專利名稱：：用蛋白質(zhì)膠涂層軟片鑒定篩選定量定位蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用明膠之類蛋白質(zhì)膠涂層軟片作底物的鑒定、篩選、定量、定位蛋白酶的方法。生物，尤其是微生物和植物蛋白酶往往具有資源豐富，價(jià)格低廉的特點(diǎn)，因而易被大量開發(fā)。如市場(chǎng)上銷售的糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶，無(wú)花果蛋白酶等，就是典型例子。自然界生物種類繁多。不同的生物內(nèi)所含的蛋白酶常常因具有不同的切點(diǎn)和不同的最適反應(yīng)條件等性質(zhì)而可得以有不同的應(yīng)用。而篩選開發(fā)這些不同性質(zhì)甚至性質(zhì)特異的新蛋白酶種，就具有重大意義了。以往尋找有開發(fā)利用價(jià)值的新酶種，主要是采用酪蛋白法，DHT酪蛋白法這類人工底物來(lái)測(cè)定蛋白酶活性。在采用酪蛋白法時(shí)，需要昂貴的設(shè)備，而采用合成底物的成本也很高。如DHT酪蛋白每克需10元人民幣，BAEE、BTEE等小肽甚至每克達(dá)到上百美元。單做一次測(cè)定，試劑成本就需高達(dá)數(shù)十、乃至數(shù)百元人民幣。同時(shí)，由于生物多數(shù)都含有色素，比如葉綠素、花青素、胡蘿卜素、血紅素等，它們的存在強(qiáng)烈地影響了常規(guī)的酪蛋白法測(cè)定時(shí)的紫外比色。顯然，蛋白酶篩選這種大規(guī)模的測(cè)試工作，由于需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，昂貴的試劑成本而難以在野外進(jìn)行。本發(fā)明的目的在于尋找一種方法簡(jiǎn)單，成本低廉，易于操作的篩選、定量和定位蛋白酶的新方法。這種方法可通過(guò)軟片底物與被測(cè)定的微生物勻漿或動(dòng)植物組織反應(yīng)后軟片是否出現(xiàn)蛋白酶水解斑及水解斑的透明度和大小形狀而直接、直觀地鑒定該被測(cè)物是否含酶，含酶部位及含酶量的多少，而且適于野外操作。本發(fā)明是采用附有明膠之類蛋白質(zhì)膠及銀粒子或碳黑之類有色物質(zhì)層做藥膜的透明基質(zhì)軟片做底物;也可以用X光軟片，照相或電影膠卷作暴光、顯影、定影處理制成片基完整的全黑軟片;或直接選擇片基完整的全黑軟片。規(guī)格大小視需要而定。測(cè)試前，軟片先放入清水浸泡5-60分鐘，待其浸潤(rùn)后撈起備用。測(cè)試時(shí)，由于軟片的底膜為明膠涂層，這是一層蛋白質(zhì)干膠，在它濕潤(rùn)后于一定溫度時(shí)，可被蛋白酶水解脫落。這一脫落過(guò)程會(huì)連帶它表面經(jīng)處理成黑色的不溶銀或碳黑之類物質(zhì)涂層脫去而使軟片露出透明空斑。本發(fā)明將待鑒定的微生物勻漿或動(dòng)植物新鮮健康清潔的組織采下壓榨出汁，或?qū)⒔M織用利刀切片。測(cè)試時(shí)，將微生物勻漿或榨出的組織汁液10微升以上直接從固定點(diǎn)滴到平放的軟片涂有明膠層的藥膜面上，汁液量以不出片外為準(zhǔn)。為了減少揮發(fā)，滴后可以用培養(yǎng)皿將軟片反扣罩住。在10-40℃室溫下反應(yīng)20分鐘至24小時(shí)后，用清水沖洗，即可觀察軟片上酶水解明膠底膜的透明蝕出斑情況。如是直接切片測(cè)定，則將動(dòng)植物器官組織切片的截面緊貼到軟片的藥膜面上，用夾子緊固后，小心揩去組織與軟片交接處可能浸出的液珠，裝入塑料袋中，在10-40℃室溫下反應(yīng)1-10小時(shí)后從袋中取出，移走測(cè)試組織，用清水沖洗軟片，觀察水解蝕出斑出現(xiàn)的情況。采用本發(fā)明方法測(cè)試后，根據(jù)軟片蝕斑是否出現(xiàn)即可判斷該微生物勻漿或動(dòng)植物組織是否含酶。當(dāng)所測(cè)試的生物不含酶時(shí)，軟片不出現(xiàn)蝕斑;含酶時(shí)，軟片上蝕出斑的透明度大小與含酶量有正比例關(guān)系。含酶量低的生物，測(cè)試后軟片出現(xiàn)透明度較低的甚至輕微的點(diǎn)狀空斑，酶量高的生物，測(cè)試后軟片出現(xiàn)全透明蝕斑。表1是木瓜蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，糜蛋白酶的不同活性滴后與軟片被蝕空斑透光率關(guān)系。表1接表1<tablesid="table1"num="001"><tablealign="center">木瓜蛋白酶0234.51597100枯草桿菌蛋白酶0024109398糜蛋白酶048153098100</table></tables>圖1、2、3分別是木瓜蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，糜蛋白酶分別用PH7.0，0.05mol/L磷酸緩沖液配成每毫升0、50、100、150、200、300、400單位酶液，各取100微升從固定點(diǎn)滴到平放的軟片藥膜面上于30℃反應(yīng)30分鐘后，蛋白酶量與軟片的水解蝕空斑標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系圖。新測(cè)試樣品只要采用對(duì)應(yīng)的軟片測(cè)試后出現(xiàn)的蝕空斑與圖1、2、3的標(biāo)準(zhǔn)軟片蝕斑圖及表1的表格數(shù)值比較，即可直觀地看出新測(cè)樣品酶活性。若測(cè)試的生物含酶量過(guò)高時(shí)，還可將其汁液作適當(dāng)稀釋后作用于軟片，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比較而知相對(duì)活性。每批軟片只要作一次標(biāo)準(zhǔn)圖表，即可反復(fù)作對(duì)照。若有足夠多的同批電影廢片，數(shù)萬(wàn)次地做野外測(cè)定篩選都不成問(wèn)題。由于本發(fā)明采用的方法有相當(dāng)?shù)撵`敏度，若將新鮮含酶動(dòng)植物組織切片緊貼在軟片藥膜面上過(guò)一段時(shí)間后，取下試樣，在軟片上的植物組織含酶處的對(duì)應(yīng)部位即可出現(xiàn)直觀的蝕出斑，尚可給植物組織含酶位置做定位研究。本發(fā)明由于直接將微生物勻漿或動(dòng)植物組織汁液和切片與涂有藥膜的透明膠片反應(yīng)后，根據(jù)膠片上蝕出斑出現(xiàn)與否及透明度大小判斷該測(cè)試物是否含酶、含酶量和動(dòng)植物組織含酶部位，因此具有方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，成本低廉，適于野外大規(guī)模的測(cè)試工作等特點(diǎn)。實(shí)施例1用X光軟片作暴光、顯影、定影處理制成片基完整的全黑軟片，放入清水中浸泡60分鐘后撈起，剪成4×2cm小片。將棕櫚科桃榔植物果實(shí)用壓榨機(jī)壓出汁液，取汁液200微升從固定點(diǎn)滴到經(jīng)以上處理的X光軟片涂有明膠藥膜的一面上，隨即用培養(yǎng)皿反扣罩住。在30℃室溫下反應(yīng)30分鐘后，取出X光軟片用清水沖洗，滴有汁液的X光軟片部位即現(xiàn)出被酶水解明膠后的全透明蝕出斑。實(shí)施例2用電影膠卷作暴光、顯影、定影處理制成片基完整的全黑底片，放入清水中浸泡30分鐘后撈起，剪成長(zhǎng)4cm小片。用葡萄科的四棱白粉藤肉質(zhì)莖，棕櫚科的桄榔果肉、皇后葵果肉，菠蘿科的草菠蘿果肉，番木瓜科的番木瓜果實(shí)，?？频挠∧釤o(wú)花果果實(shí)、牛奶果綠色果肉嫩枝，龍舌蘭科的羊角莖，金邊龍血樹葉綠色柵狀組織，百合科的鳳尾蘭葉綠色柵狀組織。上述植物組織分別用切片刀切成厚度為約1cm的小片，隨即將切面緊貼于經(jīng)處理的感光軟片涂有明膠藥膜的一面上，用木夾子將其固定。小心揩去植物組織與軟片交接處可能浸出的液珠后放入塑料袋中。在30℃室溫下反應(yīng)3小時(shí)后，移走植物組織，用清水沖洗軟片，即可在軟片上直觀地看到酶水解明膠后出現(xiàn)的蝕空斑情況。各種測(cè)試植物蝕出斑形狀及相應(yīng)植物組織用酪蛋白法對(duì)比測(cè)定蛋白酶活性結(jié)果見表2。接表2實(shí)施例3用透明膠片先后涂上明膠層及碳黑粉，制成明膠涂層軟片，剪成長(zhǎng)4cm小片。用劍麻葉片，苦楝樹的莖桿切片后緊貼于明膠軟片藥膜面上，用夾子固定，使之不松動(dòng)，不移位，并小心揩去植物組織與軟片交接處可能浸出的液珠，反應(yīng)5小時(shí)，移走測(cè)試組織，即可在軟片上非常直觀地看到劍麻葉表的綠色柵狀組織，苦楝樹的樹皮內(nèi)皮層的對(duì)應(yīng)位置都有被蝕出的透明空斑<見圖4、5>。權(quán)利要求1.一種測(cè)試生物是否含蛋白酶的方法，其特征是用透明膠片上附有明膠之類蛋白質(zhì)膠及銀粒子或碳黑之類有色物質(zhì)涂層的軟片做底物，將待測(cè)生物勻漿、動(dòng)植物組織汁液或切片直接滴到或緊貼到軟片涂有明膠層的藥膜面上，反應(yīng)一定時(shí)間后，用清水沖洗軟片，即可根據(jù)軟片被水解后蝕空斑出現(xiàn)與否及空斑透明度的大小判斷測(cè)試物是否含酶及含酶量多少，尤其用組織切片緊貼軟片上便可定位植物或動(dòng)物組織中酶所在的特殊位置。2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于軟片可以用X光軟片、照相或電影膠卷作暴光、顯影、定影處理制成片基完整的全黑軟片，或直接選擇片基完整的全黑廢感光軟片。3.按權(quán)利要求1、2所述的方法，其特征在于測(cè)試時(shí)軟片規(guī)格大小不受限制。4.按權(quán)利要求1、2、3所述的方法，其特征在于測(cè)試時(shí)所用組織或汁液量不受限制，以不出片外為準(zhǔn)。5.按權(quán)利要求1、2、3、4所述的方法，其特征在于測(cè)試是在10-40℃室溫下反應(yīng)1-24小時(shí)。6.按權(quán)利要求1、2、3、4、5所述的方法，其特征在于測(cè)試后軟片上蝕出斑的透明程度及大小形狀與所測(cè)試的生物含酶量呈正比例關(guān)系，含酶量低時(shí)，軟片出現(xiàn)透明度較低的甚至輕微的點(diǎn)狀空斑，含酶量高時(shí)，出現(xiàn)全透明蝕出斑。7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于當(dāng)用已知活性的酶液配成一定的低濃度的系列作用于軟片，可得到一組軟片酶蝕出的標(biāo)準(zhǔn)圖，用其與未知酶量的試樣測(cè)試后軟片蝕出斑比較，可看出后者的活性。全文摘要本發(fā)明涉及一種用蛋白質(zhì)膠涂層的軟片作底物鑒定、篩選、定量蛋白酶，特別是定位動(dòng)植物蛋白酶的方法。采用透明膠片上附有明膠之類蛋白質(zhì)膠及黑色銀粒子層等的軟片做底物，將待測(cè)試的新鮮組織采下壓榨出汁或切片，把汁液滴到或切片緊貼到軟片的藥膜面上，一定時(shí)間后用清水沖洗，即可看到軟片涂層被蛋白酶水解后出現(xiàn)的蝕空斑。根據(jù)蝕空斑是否出現(xiàn)及空斑的透明度大小即可判斷或定位該測(cè)試組織是否含酶及含酶量的多少。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)單，成本低廉，適于野外操作等特點(diǎn)。文檔編號(hào)C12Q1/37GK1065095SQ9210177公開日1992年10月7日申請(qǐng)日期1992年3月14日優(yōu)先權(quán)日1992年3月14日發(fā)明者葉啟騰,陳強(qiáng),李春香申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所