ部分，以制備pNLH122。用BglⅡ和HindⅢ切斷這個pNLH122，并將所得到的約1.03kb DNA片段插入用BamHⅠ和HindⅢ切開的M13mp19(Takara Shuzo制造)中，以制備Gag19·(Bg-H)。序順GAG在緊接Gag19·(Bg-H)上的gag基因的起動密碼子之前借助于寡核苷酸定向體外誘變系統(tǒng)Version 2(Amersham〔英國〕制造)轉(zhuǎn)變成CAT，并將制備的Gag19·(Nde)重新引入其NdeⅠ位置。用NdeⅠ和PstⅠ切斷Gag19·(Nde)，并將所得到的0.63kb DNA片段插入用NdeⅠ和PstⅠ切開的PT7-7中，以制備pTG541。此外，將實施例10中制備的pPG912和pPG922用PstⅠ切斷，將所得到的約1.2kb DNA片段分別插入pTG541的PstⅠ部分并以所希望的方位與PstⅠ連接，這樣構(gòu)建的質(zhì)粒分別稱為pTG591和pTG592。在pTG591和pTG592中，完全含從T7啟動子控制下的gag基因的起動密碼子到pol基因的蛋白酶區(qū)的整個范圍的DNA片段被連接。在pTG591中，所表達的HIV蛋白質(zhì)通過移碼進行一種基于共同表達的蛋白酶加工，于是產(chǎn)生大量的P17、P24和P15。在pTG592中，所表達的HIV蛋白質(zhì)不通過移碼進行一種基于共同表達的蛋白酶加工，產(chǎn)生大量P17和P24。
菌株JM103用作構(gòu)建質(zhì)粒的宿主，而菌株BL21(DE3)用作蛋白質(zhì)表達的宿主。
實施例15高度表達AIDS病毒的基質(zhì)蛋白質(zhì)的載體的構(gòu)建首先，將實施例14中制備的pTG591用NsiⅠ和ApaⅠ切斷，在用S1核酸酶處理后，引起自鏈合。當gag基因的Nsi部分的N-末端和Apa部分的C-末端在碼組中被融合時，表達缺少從P24中間部分到P15中間部分的Gag蛋白質(zhì)和Gag-pol蛋白質(zhì)，并被認為是進行基于含在Gag-Pol蛋白質(zhì)中的蛋白酶加工，于是產(chǎn)生P17。從上述操作獲得的克隆中，選擇表達加工P55Gag蛋白質(zhì)活性和產(chǎn)生大量P17活性的克隆，并命名為pTG691。
用BglⅡ切斷后，用T4DNA聚合酶處理pTG591，然后進一步用PstⅠ切斷。收集產(chǎn)生的約0.52kb DNA片段。另一方面，用NsiⅠ、S1核酸酶和PstⅠ順序處理pTG591，并收集產(chǎn)生的約2.9kb DNA片段。從通過連接這兩種DNA獲得的許多克隆中，選擇表達加工P55Gag蛋白質(zhì)和產(chǎn)生大量P17活性的克隆，并命名為pTG681。
用SphⅠ和ApaⅠ切斷pTG591，在用T4DNA聚合酶處理后，引起自鏈合，以制備pTG171。
用SphⅠ和ApaⅠ切斷pTG592，在用T4DNA聚合酶處理后，引起自鏈合，以制備pTG172。
用EcoRⅠ和PstⅠ切斷實施例14制備的Gag19·(Nde)，并將所得到的0.76kb DNA片段插入用EcoRⅠ和PstⅠ切開的M13mp18中，以制備Gag18·(Bg-P)。將Gag18·(Bg-P)上的gag基因的第133密碼子CCT用體外誘變轉(zhuǎn)變成TAA，以制備具有在編碼P17區(qū)后立即插入的終止密碼子的Gag18·TAA。用NdeⅠ和PstⅠ切斷Gag18.TAA，并將所得到的0.63kb DNA片段插入用NdeⅠ和PstⅠ切開的pT7-7中，以制備pTG52。
通過在pTG691和pTG671中移碼及通過在pTG681和pTG172中不移碼蛋白酶表達，對缺陷Gag蛋白質(zhì)和Gap-pol蛋白質(zhì)進行加工，于是產(chǎn)生大量P17，另外，pTG681翻譯后不需要加工而直接產(chǎn)生大量P17。
實施例16提取P17轉(zhuǎn)化體克隆BL21(DE3)/pTG171于37℃、在含20μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時，然后將1/100體積加到新鮮LB培養(yǎng)基(含20μg氨芐青霉素/ml)中并在37℃培養(yǎng)。當培養(yǎng)基的OD600nm達到0.5時，添加1mmol IPTG，并在37℃繼續(xù)培養(yǎng)5小時。通過離心分離(5000rpm，10分鐘)收集細菌細胞，并懸浮在1/50體積的15mmol磷酸鈉(pH6.7)中，在超聲波處理(6個30秒脈沖，19.5kHz，300W)后，將通過離心分離(19000rpm，60分鐘)所獲得的上清液分離，作為原提取液。
P17的粗提純將硫酸銨加到原提取液中，以便達到40%的飽和，攪拌后將混合物離心分離(16000rpm，20分鐘)。將硫酸銨加到這樣獲得的上清液中，以便達到80%的飽和，攪拌后離心分離(16000rpm，20分鐘)混合物。將所得到的沉淀物溶入15mmol磷酸鈉緩沖劑(pH6.7)中，并逆著相同緩沖劑滲析。
P17的提純將滲析的樣品施加到用15mmol磷酸鈉(pH6.7)平衡的S-瓊脂糖(Pharmacia〔瑞典〕制造)上。然后用梯度為0-1mol的氯化鈉洗脫樣品。匯集含P17的餾分并用15mmol磷酸鈉稀釋到2倍。將餾分施加到用相同緩沖劑平衡的MonoS柱(Pharmacia制造)上，然后用梯度為0-1mol的氯化鈉洗脫，匯集含P17的餾分，用20mmol磷酸鈉(pH7.0)和10mmol 2-巰基乙醇稀釋到5倍。將所得到的稀釋樣品施加到羥磷灰石柱(KB柱，Koken，Ltd.〔日本〕制造)上，并用梯度為15-700mmol的磷酸鈉洗脫。每升轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)液提純的P17的產(chǎn)率是約4mg。從其中除去N末端上的甲硫氨酸殘基的提純的P17不進行肉豆蔻基化，并具有一種N末端氨基酸順序Gly-Ala-Arg-Ala-Ser-Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp……，因此，與由核苷酸順序預(yù)測的氨基酸順序一致。
實施例17攜帶HIV-1的nef基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建用HindⅢ切斷HIV-1原病毒DNA克隆pNL4-3，并將所得的約1.5kb DNA片段插入克隆載體pHSG398的HindⅢ部分，以制備pNLH152。用HindⅢ和XhoⅠ切斷這個pNLH152。將所得到的約0.72kb XhoⅠ-HindⅢ片段插入用SalⅠ和HindⅢ切開的表達載體pUR292(The EMBO Journal，2(2)1791-1794，1983)中，以制備pNF102。用BamHⅠ和HindⅢ切斷這個pNF102，并將所得到的約0.72kb BamHⅠ-HindⅢ片段插入用BamHⅠ和HindⅢ切開的表達載體pT7-7中，以制備pTF103。然后用BamHⅠ切開這個pTF103，在用T4DNA聚合酶處理后，引起自鏈合，以制備pTN104。上述pNF102高表達嵌合體蛋白質(zhì)含β-半乳糖苷酶和HIV-1Nef蛋白質(zhì)的氨基酸的35-206(C末端)的區(qū)。上述pTN104高表達嵌合體蛋白質(zhì)被加到Nef蛋白質(zhì)的氨基酸的35-206覆蓋區(qū)的N末端，在該嵌合體蛋白質(zhì)中肽由pT7-7的多克隆部位衍生的11種氨基酸組成。這些嵌合體蛋白質(zhì)特別在Western印跡中與來自HIV-1載體的血清反應(yīng)。在pNF102中使用菌株JM103和菌株UT481，而在pTF104中使用菌株BL(DE3)作為表達宿主。
實施例18高度表達HIV-1Nef蛋白質(zhì)的載體的構(gòu)建首先，用HindⅢ和HinCⅡ切斷pNLH152，并將所得到的約0.96kb HinCⅡ-HindⅢ片段插入用HinCⅡ和HindⅢ切開的M13m19中，以制備Nef19·(Hc-H)。順序AAG緊接在Nef19·(Hc-H)上的nef基因的起動密碼子之前借助于體外誘變轉(zhuǎn)變成CAT，以制備Nde重新引入其中的Nef19·(Nde)。用NdeⅠ和HindⅢ切斷Nef19·(Nde)，并將所得到的約0.82kb NdeⅠ-HindⅢ片段插入用NdeⅠ和HindⅢ切開的表達載體pT7-7中，以制備pT7-Nef。通過pT-Nef引入菌株BL21(DE3)中表達和積累占大于整個細菌蛋白質(zhì)10%的Nef蛋白質(zhì)。
實施例19Nef蛋白質(zhì)的提取和提純轉(zhuǎn)化體克隆BL21(DE3)/pT7-Nef于37℃、在含20μg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時，然后將1/100體積加到新鮮LB培養(yǎng)基(含20μg氨芐青霉素/ml)中并在37℃培養(yǎng)該混合物。當培養(yǎng)基的OD600nm達到1.0時，添加1mmol IPTG，并繼續(xù)培養(yǎng)5小時。通過離心分離(5000rpm，10分鐘)收集細菌細胞，并懸浮在1/50體積的20mmol磷酸鈉中，在超聲波處理(6個30秒脈沖，19.5kHz，300W)后，分離由離心分離(19000rpm，60分鐘)得到的上清液，作為原提取液。
Nef蛋白質(zhì)的粗提純將硫酸銨加入原提取液中，以便達到35%的飽和，在攪拌后，將混合物離心分離(16000rpm，20分鐘)。將所得到的沉淀物溶入20mmol磷酸鈉緩沖劑中，然后逆著相同的緩沖劑滲析。
Nef蛋白質(zhì)的提純將滲析的樣品施加到用20mmol磷酸鈉(pH7.0)平衡的S-瓊脂糖(Pharmacia〔瑞典〕制造)上。然后用梯度為0-1mol的氯化鈉洗脫樣品，匯集含Nef蛋白質(zhì)的餾分，然后逆著20mmol磷酸鈉(pH7.0)滲析。然后將樣品施加到羥磷灰石柱(KB柱，Koken，Ltd.制造)上，并用梯度為20-700mmol磷酸鈉洗脫。匯集含Nef蛋白質(zhì)的餾分并逆著20mmol tris-HCl(pH8.3)和5mmol 2-巰基乙醇滲析。將該樣品施加到MonoQ柱上，并用梯度為0-1mol氯化鈉洗脫。匯集含Nef蛋白質(zhì)的餾分，由此制備出提純的Nef蛋白質(zhì)。每升轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)液提純的Nef蛋白質(zhì)的產(chǎn)率是約7mg。
用E.coli大量產(chǎn)生的并從其中去除N末端甲硫氨酸殘基而提純的Nef蛋白質(zhì)不進行肉豆蔻基化，并呈現(xiàn)出一種N末端氨基酸順序Gly-Gly-Lys-Trp-Ser-Lys-Ser-Ser-Val-Ile-Gly-Trp-Pro-Ala-Val……，因此，與由核苷酸順序預(yù)測的氨基酸順序一致。
實施例20用提純的Nef蛋白質(zhì)診斷HIV-1感染將實施例19制備的提純Nef蛋白質(zhì)按照實施例2所述的方法在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并在硝化纖維膜上進行印跡。為了封閉，將膜浸入3W/V%明膠溶液中。接著，用Weseern印跡技術(shù)研究在人HIV-1載體(7個對象)血清中抗HIV-1Nef蛋白質(zhì)抗體的存在。類似地研究健康成年人(9個對象)。結(jié)果示于表2。
7個HIV-1載體中的6個血清同Nef蛋白質(zhì)陽性反應(yīng)。這就提出，通過使用由Escherichia chli制備的提純HIV-1蛋白質(zhì)能夠有效地檢查和診斷HIV-1感染的存在。
表2使用提純的Nef蛋白質(zhì)通過Western印跡診斷HIV-1感染對象反應(yīng)性＊HIV-1載體的人血清 1 +＊＊2 +3 +4 +5 +6 +7 ±健康成年人的人血清 1 +2 ±3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -
＊對提純Nef蛋白質(zhì)的特殊免疫反應(yīng)。
＊＊通過Western印跡技術(shù)測定反應(yīng)性。顯示陽性(+)反應(yīng)和陰性(-)反應(yīng)。
本發(fā)明應(yīng)用于基于遺傳工程的醫(yī)用品和診斷劑的生產(chǎn)領(lǐng)域，以及作為象分子生物學(xué)、病毒學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)這樣的領(lǐng)域的研究用試劑。
權(quán)利要求
1.一種制備具有逆病毒基因表達能力和翻譯后具有加工能力的質(zhì)粒的方法，它包括的步驟是通過將所制備的以致至少含蛋白酶基因區(qū)的逆病毒基因CDNA片段插入DNA，以鏈合方式形成，所述DNA選自由高度表達基因和基因直接表達載體構(gòu)成的組。
2.一種如權(quán)利要求1所述的制備質(zhì)粒的方法，其中上述逆病毒是AIDS病毒。
3.一種具有逆病毒基因表達能力和翻譯后具有加工能力的質(zhì)粒，它包括通過將所制備的以致至少含蛋白酶基因區(qū)的逆病毒基因CDNA片段插入DNA，以鏈合方式形成，所述DNA選自高度表達基因和基因直接表達載體構(gòu)成的組。
4.一種如權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒，其中上述逆病毒是AIDS病毒。
5.具有逆病毒基因表達能力和翻譯后具有加工能力的質(zhì)粒表達產(chǎn)物，它包括通過將所制備的以致至少含蛋白酶基因區(qū)的逆病毒基因cDNA片段插入DNA，以鏈合方式形成，所述DNA選自由高度表達基因和基因直接表達載體構(gòu)成的組。
6.如權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒表達產(chǎn)物，其中上述逆病毒是AIDS病毒。
7.如權(quán)利要求5或6所述的質(zhì)粒表達產(chǎn)物，其中上述表達產(chǎn)物至少是一種選自由用gag和pol基因編碼的核心蛋白質(zhì)和酶構(gòu)成的組。
8.一種通過將所制備的以致至少含HIV nef基因區(qū)的逆病毒基因cDNA片段插入DNA，以鏈合方式形成的質(zhì)粒，所述DNA選自由高度表達基因和基因直接表達載體構(gòu)成的組。
9.一種質(zhì)粒表達產(chǎn)物，該質(zhì)粒通過將所制備的以致至少含HIV nef基因區(qū)的逆病毒基因cDNA片段插入DNA，以鏈合方式形成，所述DNA選自由高度表達基因和基因直接表達載體構(gòu)成的組。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備具有逆病毒基因表達能力和翻譯后加工能力的質(zhì)粒的方法和產(chǎn)生的質(zhì)粒及其表達產(chǎn)物。
文檔編號C12N15/69GK1058044SQ9110456
公開日1992年1月22日 申請日期1991年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1990年5月28日
發(fā)明者斉藤敦, 品川日出夫, 中田篤男 申請人:阪大微生物病研究會