專利名稱：D-α氨基酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及D-α氨基酸的制備方法，特別是涉及使用具有有關(guān)使D-N-氨基甲酰-α氨基酸轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶的遺傳因子的新型轉(zhuǎn)化體的D-α-氨基酸的制備方法。
旋光活性的D-α-氨基酸類是作為藥物中間體的重要化合物，尤其是，可以舉出作為半合成青霉素類或半合成頭孢菌素類的制造中間體的，D-苯基甘氨酸，D-對(duì)羥基苯基甘氨酸等工業(yè)上有用的化合物。作為這樣的D-α-氨基酸類的制備方法，已知的有除去對(duì)應(yīng)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸類的氨基甲?；迫〉姆椒?，而其除去氨基甲酰基是通過化學(xué)上的方法(特公昭58-4707號(hào)的說明書)或利用微生物的酶反應(yīng)的方法(特公昭57-18793號(hào)說明書，特公昭63-20520號(hào)說明書，特公平1-48758號(hào)說明書)而進(jìn)行的。
為了除去上述氨基甲酰基而采用的化學(xué)方法，由于大量使用硫酸等無機(jī)酸，因而存在著與此處理等相關(guān)的環(huán)境保護(hù)上的問題。另外，利用酶反應(yīng)的方法，至今已知的作為酶供給源的微生物中都沒有充分的酶產(chǎn)量，而且還具有在其酶的生產(chǎn)中必須用高價(jià)的海因化合物或N-氨基甲酰氨基酸化合物等的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的在于要解決上述問題，研究制備高產(chǎn)量酶的微生物的同時(shí)，使用這樣得到的酶源，以高效率地生產(chǎn)D-α-氨基酸。
在類似的技術(shù)中有特開昭63-24894號(hào)，但是該發(fā)明是關(guān)于L-α-氨基酸制法的技術(shù)，并沒有示出關(guān)于D-α-氨基酸制備的實(shí)驗(yàn)例。
本發(fā)明是提供一種制備D-α-氨基酸的方法，其特征在于，使用含有有關(guān)除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⑥D(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶的遺傳因子的DNA片段和載體 DNA的重組體DNA，并將選自屬于埃希氏桿菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，芽孢菌屬，沙雷氏菌屬，棒狀桿菌屬或短頸細(xì)菌屬的微生物的宿主菌體，通過轉(zhuǎn)化而得的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的相應(yīng)的酶的作用，在水性介質(zhì)中使D-N-氨基甲酰(基)-α-氨基酸變換成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸，并采集生成的D-α-氨基酸。
另外，使由有關(guān)除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⑹怪儞Q成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶的遺傳因子與載體構(gòu)成的重組體DNA導(dǎo)入微生物中，并發(fā)現(xiàn)該遺傳因子質(zhì)粒的例子，以前是完全不知道的，是通過本發(fā)明首獲成功的。
用于本發(fā)明的，除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⒆儞Q成相應(yīng)的D-α-氨基酸的酶，是在D-異構(gòu)體中特異地起作用的酶，或是在D-體，L-體中起作用的酶，實(shí)際上都無妨。另外，對(duì)于D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的立體選擇性嚴(yán)格的酶，是叫做D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶。
用作本發(fā)明的含有遺傳因子的DNA片段，可以舉出，來源于真核生物，原核生物，病毒，噬菌體或質(zhì)粒，并含有有關(guān)D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的遺傳因子的DNA片段。作為來自原核生物的遺傳因子，是來自于屬于細(xì)菌，特別是假單胞細(xì)菌屬，土壤桿菌屬，氣桿菌屬，短頸細(xì)菌屬，芽胞桿菌屬，黃桿菌屬，沙雷氏桿菌屬，細(xì)球菌屬，節(jié)細(xì)菌屬(ァスロバクタ-屬，Arthrobacter)，產(chǎn)堿桿菌屬，無色桿菌屬，莫拉克氏菌屬，副球菌(paracoccus)屬等的細(xì)菌的遺傳因子，較好的是有關(guān)D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的遺傳因子。這樣的菌株的具體實(shí)例為如下所列陰溝氣桿菌(Aerobacter cloacae)I AM 1221、斑點(diǎn)芽孢桿菌(Bacillus macroides)ATCC 12905、蜂房芽孢桿菌(Bacillus alvei)IFO 3343，產(chǎn)氨短頸細(xì)菌(Brevibacterium ammoniagenes)IFO 12071，黃色黃桿菌(Flavobacterium flavescens)IFO 3086、藤黃八疊球菌(Sarcinalutea)IFO 1099、粘質(zhì)賽氏桿菌(Serratiamarcescens)IFO 3054、藤黃小球菌(Micrococcus luteus)IFO 12708、親水氣桿菌(Aeromonas hydrophila) IFO 3820、放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)KNK 712(FERM BP-1900)、假單胞細(xì)菌(Pseudomonas)sp.KNK 003A(FERM BP-3181)、假單胞細(xì)菌(Pseudomonas)sp.KNK505(FREM BP-3182)、土壤桿菌(Agrobacterium)1302 NRRL B 11291綠柱石色產(chǎn)堿細(xì)菌(Alkaligenes aquamarinus)AJ 11199、溶膠無色桿菌(Achro mobacter liqueqaciens)AJ 11198、無溶膠莫拉克斯菌(Moraxella nonliquefaciens)AJ 11221，脫氮副球菌(Paracoccus denitrifi cans)AJ 11222，脆性節(jié)細(xì)菌(Arthrobacter fragilus)AJ11223等。
作為上述細(xì)菌的代表例，放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)KNK 712(FEKM BP-1900)、假單胞細(xì)菌(Pseudomonas)sp.KNK 003A(FERM BP-3181)和假單胞細(xì)菌(Pseudomonas)sp.KNK505(FREM BP-3182)的細(xì)菌學(xué)上的諸性質(zhì)如下所示。
放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)-KNK 712(FERM BP-1900)(a)形態(tài)(1)細(xì)胞的形狀和大小0.5～1.0×2.0～4.0μm、桿菌(2)有無細(xì)胞的多形性無(3)有無運(yùn)動(dòng)性、鞭毛的附著生長狀態(tài)有亞茯苓屬(サブポ-ラ-)(4)有無孢子無(5)革蘭氏染色性陰性(b)在各種培養(yǎng)基上繁殖狀態(tài)(1)肉汁瓊脂平板培養(yǎng)良好的繁殖、圓形、隆起性、邊緣平滑、表面平滑濕潤、白色～乳色、光澤、不透明、液狀(2)肉汁瓊脂斜面培養(yǎng)旺盛地繁殖、在接種線上一樣繁殖、隆起厚、表面平滑濕潤、邊緣平滑、白色～乳色、光澤、不透明、培養(yǎng)基上無變化(3)肉汁明膠劃線培養(yǎng)微弱地生長、沿劃線生長、在劃線周邊生長、不使明膠液化、白色～乳色、透明度不變化、培養(yǎng)基上無變化(4)肉汁液體培養(yǎng)中等程度的繁殖、混濁不均一、形成絮凝物、表面無繁殖(5)石蕊·乳液弱酸(c)生理學(xué)上的性質(zhì)(1)硝酸鹽的還原+(2)脫氮反應(yīng)+
(3)MR試驗(yàn)+(4)Vp試驗(yàn)-(5)吲哚的生成-(6)硫化氫的生成-(7)淀粉的加水分解-(8)檸檬酸的利用-[西蒙氏(simon′s)培養(yǎng)基](9)無機(jī)氮源+(硝酸鹽、銨鹽)(10)尿素酶-(11)氧化酶+(12)過氧化氫酶+(13)繁殖的范圍20～37℃、pH6.5～8.5(14)對(duì)于氧的態(tài)度需氧(15)O-F試驗(yàn)0(16)來自于糖的酸和氣體的生成酶的生成-、氣體的生成-(D-葡萄糖)(17)丙二酸的利用-(18)苯基丙氨酸的脫氨基酶反應(yīng)-(19)脫羧酶反應(yīng)-(賴氨酸)(20)精氨酸二氫化酶反應(yīng)-(21)酪蛋白的分解性-(22)DNA的分解-(23)營養(yǎng)要求性無(24)碳?xì)浠衔锏耐訢-葡萄糖+L-阿拉伯糖+
蔗糖+D-果糖+丙二酸鹽-纖維二糖+乙醇-D-木糖+D-酒石酸鹽-山梨糖醇+サィトレ-ト-乳糖+甘露糖醇+內(nèi)消旋環(huán)己六醇+棉子糖+L-鼠李糖+麥芽糖+α-甲基-D-葡糖苷+D-マンスノ-ス+水楊苷-N-乙酰基葡糖胺+葡萄糖酸鹽-癸酸鹽-己二酸鹽-苯基乙酸鹽-甲醇-
(25)蛋黃反應(yīng)-(26)β-乳溶淀粉酶+(27)偏流線的(エフス
的加水分解+(28)細(xì)胞色素·氧化酶+(29)吐溫的分解+(吐溫80)(30)3-酮乳糖的生成-假單胞細(xì)菌(Pseudomonas)sp.KNK 003A(FERM PB-3181)(a)形態(tài)(1)細(xì)胞的形狀和大小0.5～0.7×1.2～2.5μm、桿菌(2)有無細(xì)胞的多形性無(3)有無運(yùn)動(dòng)性有(4)有無孢子無(5)革蘭氏染色性陰性(6)菌落的形態(tài)圓形、正規(guī)、全面、平滑、輝狀、半透明、淡黃(b)生理學(xué)上的性質(zhì)(1)用3%KOH的溶菌+(2)氨基肽酶+(3)氧化酶+(4)過氧化氫酶+(5)菌的生長厭氧條件-37/40℃+/+pH5.6-
Mac-Conkey瓊脂-SS瓊脂-Cetrimid瓊脂-(6)酸的生成(O-F試驗(yàn))葡萄糖需氧的條件-葡萄糖厭氧的條件-(7)來自于葡萄糖的氣體的生成-(8)酸的生成(ASS)葡萄糖+果糖-木糖+(9)ONPG-(10)ADH-(11)ODC-(12)VP-(13)吲哚的生成-(14)硝酸鹽的還原-(15)脫氮反應(yīng)-(16)苯基丙氨酸脫氨基酶-(17)由蔗糖來的左聚糖的生成-(18)卵磷脂酶-(19)尿素酶-(20)加水分解淀粉-
明膠-酪蛋白-DNA-吐溫80-七葉苷-(21)酪氨酸的分解-(22)各種化合物的同化性乙酸鹽弱己二酸鹽-癸酸鹽-檸檬酸鹽-檸康酸鹽-乙醇酸鹽-丙醇酸鹽+乙酰丙酸鹽-蘋果酸鹽(マレ-ト)-丙二蘋果酸鹽(マロネ-ト)-中康酸鹽(メサコネ-ト)-苯基乙酸鹽-苯基氨基甲酸甲乙鹽(スベレ-ト)-m-酒石酸鹽-D-酒石酸鹽-L-阿拉柏糖+果糖+
葡萄糖+甘露糖+麥芽糖-木糖+蔗糖-海藻糖-核糖-糖精酸鹽(サツヵレ-ト)-羥基丁酸鹽-苯甲酸鹽-甘露糖醇+葡萄糖酸鹽+2-酮葡萄糖酸鹽+N-乙酰基葡糖胺-L-絲氨酸-L-組氨酸-L-纈氨酸-(23)主要的呼吸(醌型)泛醌10假單胞細(xì)菌 SP.KNK 505(FERM BP-3182)(a)形態(tài)(1)細(xì)胞形狀和大小0.5～0.7×1.2～2.5μm、桿菌(2)有無細(xì)胞的多形性無(3)有無運(yùn)動(dòng)性有(4)有無孢子無
(5)革蘭氏染色性陰性(6)菌落的形態(tài)圓形、正規(guī)、全面、輝狀、半透明、淡黃(b)生理學(xué)上的性質(zhì)(1)由3%KOH的溶菌+(2)氨基肽酶+(3)氧化酶+(4)過氧化氫酶+(5)菌的繁殖厭氧條件-37/40℃+/+pH5.6-Mac-Conkey瓊脂-ss瓊脂-cetrimid瓊脂-(6)酸的生成(O-F試驗(yàn))葡萄糖需氧條件-葡萄糖厭氧條件-(7)來自葡萄糖的氣體的生成-(8)酸的生成(ASS)葡萄糖+果糖-木糖+(9)ONPG-(10)ADH-
(11)ODC-(12)VP-(13)吲哚的生成-(14)硝酸鹽的還原-(15)脫氮反應(yīng)-(16)苯基丙酸脫氨基酶(deaminase)-(17)來自蔗糖的左聚糖的生成-(18)卵磷酸酶-(19)尿素酶-(20)加水分解淀粉-明膠-酪蛋白-DNA-吐溫80-七葉苷-(21)酪氨酸的分解-(22)各種化合物的同化性乙酸鹽弱己二酸鹽-癸酸鹽-檸檬酸鹽-檸康酸鹽-乙醇酸鹽-
丙醇酸鹽+乙酰丙醇酸鹽-蘋果酸鹽(マレ-ト malate)-丙二酸鹽(マロネ-ト malonate)-中康酸鹽(メサコネ-ト mesaconat)-苯基乙酸鹽-辛二酸鹽(スベレ-ト)-m-酒石酸鹽-D-酒石酸鹽-L-阿拉伯糖+果糖+葡萄糖+甘露糖+麥芽糖-木糖+蔗糖-海藻糖-核糖-糖精酸鹽-羥基丁酸鹽-苯甲酸鹽-甘露糖醇+葡萄糖酸鹽+2-酮葡萄糖酸鹽+
N-乙?；咸前?L-絲氨酸-L-組氨酸-L-纈氨酸-(23)主要的呼吸(醌型)泛醌10從這樣的菌株制得有關(guān)除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⑥D(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶的遺傳因子時(shí)，通常，是根據(jù)從微生物的染色體提取遺傳因子DNA的操作進(jìn)行;提取后，得到含有作為目的之遺傳因子的DNA片段并對(duì)其堿基序列進(jìn)行剖析。接著進(jìn)行培養(yǎng)產(chǎn)生除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⒆儞Q成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶的微生物，以及導(dǎo)入該酶遺傳因子的重組微生物，并且要對(duì)所產(chǎn)生的酶進(jìn)行精制，決定該蛋白的分子量的同時(shí)，用氣相蛋白質(zhì)定序器等確定氨基末端附近的氨基酸序列。其次，比較這些DNA堿基序列和蛋白質(zhì)的氨基末端序列，對(duì)除去氨基甲?；拿傅鞍椎木幋a的堿基序列部分的蛋白確定翻譯開始部位，并也要考慮確定從該部位到翻譯終止密碼子的遺傳因子的部分內(nèi)編碼酶蛋白與蛋白分子量的關(guān)系，從而確定作為目的之遺傳因子(Malecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press第4章，第13章)。以此，由放射形土壤桿菌-KNK712和假單胞菌sp.KNK003A得到了序列表中序列號(hào)1和2的DNA片段。使這樣得到的該酶編碼的遺傳因子和/或含它的DNA片段，由于通常在一個(gè)氨基酸中對(duì)應(yīng)多個(gè)堿基密碼子，所以與具有該遺傳因子和/或在DNA片段中編碼對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的其它堿基序列的DNA片段是等價(jià)的，這一事實(shí)是清楚的。
用于本發(fā)明的載體，可以使用質(zhì)粒，噬菌體及其衍生物，而該質(zhì)粒，噬菌體及其衍生物是來自于可在屬于埃希氏菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，芽孢桿菌屬，沙雷氏桿菌屬，棒狀桿菌屬和短頸細(xì)菌屬的細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)自律復(fù)制的微生物。例如，可以使用「重組DNA實(shí)驗(yàn)指南」(科學(xué)技術(shù)廳研究開發(fā)局ラィフサィエンス課編昭和62年9月6日改訂)第55頁中記載的宿主-載體系列。另外，為了提高酶的生產(chǎn)量可以使用具有強(qiáng)力的結(jié)構(gòu)助催化劑之類的修飾載體。
含遺傳因子的DNA片段和載體DNA的重組體的制作，可以通過在已知的離體重組DNA的技術(shù)方法來進(jìn)行實(shí)施。離體DNA重組，通常是采用使含目的之遺傳因子的供給體DNA與載體DNA的切斷和結(jié)合(連接反應(yīng))而進(jìn)行的(例如，可參見特愿昭56-211908號(hào)說明書，美國專利第4237224號(hào))。采用連接反應(yīng)，除了生成目的之重組體DNA外，還會(huì)生成多種的重組體DNA，為了選擇性地取得目的重組體DNA，可以使用連接反應(yīng)液，并將屬于埃希氏菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，芽孢桿菌屬，沙雷氏桿菌屬，棒狀桿菌屬或短頸桿菌屬的微生物進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化，選擇分離來自目的遺傳因子的遺傳信息的，已得到遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化株，然后由該培養(yǎng)菌體中提取分離。
對(duì)于上述菌種不進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化時(shí)，例如在大腸桿菌之類的其他微生物的宿主載體系列上一旦進(jìn)行遺傳因子的克隆，接著離體制作同合適的載體的重組體DNA之后，使之上述菌株轉(zhuǎn)化，并且以上述相同的操作，對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行選擇分離也可以取得重組體。
為了制備重組體，可以廣泛應(yīng)用下列文獻(xiàn)S.N.Cohen等人，美國專利4，237，224號(hào)說明書;遺傳因子操作實(shí)驗(yàn)法、[高木康敬編著，講談社サイエライフイック(1980)];Method in Enzymology，68，Recombinant DNA[Ray Mv編，Academic Press(1979)];特愿昭56-21-1908號(hào)說明書等。
通過多種的重組體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的情況下，從轉(zhuǎn)化株選擇含目的遺傳因子，即含有D-N-氨基甲酰-α氨基酸酰胺水解酶的遺傳因子并顯現(xiàn)該遺傳因子的轉(zhuǎn)化株的方法是，首先在含有氨必西林之類的選擇標(biāo)記的片上使之繁殖轉(zhuǎn)化株的菌落。然后，收集含有這些重組體DNA的多種轉(zhuǎn)化株的菌落，并懸浮于生理鹽水中，再將該懸浮液接種于以D-N-氨基甲酰-α-氨基酸單獨(dú)做氮源的液體的基本培養(yǎng)基上。在該培養(yǎng)基上，只可能繁殖可使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸同化的轉(zhuǎn)化株，即重新賦予D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶活性的轉(zhuǎn)化株。將這樣繁殖的培養(yǎng)液接種到上述基本培養(yǎng)基上，通過反復(fù)進(jìn)行該操作，集積目的轉(zhuǎn)化株。由該集積培養(yǎng)液以常規(guī)方法分離菌，并對(duì)分離的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行培養(yǎng)，將D-N-氨基甲酰-α氨基酸作為基質(zhì)進(jìn)行菌體反應(yīng)，通過確認(rèn)D-α-氨基酸生成之事實(shí)可以得到含目的遺傳因子的轉(zhuǎn)化株。
從這樣得到的轉(zhuǎn)化株中，采用堿性變性的方法(參見Molecular Cloning A Laboratory，Manual 2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press第1章)等的普通方法，提取重組體DNA，并在含有克隆的目的遺傳因子之DNA片段中，使用酶的結(jié)構(gòu)遺傳因子進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)，再除去不要的DNA，或者構(gòu)建使之在載體中具有強(qiáng)力助催化劑那樣修飾的重組體DNA，并使上述的宿主菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以使用所得的轉(zhuǎn)化株，就可以提高目的酶的生產(chǎn)量。
轉(zhuǎn)化株，以在通常的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)就可以顯現(xiàn)導(dǎo)入的重組體DNA的物質(zhì)。在重組體DNA上賦予來自遺傳因子的DNA或載體DNA的性質(zhì)的情況下，只要符合該性質(zhì)也可以在培養(yǎng)基上補(bǔ)充試劑。
將如此得到的轉(zhuǎn)化株以作為酶源而得到時(shí)，可以使用常規(guī)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，而且根據(jù)需要還可以通過加入海因化合物，D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖(IPIG)等和提高溫度等，以進(jìn)行為使酶衍生的處理。
為了培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株而使用的培養(yǎng)基，通?？梢允呛刑荚?，氮源和無機(jī)離子的普通培養(yǎng)基。其中若加入維生素，氨基酸等有機(jī)微量營養(yǎng)成份，獲得好結(jié)果的情況居多。作為碳源，適宜使用葡萄糖或蔗糖之類的糖類，乙酸之類的有機(jī)酸和醇類等。作為氮源，可以使用氨氣，氨水和銨鹽等。作為無機(jī)離子可以使用磷酸離子，鎂離子，鉀離子和鐵離子等。
該培養(yǎng)如果在需氧條件及控制pH4～8，溫度25～45℃的適當(dāng)范圍內(nèi)進(jìn)行1-10天的培養(yǎng)時(shí)，可以得到所希望的結(jié)果。
作為產(chǎn)生轉(zhuǎn)化株的酶的作用狀態(tài)，可以舉出該轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)液，菌體，菌體處理物，從菌體提取的酶，固定化菌體等。
作為菌體，培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液的原樣，從培養(yǎng)液分離的菌體以及洗凈的菌體等均能使用。作為菌體處理物，可以使用冷凍干燥菌體，丙酮干燥菌體、與甲苯或表面活性劑接觸的菌體、用溶菌酶處理的菌體、在超聲波中處理的菌體和機(jī)械磨碎的菌體等，此外還有具有由這些菌體的處理物得到的，除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的甲?；⒆儞Q成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶活性的酶提取液，另外還可以使用這些菌體的固定物，菌體處理的不溶物，以及用于固定酶蛋白的載體(例如陰離子交換樹脂)上固定的固定物等。另外關(guān)于固定方法，例如可以參考特開昭63-185382號(hào)說明書。
用作固定的載體，適用的有Doulite A568或DSI7186(ロ-ム·ァント·ハ-ス社注冊商標(biāo))等的苯酚-甲醛陰離子交換樹脂，Amberlite IRA 935，IRA 945，IRA 901(ロ-ム·ァンド·ハ-ス社注冊商標(biāo))，Lewatatit OC 1037(バィエル社注冊商標(biāo))，Diaion EX-05(三菱化成工業(yè)注冊商標(biāo))等聚苯乙烯樹脂之類的各種胺或銨鹽或者具有二乙醇胺型的官能基的各種陰離子交換樹脂。也可以使用其他的DEAE-纖維素等載體。
另外，為使酶牢固而穩(wěn)定地吸附，通?？梢允褂媒宦?lián)劑，適合的例子為戊二醛。所用的酶，不只是精制的酶，還可以使用部分精制酶，菌體破碎液，無細(xì)胞提取液等各種精制酶。
固定化酶的調(diào)制可以采用在酶液和載體上吸附酶后，使之進(jìn)行交聯(lián)處理等通常的調(diào)制方法。
成為本發(fā)明中的酶反應(yīng)基質(zhì)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，可用通式R-CH(NHCONH2)-COOH表示，而實(shí)際上供反應(yīng)的狀態(tài)是在所用的酶為對(duì)D-N-氨基甲酰-α-氨基酸具有嚴(yán)格的立體選擇性的情況下，可以使用D-體或作為D-體與L-體的混合物。另外，氧也作用于L-氨基甲酰氨基酸而立體選擇性不嚴(yán)格的情況或，作為也作用于L-體的酶的混合物而使用的情況下，只使用D-體，并且使生成的α-氨基酸變成D-體那樣處理為好。
取代基R，可以為特公昭57-18793號(hào)，特公昭63-20520號(hào)，特公平1-48758號(hào)說明書中所述的廣泛范圍中的基團(tuán)。但是尤其是為了賦予藥物中間體之類工業(yè)上有用的化合物，R最好為苯基，用羥基取代了的苯基、烷基、取代烷基、芳烷基或噻嗯基。用羥基取代的苯基的情況下，該羥基可以為一個(gè)或一個(gè)以上，并且可以在鄰、間、對(duì)位上進(jìn)行取代，而有代表性的是對(duì)羥基苯基。烷基是碳原子數(shù)1～4的烷基，其對(duì)應(yīng)的氨基酸成為D-丙氨酸，D-纈氨酸，D-亮氨酸、D-異亮氨酸等的基。取代的烷基是，以羥基、硫代烷基、羧基、氨基、苯基、羥基取代的苯基、或以酰胺基等取代的，含碳原子數(shù)1～4的烷基，其對(duì)應(yīng)的氨基酸成為D-絲氨酸、D-蘇氨酸、D-甲硫氨酸、D-半胱氨酸、D-天門冬酶胺、D-谷氨酰胺、D-酪氨酸、D-色氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-組氨酸、D-賴氨酸、D-精氨酸、D-瓜氨酸等的基。芳烷基是碳原子數(shù)為7～8的，例如，芐基、苯乙基，其對(duì)應(yīng)的氨基酸成為D-苯基丙氨酸等的基。
作為水性介質(zhì)，可以使用含有水，緩沖劑乙醇之類有機(jī)溶劑的水性介質(zhì)。另外根據(jù)需要，在水性介質(zhì)中可以添加微生物的生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，抗氧化劑，表面活性劑，強(qiáng)化酶，羥基氨，金屬等。
在水溶性介質(zhì)中邊培養(yǎng)上述微生物的菌體，同時(shí)使菌體與D-N-氨基甲酰-α-氨基酸接觸而起作用的情況下，可以使用含有D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，并含有該微生物的生長發(fā)育中所需的碳源，氮源，無機(jī)離子等營養(yǎng)物質(zhì)的水性介質(zhì)。另外，如果添加維生素，氨基酸等有機(jī)微量營養(yǎng)物質(zhì)，得到好結(jié)果的情形較多。作為碳源，適用的有葡萄糖，蔗糖等糖類，乙酸之類的有機(jī)酸，醇類等。作為氮源，可以使用氨氣，氨水，銨鹽等。作為無機(jī)離子可以使用磷酸離子，鎂離子，鉀離子，鐵離子等。
在需氧條件下的培養(yǎng)，是控制在pH4～8，溫度25～45℃的適當(dāng)范圍內(nèi)進(jìn)行。如果進(jìn)行1～10天的培養(yǎng)，那么D-N-氨基苯甲酰-α-氨基酸以高產(chǎn)率地只變換成D-α-氨基酸。
對(duì)此，將上述微生物的培養(yǎng)液，在溶解或懸浮D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的水性介質(zhì)中，直接與培養(yǎng)菌體，菌體處理物，酶提取液，固定化菌體，菌體不溶物，或固定化酶蛋白進(jìn)行反應(yīng)的情況下，調(diào)節(jié)適當(dāng)溫度10～80℃，pH值保持在4～9.5，暫時(shí)靜置或攪拌就可以。如此經(jīng)過5～100小時(shí)，則在水性介質(zhì)中生成大量的D-α-氨基酸，并聚積。另外，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，也可以分開添加D-N-氨基甲酰-α-氨基酸。所生成的D-α-氨基酸，可以采用常規(guī)方法進(jìn)行分離和精制。
另外，其中得到的D-α-氨基酸，可以用通式R-CHNH2-COOH(R的定義同前)表示。
實(shí)施例下面展示本發(fā)明的具體實(shí)施方案。并且采用高速液相色譜法(HPLC)或薄層色譜法(TLC)檢測并定量分析了生成的D-α-氨基酸。
實(shí)施例1放射形土壤桿菌-KNK712(FERM BP-1900)的染色體DNA和載體DNA的重組體DNA的構(gòu)建-將放射形土壤桿菌KNK712(FERM BP-1900)用2升的L-液體培養(yǎng)基(胨10克/升，酵母提取液5克/升，氯化鈉5克/升;pH7.0)于33℃培養(yǎng)27小時(shí)后，收集菌體，得到20克菌體。根據(jù)Marmur法從得到的菌體中提取染色體DNA。在該染色體250μg中添加2單位的Sau 3AI，使之在37℃反應(yīng)30分鐘進(jìn)行部分分解。用瓊脂糖凝膠電泳從部分分解DNA中得到4～9kbp的DNA片段。另一方面，用BamHI完全切斷質(zhì)粒pUC18，并將其通過T4DNA連接酶與來自如前得到的染色體的DNA片段相連接，得到多種的重組體質(zhì)粒的混合液。
實(shí)施例2含有來自于放射形土壤桿菌KNK712(FERM BP-1900)的，含有使D-N-氨基甲酰-α氨基酸變換成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸而有關(guān)的遺傳因子的質(zhì)粒的選出-使用實(shí)施例1的質(zhì)?；旌弦?，通過常規(guī)方法使大腸桿菌(Escherichia coli)JM 109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后將其在含有選擇標(biāo)識(shí)的氨必西林的表1的培養(yǎng)基上進(jìn)行平皿培養(yǎng)。
表1細(xì)菌培養(yǎng)基用胨 1克酵母提取液 0.5克氯化鈉 0.5克氨必西林 100毫克瓊脂 15克加水使之作成1升(pH7.0)收集繁殖的菌落，將其接種到以D-N-氨基甲酰-丙氨酸作為單一氮源的表2的液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
表2Na2HPO46克KH2PO43克NaCl 0.5克MgSO40.12克CaCl211毫克葡萄糖 2克氨必西林 50毫克硫氨素 1毫克D-N-氨基甲酰-丙氨酸 1克加水使之作成1升(pH7.0)在此，只是顯現(xiàn)目的遺傳因子的轉(zhuǎn)化株在表2的培養(yǎng)基中將D-N-氨基甲酰-丙氨酸作為N源進(jìn)行同化，并可以繁殖。將用表2的培養(yǎng)基繁殖的培養(yǎng)液接種于相同的培養(yǎng)基上，以反復(fù)進(jìn)行該操作，累積目的轉(zhuǎn)化株。從該累積培養(yǎng)液，用表1的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)化株的純分離。將該純分離菌接種到含有100毫克/升氨必西林的10毫升L-液體培養(yǎng)基(胨10克/升，酵母提取液5克/升，氯化鈉5克/升;pH7.0)上，在37℃培養(yǎng)16小時(shí)之后，對(duì)1毫升培養(yǎng)液采菌，取除上清液，于0.5毫升的基質(zhì)溶液(0.5%D-N-氨基甲酰-對(duì)羥基苯基甘氨酸，0.05% Triton X-100、0.1M磷酸緩沖液(以下稱做KPB);pH7.0)中使菌體懸浮，在37℃反應(yīng)3小時(shí)。將該反應(yīng)液點(diǎn)滴到TLC中，展開之后，用(水合)茚三酮顯色時(shí)，表示與標(biāo)準(zhǔn)樣一致的D-對(duì)羥基苯基甘氨酸的噬菌斑。由以上操作可以確認(rèn)純分離的轉(zhuǎn)化株含有目的酶的遺傳因子的質(zhì)粒。該株含有的質(zhì)粒作為pAHD101。
下面通過堿變性法由上述轉(zhuǎn)化株大量調(diào)制pAHD101，經(jīng)測定，表明具有

圖1所示的結(jié)構(gòu)。
用pAHD101轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，得到大腸桿菌JM109pAHD101。
實(shí)施例3來自假單胞桿菌(Pseudomonas)sp.KNK 003A(FERM BP-3181)的，含有使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸變換成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸而有關(guān)的遺傳因子的質(zhì)粒的選出-用實(shí)施例1同樣的方法，得到假單胞桿菌sp.KNK 003A(FERM BP-3181)的染色體DNA片段和質(zhì)粒pUC 18的，多種的重組體質(zhì)?；旌弦海褂迷摶旌弦?，通過常規(guī)方法對(duì)大腸桿菌JM 109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由該多種轉(zhuǎn)化株，除了用含100毫克/升IPTG的表2的液體培養(yǎng)基代替原來2的液體培養(yǎng)基外，其他按實(shí)施例2相同的方法，得到含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株，該質(zhì)粒含有將D-N-氨基甲酰-α-氨基酸向?qū)?yīng)的D-α-氨基酸變換的有關(guān)酶的遺傳因子。將該株含有的質(zhì)粒命名為pPHD301。
然后由上述轉(zhuǎn)化株大量調(diào)制pPHD301，經(jīng)測定表明具有圖2所示的結(jié)構(gòu)。
用pPHD301轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，得到大腸桿菌JM109pPHD301。
實(shí)施例4pPHD101的亞克隆-
將實(shí)施例2得到的pAHD101用SmaⅠ和EcoRⅠ完全分解，通過瓊脂糖凝膠電泳得到2.7kbp的SmaⅠ-EcoRⅠ片段。此外，將質(zhì)粒pUC19用SmaⅠ和EcoRⅠ完全分解，再通過連接酶將pAHD101的SmaⅠ-EcoRⅠ片段和T4DNA進(jìn)行連接，并以該已連接的質(zhì)粒將大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化株放在含異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖(IPTG)、5-氯-4-溴-3-吲哚-β-D-半乳糖(XgaⅠ)和氨必西林的L-培養(yǎng)基(1%的胨，0.5%酵母提取液，0.5%氯化鈉，1.5%瓊脂;pH7.0)上進(jìn)行培養(yǎng)。
其中，由于在pUC19上含pAHD 101的SmaⅠ-EcoRⅠ片段的質(zhì)粒不呈青色，而成為白色菌落，則選擇白色菌落。為了確認(rèn)該選擇的菌具有目的之酶活性，將其接種在含有100毫克/升氨必西林的10毫升L-液體培養(yǎng)基(1%胨，0.5%酵母提取液，0.5%氯化鈉)上，采菌培養(yǎng)后的培養(yǎng)液1毫升，取除上清液，將菌體懸浮于0.5毫升的基質(zhì)溶液(0.5%D-N-氨基甲酰-對(duì)羥基苯基甘氨酸、0.05%Triton X-100、0.1M磷酸緩沖液;pH7.0)中，在37℃進(jìn)行反應(yīng)3小時(shí)。將該反應(yīng)液在TLC上點(diǎn)滴，展開后用水合茚三酮進(jìn)行顯色時(shí)，表示與標(biāo)準(zhǔn)一致的D-對(duì)羥基苯基甘氨酸的噬菌斑。將含有該轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒命名為pAD107。
下面調(diào)制質(zhì)粒pAD107，并用SalⅠ部分加水分解，通過瓊脂糖凝膠電泳得到含有pUC 19部分的4.5kbp的片段。使用T4DNA連接酶使該片段環(huán)狀化，使用該質(zhì)粒大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從含有氨必西林的L-培養(yǎng)基上取得轉(zhuǎn)化株，采用與上述同樣方法進(jìn)行菌體反應(yīng)，獲得具有使D-N-氨基甲酰-對(duì)羥基苯基甘氨酸轉(zhuǎn)變成D-對(duì)羥基苯基甘氨酸能力的轉(zhuǎn)化株。將含有該轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒命名為pAD108。
再由上述轉(zhuǎn)化株調(diào)制pAD108，經(jīng)測定，表明具有圖3所示的結(jié)構(gòu)。
用pAD108轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，稱做大腸桿菌JM109pAD108。微生物工程研究之寄存編號(hào)為FERM BP-3184。
實(shí)施例5pPHD 301的亞克隆-對(duì)實(shí)施例3得到的pPHD 301用AccⅠ進(jìn)行完全分解，再通過瓊脂糖凝膠電泳得到含pUC18部分的5.2kbp的片段。用T4DNA連接酶使該片段進(jìn)行環(huán)狀化，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從含有氨必西林的L-培養(yǎng)基上取得轉(zhuǎn)化株，按實(shí)施例4相同的方法進(jìn)行菌體反應(yīng)，以便獲得轉(zhuǎn)化株，該轉(zhuǎn)化株具有使D-N-氨基甲酰-對(duì)羥基苯基甘氨酸變換成D-對(duì)羥基苯基甘氨酸的能力。將含有該轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒稱作pPD302。
下面調(diào)制質(zhì)粒pPD302，用SphⅠ和AccⅠ進(jìn)行完全分解之后，通過瓊脂糖凝膠電泳，得到1.8kbp的SphⅠ-AccⅠ片段。另外，用SphⅠ和AccⅠ對(duì)質(zhì)粒pUC19進(jìn)行完全分解，通過T4DNA連接酶與pPD302的SphⅠ-AccⅠ片段連接，并用該連接了的質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從含有氨必西林的L-培養(yǎng)基上取得轉(zhuǎn)化株，并按實(shí)施例4相同方法進(jìn)行菌體反應(yīng)，得到具有使D-N-氨基甲酰-對(duì)羥基苯基甘氨酸變換成D-對(duì)羥基苯基甘氨酸能力的轉(zhuǎn)化株，將該轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒稱做pPD304。由上述轉(zhuǎn)化株調(diào)制pPD304，經(jīng)測定時(shí)，表明具有圖4所示的結(jié)構(gòu)。
用pPD304轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌JM109稱做為大腸桿菌JM109pPD304。微工研寄存編號(hào)為FERM BP-3183。
實(shí)施例6通過由轉(zhuǎn)化株得到的酶使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸變換成D-α-氨基酸-用實(shí)施例4得到的質(zhì)粒pAD108，使大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將該株用含有氨必西林100μg/ml和IPTG100μg/ml的L-液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)16小時(shí)。由100ml該培養(yǎng)液收集菌體，并于0.1M KPB(pH7.0)中進(jìn)行懸浮使之成為10ml。將其于冰冷條件下經(jīng)超聲波粉碎之后，進(jìn)行離心分離，將上清液作為粗酶液而獲得。用該粗酶液使之以表3所示的各種D-N-氨基甲酰-α-氨基酸作為底物進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)是將上述粗酶液100μl加到40mMD-N-氨基甲酰-α-氨基酸(表3)，0.2MKPB(pH7.0)2ml中并于40℃進(jìn)行20分鐘，并將生成的D-α-氨基酸用HPLC進(jìn)行定量。其結(jié)果示于表3中。另外，這時(shí)的JM109pAD108的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的比活性提高了放射形土壤桿菌KNK712(FERM BP-1900)的粗酶液的10倍。
實(shí)施例7通過由轉(zhuǎn)化株得到的酶使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為D-α-氨基酸使用按實(shí)施例5得到的質(zhì)粒pPD304，使大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。按實(shí)施例6相同的方法由該株得到粗酶液。使用該粗酶液按實(shí)施例6相同的方法進(jìn)行反應(yīng)。該結(jié)果示于表3中。另外，這時(shí)的JM109pPD304的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水介酶的比活性提高假單胞桿菌(pseudomonas)sp.KNK003A(FERM BP-3181)的粗酶液的40倍。
實(shí)施例8通過由轉(zhuǎn)化株得到的酶使D-N-氨基甲酰-對(duì)羥基苯基甘氨酸轉(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯基甘氨酸-使用按實(shí)施例4得到的質(zhì)粒pAD108使大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。按實(shí)施例6的相同方法對(duì)該株進(jìn)行培養(yǎng)。由100毫升培養(yǎng)液進(jìn)行收集菌體，用0.1M KPB(pH7.0)洗凈之后再懸浮于100毫升之5%D-N-氨基甲酰-對(duì)羥基苯基甘氨酸、0.05%Triton X-100、0.1M KPB(Hp7.0)中之后，于40℃下攪拌20分鐘并進(jìn)行反應(yīng)。將這樣得到的反應(yīng)液在6000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘除去菌體，在濃鹽酸中使pH下降到2.7并使其吸附在陽離子交換樹脂IR-120B(H+型)上，再用5% NH+OH溶出。然后，用IRC-84(H+型)脫鹽，并以AF樹脂脫色。再將該脫色液濃縮結(jié)晶析出，由水進(jìn)行重結(jié)晶得到3.8克白色粉末。該結(jié)晶的比旋光度為[α]20D＝-158(C＝1，1N的HCl中)，并在TLC上給予點(diǎn)滴，其IR與標(biāo)準(zhǔn)樣D-對(duì)羥基苯基甘氨酸是一致的。
實(shí)施例9固定化D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的調(diào)制-對(duì)于按實(shí)施例6相同方法得到的大腸桿菌JM109的pAD108的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)液200毫升收集菌之后，用0.1MKPB(pH7.0)洗凈，并懸浮于20毫升的0.1M KPB(pH7.0)中，通過超聲波進(jìn)行菌體的破碎。將該菌體破碎液于12000轉(zhuǎn)/分下離心20分鐘，上清液作為粗酶液被得到。在該粗酶液中加入2克用0.1M KPB(pH7.0)平衡化了的陰離子交換樹脂Duolite A-568，并于4℃下攪拌15小時(shí)，使酶被吸附。該液中加入戊二醛使其最終濃度成為0.1%，攪拌1小時(shí)，進(jìn)行交聯(lián)處理后，過濾收集樹脂，并用0.1M的KPB洗凈，得到2克固定化D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶。
實(shí)施例10通過固定化酶使D-N-氨基甲酰-對(duì)羥基苯基甘氨酸轉(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯基甘氨酸-將按實(shí)施例9得到的固定化D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶2克加入到100毫升之2%D-N-氨基甲酰-對(duì)羥基苯基甘氨酸、0.1M kpb(pH7.0)中，一面用1N的HCl保持pH為7.0，一面于40℃下攪拌20小時(shí)并進(jìn)行反應(yīng)反應(yīng)后靜置，抽吸反應(yīng)液后，按實(shí)施例8相同的方法精制生成的氨基酸，得到1.5克D-對(duì)羥基苯基甘氨酸。
表3反應(yīng)底物 生成氨基酸 氨基酸生成量(毫摩爾/升)JM109 JM109 JM109pAD108 pPD304D-N-氨基甲酰-對(duì) D-對(duì)羥基苯基甘 9.5 0.14 0羥基苯基甘氨酸 氨酸D-N-氨基甲酰-對(duì) D-苯基甘氨酸 9.7 0.06 0羥基苯基甘氨酸D-N-氨基甲酰高苯 D-高苯基丙氨酸 3.9 0.78 0基丙氨酸D-N-氨基甲酰苯基 D-苯基丙氨酸 4.2 0.98 0丙氨酸D-N-氨基甲酰亮氨 D-亮氨酸 6.4 1.37 0酸D-N-氨基甲酰纈 D-纈氨酸 6.6 0.98 0氨酸D-N-氨基甲酰 D-丙氨酸 7.0 1.56 0丙氨酸實(shí)施例11使來自放射形土壤桿菌KNK712(FERM BP-1900)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶的遺傳因子的DNA堿基序列的剖析用限制性酶EcoRⅠ和HindⅢ(寶酒造制)將含有來自放射形土壤桿菌KNK712(FERM BP-1900)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶(以下稱酰胺水解酶)的遺傳因子的質(zhì)粒pAD108切斷，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，調(diào)制1.8kb的DNA片段。再用各種限制性酶切斷該片段，并使用T4-DNA連接酶(寶酒造制)連接在MI3mp18或M13mp19上，使之在大腸桿菌JM109中轉(zhuǎn)染并得到噬菌斑。將該單一噬菌斑接種到1.5毫升的已接種1%JM109的2YT培養(yǎng)基(16克/升細(xì)菌胰蛋白胨(Difco社)、10克/升酵母提取液(Difco社)、5克/升NaCl)上，于37℃振動(dòng)培養(yǎng)5小時(shí)。離心分離后，往上清液中加入20%的聚乙二醇6000和25M NaCl溶液200微升，于室溫下放置15分鐘后，以沉淀回收噬菌體粒子。將其溶于100微升TE溶液[10mM Tris HCl(pH8.0)、1mM EDTA]中，用50微升苯酚(用TE溶液飽和)提取后，添加10微升3M乙酸鈉溶液和250微升乙醇，于-20℃下放置一夜，并進(jìn)行離心分離。將沉淀干燥之后，溶于50微升TE溶液中。用其7微升，通過使用SEQU ENASE(注冊商標(biāo))Ver.2的DNA定序裝置(United States Biochemical Corp.制)并根據(jù)其使用說明書進(jìn)行反應(yīng)和電泳、自動(dòng)射線照相。然后從該結(jié)果確定序列表序列編號(hào)1中所示的KNK712株的酰胺水解酶遺傳因子的DNA堿基序列。
實(shí)施例12將來自假單胞桿菌sp.KNK 003A(FERM BP-3181)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶的遺傳因子的DNA堿基序列剖析用限制性酶BamHⅠ以及HindⅢ(寶酒造制)切斷含有來自KNK003A的酰胺水解酶遺傳因子的質(zhì)粒pPD304，通過瓊脂糖凝膠電泳，分離調(diào)制1.8kb的DNA片段。再用各種限制性酶切斷該片段，并用T4-DNA連接酶(寶酒造制)在M13mp18或M13mp19中進(jìn)行連接，使之在大腸桿菌JM109中轉(zhuǎn)染以得到噬菌斑。將該單一噬菌斑接種于1.5毫升的已接種1%JM109的2YT培養(yǎng)基(16克/升細(xì)菌胰蛋白胨(Difco社)、10克/升酵母提取液(Difco社)、5克/升NaCl)上，于37℃下振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。離心分離后，往上清液中添加20%聚乙二醇6000和25M NaCl溶液200微升，于室溫下放置15分鐘后，離心分離并將噬菌體粒子作為沉淀而回收。將其溶于100微升TE溶液[10mM Tris HCl(pH8.0)、1mM EDTA]中，用50微升苯酚(以TE溶液飽和)提取后，加入10微升3M乙酸鈉溶液和250微升乙醇，于-20℃下放置一夜，進(jìn)行離心分離。將沉淀干燥后，再溶解于50微升TE溶液中。用其7微升，通過使用SEQUENASE(注冊商標(biāo))ver.2的DNA定序裝置(United States Biochemical Corp.制)，遵照其使用說明書進(jìn)行反應(yīng)和電泳，自動(dòng)射線照相。然后從該結(jié)果確定序列表序列號(hào)2中所示的，來自KNK003A株的酰胺水解酶遺傳因子的DNA堿基序列。
實(shí)施例13來自放射形土壤桿菌KNK712(FERM BP-1900)的，D-N-氨基甲酰-α-酰胺水解酶的精制-將放射形KNK712(FERM BP-1900)在表4中所示的培養(yǎng)基上于33℃下培養(yǎng)25小時(shí)。
表4甘油 25克蔗糖 5克KH2PO45克Na2HPO45克MgSO4·7H2O 1克MnCl2·4H2O 10毫克酵母提出物 4克尿素 2克D-N-氨基甲酰-對(duì)- 1克羥基苯基甘氨酸加水使之成為1升。(pH6.5)集菌該培養(yǎng)液21升，通過超聲波粉碎菌體，將殘?jiān)秒x心除去后，通過硫酸魚精蛋白處理(0.1毫克/毫克蛋白)進(jìn)行除核酸。然后將離心的上層清液于50℃下進(jìn)行20分鐘的熱處理，除去沉淀之后，添加硫酸銨使蛋白沉淀，用具有活性的15%到35%飽和硫酸銨以回收沉淀的蛋白的所要部分。將該所要的部分溶解，進(jìn)行DEAE-5pw柱子(柬ソ-社制)的HPLC，通過NaCl的濃度梯度進(jìn)行溶出，回收所要的活性部分。在這個(gè)階段里與菌體粉碎液進(jìn)行比較，酰胺水解酶的比活性大約增加20倍。通過SDS-聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行分析時(shí)，該酰胺水解酶在分子量大約為35000附近泳動(dòng)。
實(shí)施例14來自放射形土壤桿菌KNK712(FERM BP-1900)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的蛋白氨基末端的氨基酸序列的確定-將按實(shí)施例13得到的放射形土壤桿菌KNK 712(FERM)BP-1900)生產(chǎn)的酰胺水解酶精制標(biāo)準(zhǔn)樣裝入逆相HPLC柱子(AP-303;YMC社制)中，通過乙腈的濃度梯度使之溶出。將含有該酰胺水解酶的所要部分裝入氣相蛋白質(zhì)定序器(ァプラィド·バィォシステ ムバ社制)，進(jìn)行剖析時(shí)表明，酰胺水解酶是在氨基末端具有序列表序列號(hào)1的氨基酸編號(hào)1到20的序列的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例15來自假單胞桿菌sp.KNK 003A(FERM BP-3181)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的精制-將假單胞桿菌sp.KNK 003A(FERM BP-3181)于表5所示的培養(yǎng)基上并在45℃下培養(yǎng)3天。
表5甘油 10克葡萄糖 5克KH2PO43.5克Na2HPO43.5克
MgSO4·7H2O 0.5克MnCl2·4H2O 20毫克FeSO410毫克CaCO31克肉提取物 2克酵母提取物 2克細(xì)菌培養(yǎng)基用胨 2克D-N-氨基甲?！け? 1克氨酸加水使之成為1升。(pH7.0)集菌該培養(yǎng)液26升，按實(shí)施例13所示的相同方法通過超聲波粉碎菌體，通過硫酸魚精蛋白處理除核酸、熱處理(65℃，20分鐘)、通過硫酸銨沉淀的部分(分離具有由于50%到70%飽和硫酸銨沉淀的酰胺水解酶活性的蛋白質(zhì)部分)進(jìn)行使用DEAE-5pw柱子的HPLC。將該活性部分吸附到生物凝膠HT(ハィォラッドラボラリト-ズ社制)柱子上，通過硫酸銨的濃度梯度使之溶出，將活性部分濃縮并通過Sephacryl s-300(ファルシァ·LKB·バィォテクノロジ-社制)柱子進(jìn)行凝膠過濾。
接著，進(jìn)行等電點(diǎn)電泳時(shí)(pH4至6.5)，該酰胺水解酶可在pH5.7附近泳動(dòng)，所以可切出表示該活性的區(qū)域部分的凝膠，再從其中提取蛋白質(zhì)。在這階段里與菌體粉碎液進(jìn)行比較，酰胺水解酶的比活性大約增加100倍。將該試樣通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析時(shí)，酰胺水解酶可在分子量大約38000附近泳動(dòng)。另外將該試樣通過Sephacryl s-200柱子進(jìn)行凝膠過濾時(shí)，于分子量大約為67000處的位置被溶出。
實(shí)施例16來自假單胞桿菌sp.KNK003A(FERM BP-3181)D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的蛋白質(zhì)氨基末端的氨基酸序列的確定-將按實(shí)施例15得到的假單胞桿菌sp.KNK003A(FERM BP-3181)的酰胺水解酶精制標(biāo)準(zhǔn)樣裝入逆相HPLC柱子中，通過乙腈的濃度梯度進(jìn)行溶出。將含有酰胺水解酶的所要部分裝入氣相蛋白質(zhì)定序器并進(jìn)行剖析時(shí)表明，酰胺水解酶是在氨基末端具有序列表序列編號(hào)2的氨基編號(hào)1到20的序列的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例17重組大腸桿菌制作的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的精制-將按實(shí)施例4得到的大腸桿菌JM109·pAD108和按實(shí)施例5得到的大腸桿菌JM109·pPD304，按實(shí)施例6中所示方法進(jìn)行培養(yǎng)。通過離心從培養(yǎng)液收集菌體，通過超聲波對(duì)菌體進(jìn)行粉碎，除殘?jiān)螅僖許DS-聚丙烯酰胺電泳對(duì)這些粗酶液進(jìn)行分析。在大腸桿菌JM109·pAD108的培養(yǎng)菌體破碎液中酰胺水解酶在分子量大約35000的位置處泳動(dòng)，而在染色后的用比重計(jì)的剖析中，完全可溶性菌體蛋白質(zhì)的大約50%為由酰胺水解酶所占有。另外，大腸桿菌JM109·pPD304培養(yǎng)菌體破碎液中酰胺水解酶在分子量約38000的位置泳動(dòng)而在染色后的以比重計(jì)的剖析中，完全可溶性菌體蛋白質(zhì)的大約15%由酰胺水解酶所占有。
實(shí)施例18重組大腸桿菌制作的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的蛋白質(zhì)氨基末端序列的確定-將按實(shí)施例17獲得的大腸桿菌JM109·pAD108的培養(yǎng)菌體破碎液于50℃下加熱處理30分鐘，通過離心除沉淀后，添加硫酸銨使之成為30%的飽和狀態(tài)，使蛋白質(zhì)沉淀。通過離心分離沉淀的蛋白質(zhì)，并溶解于脫離子水中后，用NAP-10柱子(ファルシァ·LKB·バィォテクノロジ-社制)進(jìn)行脫鹽，裝入氣相蛋白質(zhì)定序器中。該結(jié)果表明，序列表序列編號(hào)1的氨基酸編號(hào)從1到16的序列和在該序列的前面于各個(gè)氨基末端具有附加一個(gè)甲硫氨酸殘基的序列的蛋白質(zhì)均以等量混合在一起的。
如上述內(nèi)容很清楚，本發(fā)明是應(yīng)用遺傳因子重組技術(shù)，有可能從D-N-氨基甲酰-α-氨基酸類高效率地生產(chǎn)D-α-氨基酸類的發(fā)明。
附圖的簡單說明圖1表示用按本發(fā)明得到的質(zhì)粒pAHD101的限制性酶的切斷平面圖。
圖2表示用按本發(fā)明得到的質(zhì)粒pPHD301的限制性酶的切斷平面圖。
圖3表示用按本發(fā)明得到的質(zhì)粒pAD108的限制性酶的切斷平面圖。
圖4表示用按本發(fā)明得到的質(zhì)粒pPD304的限制性酶的切斷平面圖。
大腸桿菌(Esherichia coli)JM109/pAD108(FERM BP-3184)和大腸桿菌(Esherichia coli)JM109/pPD304(FERM BP-3183)已于1991年12月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)分別為CCTCC NOM91095和CCTCC NOM91096。
權(quán)利要求
1.D-α氨基酸的制備方法，其特征在于，使用含有以除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；怪D(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶有關(guān)的遺傳因子的DNA片段和載體DNA的重組體DNA，并對(duì)選自屬于埃希氏桿菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，芽孢桿菌屬，沙雷氏菌屬，棒狀菌屬，或短頸細(xì)菌屬的微生物中的宿主菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過所得到的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的該種酶的作用，使D-N-氨基甲酰-α-氨基酸在水性介質(zhì)中轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸，然后采集生成的D-α-氨基酸。
2.權(quán)利要求1記載的制備方法，D-N-氨基甲酰-α-氨基酸是一種用通式(式中R表示苯基、用羥基取代的苯基、烷基、取代烷基、芳烷基或噻嗯基)表示的化合物。
3.權(quán)利要求1或2記載的制備方法，是使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的酶，作為該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液、菌體、菌體處理物，從菌體提取的提取物、固定化菌體或固定化酶而起作用的。
4.權(quán)利要求1～3記載的制備方法，含該遺傳因子的DNA片段是來自真核生物、原核生物、病毒、噬菌體或質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求4記載的制備方法，該原核生物是細(xì)菌。
6.權(quán)利要求5記載的制備方法，該細(xì)菌是選自屬于假單胞菌屬，土壤桿菌屬，氣桿菌屬，氣單胞菌屬，短頸細(xì)菌屬，芽孢桿菌屬，黃桿菌屬，沙雷氏菌屬，或藤黃水。菌屬的微生物中的細(xì)菌。
7.權(quán)利要求6記載的制備方法，該細(xì)菌是假單胞細(xì)菌sp.KNK003A(FERM BP-3181)或假單胞細(xì)菌sp.KNK505(FERM BP-3182)。
8.權(quán)利要求6記載的制備方法，該細(xì)菌是放射形土壤細(xì)菌KNK712(FERM BP-1900)。
9.含有作用于D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，并使之轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶有關(guān)的遺傳因子的DNA片段和載體DNA之重組體的微生物。
10.權(quán)利要求9記載的微生物，含該重組體的微生物是選自屬于埃希氏桿菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，芽孢桿菌屬，沙雷氏菌屬，棒狀菌屬，或短頸細(xì)菌屬的微生物。
11.權(quán)利要求10記載的微生物，該微生物是大腸桿菌JM109pAHD101，大腸桿菌 JM109 PAD 108(CCTCC NOM91095)、大腸桿菌 JM109pPHD301或大腸 桿菌JM109pPD304(CCTCC NOM91096)。
12.D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的制備方法，其特征在于，使用含有除去D-N-氨基酸甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基使之轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶有關(guān)的遺傳因子的DNA片段和載體DNA的重組體DNA，并使用使之從屬于埃希氏桿菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，芽孢菌屬，沙雷氏菌屬，棒狀菌屬，或短頸細(xì)菌屬的微生物中選擇的宿主菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體。
13.權(quán)利要求12記載的制備方法，D-N-氨基甲酰-α-氨基酸是用通式(R是苯基、用羥基取代的苯基、烷基、取代烷基、芳烷基或噻嗯基)表示的化合物。
14.含有有關(guān)來自假單胞細(xì)菌sp.KNK 003A(FERM BP-3181)或放射形土壤細(xì)菌KNK 712(FERM BP-1900)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸酰胺水解酶的遺傳因子，并通過具有圖1～圖4的限制性酶切斷平面圖的DNA片段和質(zhì)粒pUC18或pUC19的重組而得到的重組質(zhì)粒。
15.將除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⑥D(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶，載持在載持該酶的固定載體上的固定化酶。
16.一種顯示除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基并轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶活性的蛋白質(zhì)的遺傳因子，所說的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸是對(duì)序列表序列編號(hào)1的氨基酸序列的氨基酸編號(hào)1～303的氨基酸序列的全部或一部分進(jìn)行編碼的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸。
17.一種DNA片段，以在權(quán)利要求16記載的DNA片段的5′末端的前面，序列表序列編號(hào)1的堿基編號(hào)167～232的堿基序列或與其等價(jià)的堿基序列相結(jié)合的。
18.一種DNA片段，含有具有序列表序列編號(hào)1的堿基編號(hào)1～1785的堿基序列的全部或一部分，或者與其等價(jià)的堿基序列，并顯示除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基并轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶的活性的蛋白質(zhì)的遺傳因子。
19.權(quán)利要求18的DNA片段，它含有對(duì)序列表序列編號(hào)1的氨基酸編號(hào)1～20氨基酸序列進(jìn)行編碼的DNA片段。
20.一種蛋白質(zhì)的遺傳因子，它顯示出除去編碼序列表序列編號(hào)2的氨基酸序列的氨基酸編號(hào)1～311的氨基酸序列的全部或一部分的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⑥D(zhuǎn)化成D-α-氨基酸的酶活性。
21.一種DNA片段，具有序列表序列編號(hào)2的堿基編號(hào)1～1820的堿基序列，或者，與其等價(jià)的堿基序列，并含有顯示除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⑥D(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶活性的蛋白質(zhì)的遺傳因子。
22.權(quán)利要求21的DNA片段，含有對(duì)序列表序列編號(hào)2的氨基酸編號(hào)1～20的氨基酸序列進(jìn)行編碼的DNA片段。
23.一種蛋白質(zhì)，具有示于序列表序列編號(hào)1的氨基酸編號(hào)1～303的氨基酸序列的全部或一部分，并顯示除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⑥D(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶活性。
24.權(quán)利要求23記載的蛋白質(zhì)，含有序列表序列編號(hào)1的氨基酸編號(hào)1～20的氨基酸序列。
25.一種蛋白質(zhì)，具有序列表序列編號(hào)2中所示的氨基酸編號(hào)1～311的氨基酸序列的全部或一部分，并顯示除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲?；⑥D(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶活性。
26.權(quán)利要求25記載的蛋白質(zhì)，含有序列表序列編號(hào)2的氨基酸編號(hào)1～20的氨基酸序列。
全文摘要
D-α-氨基酸的制備方法，其特征在于用含有有關(guān)除去D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的氨基甲酰基并轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶的遺傳因子的DNA片段和載體DNA的重組體DNA，通過使之選自屬于埃氏桿菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，芽孢桿菌屬，沙雷氏菌屬，棒狀菌屬，或短頸細(xì)菌屬的微生物的宿主菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的有關(guān)酶的作用，在水性介質(zhì)中使D-N-氨基甲酰-α氨基酸轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸，并采集生成的D-α-氨基酸。
文檔編號(hào)C12P41/00GK1063310SQ9111279
公開日1992年8月5日 申請(qǐng)日期1991年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1990年12月7日
發(fā)明者難波弘憲, 山田勇喜雄, 高野昌行, 池中康裕, 高橋里美, 矢島麗嘉 申請(qǐng)人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社