專(zhuān)利名稱(chēng)：酯酰還原酶的制作方法
本申請(qǐng)是USSN 07/796，256(1991年11月20日申請(qǐng))和USSN 07/767，251(1991年9月27日申請(qǐng))的部分后續(xù)申請(qǐng)，而上述后一申請(qǐng)又是USSN 07/659，975(1991年2月22日)的部分后續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及植物酶，純化及獲得這些酶和與其相關(guān)的氨基酸和核酸序列的方法，以及使用這些組合物的方法。
脂肪酸是具有約4-24個(gè)碳原子的碳烴鏈的有機(jī)酸。已知許多不同種類(lèi)的脂肪酸其鏈的長(zhǎng)度以及是否存在雙鍵，其數(shù)量和位置不同。在細(xì)胞中，脂肪酸通常以共價(jià)鍵形式存在，羧基部分被稱(chēng)作脂?；?。這些分子的鏈長(zhǎng)度與飽和度經(jīng)常以通式CX∶Y表示，其中X是指碳原子，Y是指雙鍵數(shù)。由于脂酰分子的碳鏈總是含有偶數(shù)碳原子，所以也可以用通式“C2X”表示碳鏈長(zhǎng)度。
脂?；呛芏嘀闹饕煞?，其長(zhǎng)的、非極性烴鏈造成了這些脂分子的水不溶性。脂?；c其他因子共價(jià)鍵合的類(lèi)型是可以變化的。例如，在生物合成反應(yīng)中它們可以通過(guò)硫酯鍵，按照特定的酶促反應(yīng)與?；d體蛋白(ACP)或者與輔酶A(CoA)共價(jià)鍵合。在蠟中，脂?；ㄟ^(guò)酯鍵與脂肪醇連接，而三酰基甘油具有三個(gè)脂?；鼈兺ㄟ^(guò)酯鍵與甘油分子連接。
我們已經(jīng)對(duì)很多能貯存脂例如主要由長(zhǎng)鏈(具有16或18個(gè)碳)脂?；鶚?gòu)成的三?；视偷闹参镞M(jìn)行了研究。特定長(zhǎng)鏈的(具有20-24個(gè)碳)單不飽和脂?；峭ㄟ^(guò)?；o酶A的延長(zhǎng)作用從C18∶1形成的，并且在很多植物種子，特別是十字花科成員中發(fā)現(xiàn)了它們。沙漠灌木，Simmondsia chinensis，更好稱(chēng)為希蒙德木，是較高級(jí)植物(產(chǎn)生種子的植物)中唯一能夠產(chǎn)生并貯存大量液體蠟的，這些液體蠟是其種子貯存脂的主要成分。這些簡(jiǎn)單的蠟化合物是特殊長(zhǎng)鏈單烯脂?；c醇的氧酯。
其他類(lèi)型的蠟可以由某些種的植物形成。植物合成的表皮或上皮蠟，以及由細(xì)菌例如不動(dòng)細(xì)胞屬(Fixter et al.(1986)J.Gen.Microbiol.132∶3147-3157)和微球菌屬(Lloyd(1987)Microbios 52∶29-37)，以及由單細(xì)胞綠藻，眼蟲(chóng)屬合成的蠟是眾所周知的。但是，這些蠟的組成及生物合成途徑不同于希蒙德木種子蠟。
例如在眼蟲(chóng)屬貯存蠟的形成中，已經(jīng)證實(shí)醇部分是由脂酰輔酶A還原酶催化脂酰化合物的依賴于NADH的還原反應(yīng)形成的。在希蒙德木種子中，該反應(yīng)是依賴于NADH的?？梢约俣ㄌ厥忾L(zhǎng)鏈的脂酰輔酶A還原成相應(yīng)的醇依賴于一種單一的酶，其活性已經(jīng)在發(fā)育中的希蒙德木種子的粗提取物中發(fā)現(xiàn)(Pollard等人(1979)Lipids 14∶651-662;Wu等人(1981)Lipids 16∶897-902)。通過(guò)對(duì)植物上皮蠟的形成進(jìn)行比較，還報(bào)道了一種兩步法(Kolattukudy(1980)，The Biochemistry of plants(Stumpf，P.K.和Conn，E.E.eds)第4卷第571-645頁(yè))。通過(guò)NADH依賴性還原酶作用，脂酰輔酶A轉(zhuǎn)化成為游離的醛，隨后通過(guò)NADPH依賴性脂肪醛還原酶作用形成醇。
由于缺乏識(shí)別與酶活性有關(guān)的多肽的方案，因而阻礙了對(duì)形成植物中蠟酯的酶的進(jìn)一步表征。因此需要進(jìn)一步研究植物脂酰還原酶蛋白以設(shè)計(jì)一種純化方案，從而可以識(shí)別還原酶多肽。通過(guò)建立這些方法，可以得到足量的植物脂酰還原酶蛋白，并可以測(cè)定該蛋白質(zhì)的氨基酸序列和/或可以得到脂酰還原酶的特異性抗體。所得到的氨基酸序列可以用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)或用于篩選cDNA或基因庫(kù)?；蛘?，抗體可用于篩選表達(dá)基因庫(kù)以識(shí)別表達(dá)脂酰還原酶蛋白的克隆?？梢詫?duì)以此方式獲得的克隆進(jìn)行分析以識(shí)別出與植物脂酰還原酶相對(duì)應(yīng)的核酸序列。
已有報(bào)道，發(fā)育中的希蒙德木胚胎的無(wú)細(xì)胞勻漿具有NADPH依賴性脂酰輔酶A還原酶活性。其活性物結(jié)合到差速離心所形成的浮動(dòng)的蠟墊中(Pollard等人(1979)上文;Wu等人(1981)上文)。
Karplus等人描述了在已知的結(jié)合了二核苷酸的幾倍數(shù)種還原酶蛋白中保存的功能性殘基(Science(1991)251∶60-66)。
Wildner和Hallick報(bào)道了Euglena gracilis中具有脂酰輔酶A還原酶活性的多酶復(fù)合物的增溶作用(摘自The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting.April 22-24，1990，Las Cruces，NM)。
Pushnik等人報(bào)道了純化3000倍的希蒙德木還原酶蛋白(摘自The Southwest Consortium Fourth Annual Meeting，1989年2月7日，Riverside，Ca.)。


圖1提供了希蒙德木脂酰還原酶的核酸序列和轉(zhuǎn)譯的氨基酸序列。
通過(guò)本發(fā)明，提供了部分純化的脂酰還原酶蛋白，其中所述蛋白在從脂酰底物形成脂肪醇中是有活性的。本發(fā)明的還原酶對(duì)于各種脂酰底物包括?；o酶A和?；?ACPs是有活性的。盡管所給出的還原酶優(yōu)選作用特定鏈長(zhǎng)度的酰基底物或者它可以對(duì)具有很寬范圍碳鏈長(zhǎng)度的?；孜锞哂谢钚?，這些底物的碳鏈長(zhǎng)度仍是可以改變的。
盡管可以對(duì)其他?；孜镞M(jìn)行實(shí)驗(yàn)并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)活性，但是通常本發(fā)明還原酶至少對(duì)具有16-24碳鏈長(zhǎng)度的那些?；孜锞哂谢钚裕撎兼滈L(zhǎng)度可以用通式“C2X”表示，其中，“X”是8-12的數(shù)。另外，由于獲得了本發(fā)明的還原酶蛋白，可以使用如下文中進(jìn)一步詳述的其它的操作方法。利用這些操作可以產(chǎn)生或發(fā)現(xiàn)其他有關(guān)的還原酶。
因此，第一方面，本發(fā)明涉及證明脂酰還原酶酶促活性的蛋白質(zhì)制劑，并且以種子植物的蛋白質(zhì)制劑舉例說(shuō)明。通過(guò)分離希蒙德木胚芽以產(chǎn)生微粒體膜制劑、使該膜制劑中的還原酶蛋白質(zhì)溶解并通過(guò)色譜法進(jìn)一步純化得到上述制劑。盡管希蒙德木還原酶對(duì)其他酰基底物也具有活性，但是優(yōu)先作用于特定長(zhǎng)鏈的酰基輔酶A底物，并且已證實(shí)它是NADPH依賴性的。
通過(guò)這些方法，得到含有兩種重要多肽的部分純化的還原酶制劑，這兩種多肽在聚丙烯酰胺凝膠上遷移成雙帶，其表觀分子量約為54和52KD。因此提供了通過(guò)從種子植物源純化獲得?；€原酶蛋白的方法，以及獲得這些還原酶蛋白的氨基酸序列的方法。
本發(fā)明的另一方面是考慮與本發(fā)明還原酶有關(guān)的核酸序列。我們將描述這些方法，以識(shí)別這些序列，并從本發(fā)明還原酶蛋白的氨基酸序列得到這些核酸序列。本文描述了使用該結(jié)構(gòu)基因序列分離其他還原酶序列，以及構(gòu)建于重 組構(gòu)件中以在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄還原酶核酸序列和/或表達(dá)還原酶蛋白。本發(fā)明還考慮了使用其它與還原酶蛋白有關(guān)的核酸序列，例如使用5′和3′非編碼區(qū)。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是考慮含有本發(fā)明重組構(gòu)件的細(xì)胞。尤其是考慮那些含有優(yōu)選的希蒙德木還原酶底物的細(xì)胞，例如在蕓苔屬植物胚胎中的細(xì)胞。
另外，本發(fā)明考慮了由本發(fā)明重組構(gòu)件表達(dá)的含有本發(fā)明還原酶蛋白的細(xì)胞。因此，本發(fā)明中也考慮了在宿主細(xì)胞中表達(dá)這種蛋白，回收而得到的還原酶蛋白。進(jìn)一步可以認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的還原酶可用于在這些宿主細(xì)胞中生產(chǎn)脂肪醇。
本發(fā)明的脂酰還原酶包括任何能催化脂酰基還原成相應(yīng)的醇的氨基酸序列，例如蛋白質(zhì)，多肽或肽片段。脂酰基是指任何與載體例如ACP或輔酶A共價(jià)結(jié)合的脂?；?。
由于該酶促反應(yīng)包括可通過(guò)兩步進(jìn)行的4個(gè)電子還原過(guò)程，所以脂?；€原成醇可以需要或不需要其他的酶。第一步可以將?；D(zhuǎn)化成醛，然后將醛還原成相應(yīng)的醇。因此，本發(fā)明的還原酶可以在從脂?；链嫉恼麄€(gè)4電子還原中具有活性，或者可以催化還原反應(yīng)形成醛，然后由第二種酶將醛進(jìn)一步還原成為醇。所得到的證據(jù)進(jìn)一步表明，由單一的酶進(jìn)行了?；o酶A至醇的整個(gè)還原過(guò)程。本發(fā)明的脂酰還原酶在下文中又稱(chēng)作“?；€原酶”或“還原酶”。
因此，本發(fā)明涉及能使脂?；D(zhuǎn)化成為醇的種子植物脂酰還原酶。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及NADPH依賴性還原酶。另外，值得注意的是，本發(fā)明的植物脂酰還原酶對(duì)脂酰輔酶A或脂酰-ACP兩種分子都具有活性，并且發(fā)現(xiàn)其活性依賴于所用的底物。但是，我們希望對(duì)于脂肪酸合成酶(FAS)?；o酶A延長(zhǎng)途徑的操作，該活性對(duì)特殊長(zhǎng)鏈?；o酶A底物是優(yōu)先的。
通過(guò)本發(fā)明測(cè)定了種子植物脂酰還原酶蛋白是完整的膜蛋白。通常與膜有關(guān)的蛋白是難于純化的，因?yàn)閷⑺鼈內(nèi)芙鈺r(shí)即從其具有正常功能的膜環(huán)境中分離時(shí)，它們會(huì)失去酶促活性。但是，所獲得的仍然保留其酶促活性的種子植物脂酰還原酶可以進(jìn)行各種應(yīng)用，而使用膜結(jié)合蛋白不可能具有這些用途。
例如，一旦獲得純化的或部分純化的?；€原酶蛋白，可以將其固定，并且在還原的吡啶核苷酸再生體系存在下用于反應(yīng)器系統(tǒng)以制備脂肪醇。進(jìn)一步說(shuō)，對(duì)還原酶蛋白的研究導(dǎo)致對(duì)進(jìn)一步特征的位點(diǎn)特異性誘變研究，以改善其催化性質(zhì)或改變其?；孜锾禺愋?。我們發(fā)現(xiàn)具有改變了底物特異性的還原酶可以與其他FAS酶結(jié)合使用。例如，優(yōu)選的中等鏈長(zhǎng)(C12-C14)的硫酯酶(見(jiàn)共同申請(qǐng)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)07/662，007)和合適的?；D(zhuǎn)移酶可以與改變的還原酶結(jié)合使用，以產(chǎn)生中等鏈醇，然后將其酯化成脂肪酸以產(chǎn)生酯。
當(dāng)使用膜結(jié)合蛋白時(shí)需要考慮的一個(gè)重要因素是蛋白與膜結(jié)合的程度。外周及完整膜蛋白都是已知的。外周蛋白在自然狀態(tài)下是典型的微親水性，它們與膜只是松散地結(jié)合，并且容易被溶解。完整蛋白則與此相反，它們具有包埋在脂膜中的高度疏水區(qū)，并且如果要保留其酶促活性，通常需要將它們與脂結(jié)合。
已經(jīng)用于溶解完整膜蛋白的技術(shù)包括將去污劑或有機(jī)溶劑加入到一種合適的膜成分制劑中。然后可以使用常規(guī)的純化技術(shù)，例如沉淀、離子交換、凝膠過(guò)濾和親合層析，假定所需蛋白仍然保留了功能活性，該活性可以用特定的酶促分析法測(cè)定。
為了獲得溶解的蛋白制劑，通常第一步需要具有脂酰還原酶活性的種子植物組織的微粒體膜制劑。標(biāo)準(zhǔn)的微粒體膜制劑利用無(wú)細(xì)胞勻漿(CFH)的差速離心得到不含完整細(xì)胞、胞核及可溶性蛋白的膜成分。(參見(jiàn)例如Moore等人，(1987)Biological Membranes∶A Practical Approach，第37-72頁(yè)，eds.Finalay and Evans.)對(duì)于油籽，開(kāi)始的離心步驟通常產(chǎn)生團(tuán)塊，上清液和浮動(dòng)的脂墊，然后通過(guò)對(duì)上清液進(jìn)一步離心可以回收微粒體部分。
在共同申請(qǐng)的USSN 07/659，975(1991年2月22日申請(qǐng))中描述了一種方案，通過(guò)該方案獲得了含有活性脂酰還原酶蛋白的膜成分，與CFH中成分相比，該膜成分具有良好復(fù)原的還原酶活性。在此方法中關(guān)鍵的步驟是除去希蒙德木胚芽上的種子表皮，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)該表皮中含有干擾酶學(xué)測(cè)量的因子。該方法在開(kāi)始的部分方案中使用了高鹽溶液，下面還將描述該步驟，并且在下面的實(shí)施例中將進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
制備希蒙德木胚芽樣品粉末，將粉末在高鹽(3M NaCl)蔗糖(0.3M)溶液中、以80ml溶液/20gm胚芽的比率進(jìn)行均化，制備勻漿。然后將勻漿過(guò)濾并以100，000Xg的速度離心約1小時(shí)，得到團(tuán)塊、上清液和浮動(dòng)的脂墊。除去脂墊，收集上清液，并在含有100mM HEPES(pH7.5)、2mM DTT和0.5mM EDTA的1M NaCl溶液中透析。然后將透析液以100，000Xg的速度，優(yōu)選以200，000Xg的速度離心約1小時(shí)，得到團(tuán)塊DP2，其中含有具有脂酰輔酶A還原酶活性的微粒體膜。
通過(guò)設(shè)計(jì)一種脂酰還原酶的最佳特定分析方法，可以有利于發(fā)現(xiàn)微粒體膜制劑中和進(jìn)一步純化過(guò)程中脂酰還原酶活性的進(jìn)一步特征。例如，對(duì)于希蒙德木使用這樣一種分析法，該方法利用特定長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A分子作底物，在高鹽(0.2M至0.5M NaCl)條件下進(jìn)行。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高鹽能顯著增加脂酰輔酶A還原酶的可測(cè)活性。該分析方法將在實(shí)施例中進(jìn)行詳細(xì)描述。
酶的其他特征及純化所需的另一重要步驟是獲得溶解的還原酶蛋白，該蛋白是從其天然脂雙層膜環(huán)境中分離出來(lái)，但是保留了足夠量的可測(cè)還原酶酶促活性。通常使用兩親洗滌劑的水溶液將完整膜蛋白從脂雙層中除去，盡管在某些情況下也使用有機(jī)溶劑。市售的洗滌劑有很多不同的種類(lèi)，包括離子型的和非離子型的，它們的離解效應(yīng)，臨界膠束濃度(CMC)，對(duì)酶促活性和進(jìn)一步純化的影響以及從溶液中除去的難易程度不同。對(duì)于本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)，許多不同的洗滌劑和膜蛋白溶解方法是已知的，這些方法已經(jīng)由Neugebauer(Methods Enzymol.(1990)182∶239-253)和Hjelmiland(Methods Enzymol.(1990)182∶253-264)綜述。
經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，用于使膜蛋白增溶的洗滌劑會(huì)抑制所需蛋白的酶促活性。用代表很寬范圍特征的幾種洗滌劑測(cè)試其對(duì)希蒙德木脂酰還原酶的溶解性，發(fā)現(xiàn)所有洗滌劑都具有抑制作用。但是，由于還原酶活性的表觀洗滌劑抑制作用可以歸因于除不可逆性酶抑制作用外的某些效應(yīng)，所以對(duì)CHAPS引起的可逆性抑制作用進(jìn)行測(cè)定。
盡管洗滌劑CHAPS(3-[(3-乙醇酰氨基丙基)-二甲基-氨]-1-丙磺酸)在高于CMC的濃度時(shí)具有很強(qiáng)的抑制作用，我們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)，如果將酶暴露于冰上的CHAPS中，然后恢復(fù)至CMC值或低于CMC值的CHAPS濃度，那么還原酶活性可以完全恢復(fù)。因此，還原酶不是被洗滌劑CHAPS不可逆地抑制。已經(jīng)設(shè)計(jì)出利用洗滌劑CHAPS使希蒙德木脂酰還原酶活性溶解的方案，通過(guò)該方法從微粒體膜制劑中產(chǎn)生約85%的還原酶活性。在實(shí)施例2中將詳細(xì)討論該方法。同樣可以對(duì)其他洗滌劑引起的可逆性表觀還原酶抑制作用進(jìn)行研究，以識(shí)別能夠使希蒙德木或其他候選還原酶的脂酰還原酶活性溶解的其他有用的洗滌劑。
由于獲得了溶解的脂酰還原酶蛋白，因此，目前可以對(duì)酶的對(duì)底物特異性，對(duì)輔助因子的要求以及可能的活性抑制劑這些特性進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。例如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的希蒙德木脂酰還原酶具有很寬范圍的底物，包括ACP和輔酶A底物。例如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)具有至少16個(gè)碳的脂酰-ACP底物具有活性，并且對(duì)具有至少18個(gè)碳的脂酰輔酶A底物具有活性。優(yōu)選的是對(duì)[C15]-15-二十四碳烯?；o酶A(C24∶1)具有活性。
對(duì)于候選的植物脂酰還原酶蛋白，還可以進(jìn)一步濃縮蛋白制劑，例如采用在固定的反應(yīng)染料上進(jìn)行的層析。許多這樣的反應(yīng)染料基質(zhì)是已知的，包括用于本發(fā)明的Cibacron Blue F3GA(Blue A)。通過(guò)本發(fā)明證明了當(dāng)用含有約0.2M NaCl、優(yōu)選的是0.5MNaCl或優(yōu)選0.4M NaCl的緩沖液載樣時(shí)，希蒙德木脂酰還原酶活性結(jié)合在柱子上，而同時(shí)大于約85%的其他蛋白通過(guò)柱子或者被隨后沖洗掉。還證明，通過(guò)用含有約1.0M NaCl的緩沖液洗脫Blue A柱，可以回收希蒙德木脂酰還原酶活性物。
通過(guò)將從Blue A柱濃縮的蛋白制劑加到填有大小篩析材料的柱(有時(shí)也稱(chēng)凝膠過(guò)濾柱)上，對(duì)脂酰還原酶活性進(jìn)一步純化。利用該大小篩析柱還可以估算天然還原酶的大小。尤其是，使用很窄范圍尺寸的柱材料例如Ultragel AcA54或Sephacryl S100可以獲得進(jìn)一步純化的希蒙德木脂酰還原酶成分。特別令人感興趣的是這樣的方法和緩沖液，利用這些方法和緩沖液可以在一個(gè)主峰中回收由大小篩析柱負(fù)載的大于約40-60%的還原酶活性物或其等同物。
將大小篩析柱中的還原酶活性物加至親合柱上，可以進(jìn)一步純化還原酶蛋白。例如，可以將活性成分加至在約0.1M NaCl中的棕櫚酰輔酶A瓊脂糖柱上。然后用含有15mM NaDPH和希蒙德木還原酶輔助因子的緩沖液將約70%的還原酶活性物洗脫。
在純化過(guò)程中，還可以對(duì)含有本發(fā)明脂酰還原酶活性的成分使用其他技術(shù)，例如SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳以及隨后染色。用這種方法可以識(shí)別具有還原酶活性的這些成分中顯著的多肽帶。例如，在由棕櫚酰輔酶A瓊脂糖柱部分純化的希蒙德木還原制劑中，可以識(shí)別出兩條帶，它們代表約53KD的多肽，特別是代表具有54和52KD表觀分子量的多肽，它們占制劑中蛋白的95%以上。使用不同的標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步的SDS-PAGE分析表明，這些還原酶蛋白的表觀分子量可以更準(zhǔn)確地確定為54和56KD，或者約55KD。
正如本文的大小篩析色譜法所證實(shí)的，由于天然還原酶的表觀粒度約為49KD，所以這些帶不能代表一種還原酶的兩個(gè)不同的亞單位。更確切地說(shuō)，還原酶活性是與這些多肽中的一種相關(guān)，或者與兩者相關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)，包括陰離子交換，染料柱，已酰輔酶A親合柱，凝膠過(guò)濾，肝素柱以及硫醇相互作用色譜，都沒(méi)有獲得其他資料。
由于用于該純化過(guò)程的希蒙德木種子是從不同的希蒙德木植物群收集的，因此這些多肽可以代表同一酶的密切相關(guān)的變異體，即同功酶。如上所述，利用對(duì)兩種多肽的Tryptic消化及氨基酸序列分析，可以使54和52KD帶更具特征性。
現(xiàn)在使用各種方法都可以回收基本純化的還原酶蛋白。例如，可以進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移至膜支持物上，例如硝基纖維素或聚亞乙烯基二氟(PVDF)。然后可以得到含有被識(shí)別蛋白的這些膜的切片，這樣所識(shí)別的蛋白就基本上不含其他蛋白。利用本領(lǐng)域已知的和下面實(shí)施例所描述的技術(shù)，可以將此蛋白從膜上分離，并進(jìn)行進(jìn)一步操作，以測(cè)定其氨基酸序列。
例如，可以通過(guò)下列方法測(cè)定氨基酸序列對(duì)完整蛋白的N-末端氨基酸區(qū)域進(jìn)行序列分析，或者通過(guò)用化學(xué)溴化氰消化制備所需蛋白的片段，或者使用蛋白酶通過(guò)酶促裂解制備所需蛋白的片段。有用的蛋白酶的例子包括內(nèi)蛋白酶，lysC、gluC、AspN和胰蛋白酶。然后可以按照本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟悉的方法，對(duì)由此方式得到的片段進(jìn)行純化并進(jìn)行序列分析。
54和52KD候選多肽的進(jìn)一步特征是可以利用的，例如，在大腸桿菌中表達(dá)各種蛋白，隨后驗(yàn)證還原酶活性。其他實(shí)驗(yàn)可以包括免疫分析法，從而制備候選蛋白的特異性抗體，并發(fā)現(xiàn)其可以抑制蛋白制劑中的還原酶活性。
此外，需要從所測(cè)定的與脂酰還原酶活性相關(guān)的蛋白的氨基酸序列中分離核酸序列，以證實(shí)識(shí)別了脂酰還原酶蛋白，并在宿主細(xì)胞(原核或真核)中轉(zhuǎn)錄該序列和/或表達(dá)該蛋白。對(duì)于在細(xì)胞中表達(dá)還原酶需要進(jìn)行各種操作。例如，如果在原核生物(例如大腸桿菌)中產(chǎn)生高濃度的該蛋白，那么它就是破壞性的甚至有毒的，因?yàn)樗度肓思?xì)胞膜中。因此需要使用弱啟動(dòng)子低水平表達(dá)?；蛘?，如果發(fā)現(xiàn)了能夠引起膜嵌入的引導(dǎo)肽，就可以制備只含有能編碼成熟還原酶蛋白的那些核酸序列的構(gòu)件。以這種方式，可以在大腸桿菌中產(chǎn)生還原酶蛋白。如果大腸桿菌中的還原酶活性不能測(cè)定，例如蛋白可能沒(méi)有嵌入膜雙層中，那么可以通過(guò)其他方法，例如使用抗體制劑來(lái)證實(shí)大腸桿菌細(xì)胞中存在還原酶蛋白。
由于脂酰還原酶是膜結(jié)合蛋白，所以需要在植物細(xì)胞中表達(dá)候選蛋白以驗(yàn)證還原酶活性。
利用對(duì)植物組織進(jìn)行電擊穿或轟擊試驗(yàn)可以完成瞬間表達(dá)，從而達(dá)到此目的。但是最終需要在植物(例如能產(chǎn)生被該酶識(shí)別的底物的蕓苔屬成員)中穩(wěn)定地表達(dá)還原酶蛋白。按照這種方法，可以得到脂酰醇產(chǎn)物，它們用于藥物，化妝品、洗滌劑、塑料和潤(rùn)滑油中。
本發(fā)明的還原酶核酸可以是基因組或cDNA，它們可以從cDNA或基因組庫(kù)中分離，或者直接從植物DNA中分離。一旦分離出蛋白和/或得到該蛋白的氨基酸序列，那么基因序列的分離方法就是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的。
例如，可以制備分離到的蛋白的抗體，并用于篩選表達(dá)文庫(kù)，從而識(shí)別產(chǎn)生植物脂酰還原酶蛋白或其抗原片段的克隆?；蛘?，可以從氨基酸序列合成寡核苷酸，并用于分離核酸序列。寡核苷酸可適用于PCR以產(chǎn)生核酸片段，然后該核酸片段可用于篩選cDNA或基因組文庫(kù)。按照不同的途徑，寡核苷酸可直接用于分析Northern或印跡，以識(shí)別有用的探針和雜交條件，在此雜交條件下，這些寡核苷酸可用于篩選cDNA或基因組文庫(kù)。
本發(fā)明的脂酰還原酶核酸序列包括那些與希蒙德木脂酰輔酶A還原酶蛋白相應(yīng)的序列，以及能夠從希蒙德木蛋白或核酸序列獲得的序列?！跋鄳?yīng)的”是指核酸序列，可以是DNA，也可以是RNA，包括編碼希蒙德木脂酰還原酶蛋白或其一部分的核酸序列，存在于所述編碼序列的5′或3′端的調(diào)節(jié)基因序列[它能指導(dǎo)希蒙德木胚芽中還原酶的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯(表達(dá))]，cDNA中不存在的內(nèi)含子序列，以及編碼任何前體還原酶蛋白的引導(dǎo)或信號(hào)肽的序列，該前體還原酶蛋白對(duì)于嵌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜是需要的，但是在成熟的或加工過(guò)的脂酰還原酶中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。
從希蒙德木序列或蛋白“可以獲得的”序列是指與所需脂肪酸還原酶蛋白相關(guān)的核酸序列，它可以從希蒙德木脂酰還原酶氨基酸序列合成，或者在不同的生物體中識(shí)別，并且用希蒙德木還原酶核酸序列或所制備的抗希蒙德木還原酶蛋白的抗體作探針進(jìn)行分離。按照這種方法，可以看出，通過(guò)核酸雜交或抗原方法利用希蒙德木序列從所需生物體分離的其他脂酰還原酶序列同樣可以用于分離其他脂酰還原酶。這些通過(guò)借助于希蒙德木還原酶分離種子植物還原酶獲得的還原酶在本發(fā)明中也認(rèn)為是“可獲得的”。
為了分離核酸序列，可以使用質(zhì)粒或病毒載體以及本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員眾所周知的技術(shù)制備cDNA或基因組庫(kù)。用于篩選所需序列的有用的核酸雜交及免疫方法也是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員眾所周知的，并且已經(jīng)由例如Maniatis等人描述(Molecular Cloning∶A Laboratory Manual，Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。
通常，利用核酸探針獲得的序列將顯示出在靶序列和所給出的編碼令人感興趣的脂酰還原酶的序列之間具有60-70%序列同一性。當(dāng)然也可以獲得只有50-60%序列同一性的過(guò)長(zhǎng)的序列。核酸探針可以是核酸序列過(guò)長(zhǎng)的片段，也可以是較短的寡核苷酸探針。當(dāng)使用較長(zhǎng)的核酸片段作探針(大于約100bp)時(shí)，可以在不太嚴(yán)格的條件下進(jìn)行篩選以從靶樣品獲得這樣的序列，該序列有20-50%不同于(即50-80%序列同源)用作探針的序列。寡核苷酸探針可以比編碼脂酰還原酶的完整核酸序列短，但是它至少應(yīng)該是約10個(gè)，優(yōu)選至少約15個(gè)、更優(yōu)選至少約20個(gè)核苷酸。當(dāng)使用較短的區(qū)域作為較長(zhǎng)區(qū)域的相對(duì)鏈時(shí)，需要高度的序列同一性。因此需要識(shí)別氨基酸序列高度同一的酶活性位點(diǎn)以設(shè)計(jì)寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)同源基因。
為了測(cè)定是否可以通過(guò)與所給出的序列雜交來(lái)分離有關(guān)的基因，可以對(duì)該序列進(jìn)行標(biāo)記以使其可以檢測(cè)，通常使用放射性標(biāo)記，也可以使用其他方法。將標(biāo)記的探針加至雜交溶液中，用含有所需核酸的濾膜，可以是Northern印跡或Southern印跡，進(jìn)行培養(yǎng)(以篩選所需的同種來(lái)源)，或者用含有cDNA或基因組克隆的濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，以進(jìn)行篩選。雜交與洗滌條件可以改變，以使探針與所需序列的雜交最佳化。對(duì)于相關(guān)更遠(yuǎn)的序列(不太嚴(yán)格的)，可以使用較低溫度或較高鹽濃度的條件進(jìn)行雜交。如果在不太嚴(yán)格的條件存在背景雜交的問(wèn)題，可以在雜交或洗滌步驟中升高溫度，和/或降低鹽含量，以提高對(duì)特定雜交序列的測(cè)定。按照Beltz等人討論的方法(Methods in Enzymology(1983)100∶266-285)，雜交和洗滌溫度可以根據(jù)估計(jì)的探針熔化溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)。
如上所述已經(jīng)識(shí)別出有用的探針和合適的雜交與洗滌條件后，使用標(biāo)記的序列和最佳的條件對(duì)cDNA或基因組庫(kù)進(jìn)行篩選。首先將此基因組庫(kù)接種到固體瓊脂基質(zhì)平板上，并將DNA結(jié)合到合適的膜上，通常是硝基纖維素或尼龍濾膜。然后，用標(biāo)記的探針與這些濾膜進(jìn)行雜交，并按照上面描述的方法進(jìn)行洗滌，以識(shí)別含有相關(guān)序列的克隆。
為了進(jìn)行免疫篩選，可以通過(guò)用純化的蛋白對(duì)兔或鼠注射來(lái)制備希蒙德木脂酰還原酶的抗體，這些制備抗體的方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員眾所周知的。盡管通常多克隆抗體更有利于基因分離，但是可以制備單克隆抗體，也可以制備描述多克隆抗體。
為了篩選所需的植物品種，進(jìn)行Western分析，測(cè)定存在于所需植物的粗提取物中的相關(guān)蛋白，這些蛋白與希蒙德木還原酶的抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)。通過(guò)將植物提取物蛋白固定于膜上，通常為硝基纖維素，然后進(jìn)行電泳，并用抗體進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)完成此分析。為了檢測(cè)硝基纖維素濾膜上的抗體/蛋白復(fù)合物，可以使用很多不同的體系，包括放射標(biāo)記的抗體和第二抗體/酶共軛物體系。Oberfelder描述了一些可用的體系(Focus(1989)BRL/Life Technologies，Inc.11∶1-5)。如果發(fā)生交叉反應(yīng)，可以通過(guò)篩選代表所需植物品種的表達(dá)文庫(kù)來(lái)分離編碼相關(guān)蛋白的基因。如Maniatis等人所述(見(jiàn)上文)，可以用各種市售載體包括λgtll構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)。
然后使用已知技術(shù)，將上述利用DNA雜交或免疫篩選技術(shù)識(shí)別的克隆進(jìn)行純化，分離DNA并進(jìn)行分析。在此方法中，已證實(shí)這些克隆編碼相關(guān)的脂酰還原酶蛋白。按照與使用希蒙德木還原酶相同的方法，通過(guò)使用這些還原酶可以得到其他種子植物的脂酰還原酶。
本領(lǐng)域內(nèi)任一普通專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，使用位點(diǎn)特異性突變或PCR這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以對(duì)本發(fā)明的脂酰還原酶核酸序列進(jìn)行修飾，或者在產(chǎn)生合成核酸序列的過(guò)程中修飾此序列。這些修飾的序列也可以認(rèn)為是本發(fā)明的脂酰還原酶核酸序列。例如，可以改變密碼子中不穩(wěn)定的位置，以使該核酸序列能編碼同樣的氨基酸序列，或者可以改變密碼子，以使氨基酸被永久替代。在這兩種情況下，肽或蛋白都保持了所需的酶促活性，因此可認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明脂酰還原酶的核酸序列可以是DNA或RNA序列，它們可以從基因組DNA、cDNA、mRNA獲得，也可以全部合成或部分合成?？蓪⒃摶蛐蛄羞M(jìn)行克隆，例如通過(guò)從合適的來(lái)源中分離基因組DNA，以及利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)所需序列進(jìn)行擴(kuò)增和克隆?；蛘?，基因序列可以全部合成或部分合成，特別是當(dāng)需要提供優(yōu)選的植物序列時(shí)。因此利用所選擇的宿主的優(yōu)選密碼子可以合成所需結(jié)構(gòu)基因的全部或部分(能編碼還原酶蛋白的基因部分)。宿主優(yōu)選的密碼子可以從例如最頻繁地用于所需宿主中表達(dá)的蛋白中的密碼子測(cè)定。
我們將發(fā)現(xiàn)與脂酰還原酶蛋白有關(guān)的核酸序列有許多用途。例如，可用于制備重組構(gòu)件可用作探針，或者在宿主細(xì)胞中表達(dá)脂酰還原酶蛋白。根據(jù)其應(yīng)用，這些構(gòu)件可以含有編碼整個(gè)還原酶或其一部分的序列。例如，可以識(shí)別還原酶的重要區(qū)域，如活性位點(diǎn)。因此可用于制備只含有部分還原酶序列的進(jìn)一步的構(gòu)件，這部分還原酶序列能編碼對(duì)所需還原酶活性必需的氨基酸。
為了從相應(yīng)的脂?；孜镏苽渲敬?，可以在優(yōu)選含有脂酰還原酶蛋白底物的宿主細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)還原酶蛋白所用的體系包括原核細(xì)胞例如大腸桿菌、酵母細(xì)胞、以及植物細(xì)胞包括存在于所需宿主中的維管和非維管植物細(xì)胞。在此方法中，可以產(chǎn)生還原酶蛋白。此外，對(duì)編碼序列進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變可用于研究特異性突變對(duì)還原酶蛋白反應(yīng)性質(zhì)的影響。
因此可以制備反意義構(gòu)件，用于轉(zhuǎn)錄脂酰還原酶編碼序列或其片段的互補(bǔ)序列。在此方法靶宿主生物體中所產(chǎn)生的還原酶蛋白的量可以降低。
本發(fā)明編碼脂酰還原酶的DNA序列可以以各種方式與外源DNA序列結(jié)合?！巴庠础盌NA序列是指任何非天然存在的與還原酶連接的DNA序列，包括非天然存在的連接在一起的、來(lái)自同一生物體的DNA序列的結(jié)合物。例如可以將編碼運(yùn)輸肽的序列與本發(fā)明的還原酶序列連接。在此方法中，以還原酶作為葉綠體上的靶，可以利用葉綠體中的脂酰底物、特別是脂酰-ACPs。
可以將本發(fā)明的編碼脂酰還原酶的DNA序列與正常情況下與還原酶相關(guān)的全部或部分基因序列相結(jié)合。在其組成部分中，編碼還原酶的DNA序列結(jié)合到一個(gè)重組構(gòu)件中，該重組構(gòu)件在5′→3′的轉(zhuǎn)錄方向上含有能夠在一個(gè)宿主細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)，編碼還原酶的核酸序列以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。
調(diào)節(jié)區(qū)將根據(jù)宿主而改變，它們包括來(lái)自病毒，質(zhì)?；蛉旧w基因等的區(qū)域。對(duì)于在原核或真核微生物、特別是單細(xì)胞宿主中表達(dá)，可以使用各種組成的或可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。在微生物中表達(dá)可以提供現(xiàn)成的植物酶來(lái)源。所描述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是來(lái)自細(xì)菌和酵母宿主例如大腸桿菌、枯草桿菌、釀酒酵母，包括基因，例如β-半乳糖苷酶、T7聚合酶和色氨酸E等的區(qū)域。
對(duì)于大多數(shù)情況來(lái)說(shuō)，重組構(gòu)件包括在產(chǎn)生脂酰還原酶的植物中具有功能的調(diào)節(jié)區(qū)域。編碼植物還原酶或其功能片段的開(kāi)放閱讀框架在其5′末端與轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)連接。轉(zhuǎn)譯起始區(qū)也是需要的，它可以由還原酶cDNA序列的5′非編碼區(qū)提供，或者由與該結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然結(jié)合的轉(zhuǎn)譯起始區(qū)提供。通常，轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)合物被稱(chēng)為是啟動(dòng)子。許多啟動(dòng)子區(qū)是可以得到的，它們能夠在植物中進(jìn)行各種組成型的或可調(diào)節(jié)的例如可誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。
已知可用于在植物中進(jìn)行組成型基因表達(dá)的序列是與土壤農(nóng)桿菌基因如胭脂堿合成酶(Nos)，Mannopine合成酶(Mas)，或章魚(yú)堿合成酶(Ocs)相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)，以及編碼病毒基因表達(dá)的區(qū)域，例如，菜花鑲嵌病毒(CaMV)的35S和19S區(qū)域。本文所用的術(shù)語(yǔ)“組成型的”不一定是指在所有細(xì)胞類(lèi)型中以同一水平表達(dá)的基因，而是指在很寬范圍的細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)基因，盡管經(jīng)?？梢詼y(cè)到許多變化。其他有用的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)優(yōu)先在某些組織或在某些生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)錄，例如來(lái)源于napin、種子或葉ACP以及RUBISCO的小亞單位等的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
在需要在植物宿主中表達(dá)脂酰還原酶蛋白的具體例子中，可以需要使用全部或部分完整植物脂酰還原酶基因，即可以將5′上游的非編碼區(qū)(啟動(dòng)子)與結(jié)構(gòu)基因序列以及3′下游的非編碼區(qū)一起使用。如果需要不同的啟動(dòng)子，例如令人感興趣的植物宿主的天然啟動(dòng)子或修飾過(guò)的啟動(dòng)子，即具有從一個(gè)基因源獲得的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和從一個(gè)不同的基因源獲得的轉(zhuǎn)譯起始區(qū)的啟動(dòng)子，或強(qiáng)化的啟動(dòng)子如雙倍35SCaMV啟動(dòng)子，則這些序列可以利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接在一起。
對(duì)于應(yīng)用，如果5′上游的非編碼區(qū)是由在種子成熟過(guò)程中調(diào)節(jié)過(guò)的其他基因獲得，則需要那些優(yōu)先在植物胚芽組織中表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)，例如產(chǎn)生ACP和napin的轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)。按照1988年1月25日申請(qǐng)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)07/147，781(現(xiàn)在為US 07/742，834，1991年8月8日申請(qǐng))以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)07/494，722(大約在1990年3月16日申請(qǐng)，題為“優(yōu)先在早期種子萌發(fā)中表達(dá)的新的序列以及它所涉及的方法”)指導(dǎo)的方法，可以獲得并使用這種“種子特異性啟動(dòng)子”，上述所有未決申請(qǐng)均引入本文作為參考。對(duì)于脂肪醇的生產(chǎn)，需要優(yōu)先在種子組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，以使在其他植物部分中基因產(chǎn)物的任何破壞性或副作用降至最小。
本發(fā)明的重組構(gòu)件也可以包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)可以由編碼植物脂酰還原酶的DNA序列提供，或者是由來(lái)自不同基因源的合適的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)提供，特別是該轉(zhuǎn)錄終止區(qū)與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)自然結(jié)合。該轉(zhuǎn)錄終止區(qū)通常含有至少約0.5kb、優(yōu)選約1-3kb的從3′端到結(jié)構(gòu)基因的序列，由該結(jié)構(gòu)基因衍生出該終止區(qū)。
具有植物脂酰還原酶如以表達(dá)它的令人感興趣的DNA序列存在的植物表達(dá)構(gòu)件可以與各種植物一起使用，特別是產(chǎn)生特長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A分子的植物，例如蕓苔屬，以及特別是在油菜籽的高芥酸變化階段。其他令人感興趣的植物產(chǎn)生所需底物例如基質(zhì)或長(zhǎng)鏈脂酰分子，這些植物包括但不限于油菜籽(Canola變種)、向日葵、紅花、棉花、Cupher、大豆、花生、椰子和油棕櫚以及玉米。根據(jù)將DNA表達(dá)構(gòu)件導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法的不同，需要不同的DNA序列。重要的是，本發(fā)明可用于雙子葉植物和單子葉植物其類(lèi)似種，并且可容易地用于新的和/或改進(jìn)的轉(zhuǎn)化與再生技術(shù)。
轉(zhuǎn)化方法對(duì)于本發(fā)明不是重要的;各種植物轉(zhuǎn)化方法目前都是可行的。作為轉(zhuǎn)化作物的較新的可行方法，它們?cè)谙旅婵芍苯邮褂?。例如，許多對(duì)土壤桿菌感染天然敏感的植物可以通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的三個(gè)成分交配或雙載體轉(zhuǎn)化的方法成功地轉(zhuǎn)化?？捎糜趯⒑怂嵝蛄修D(zhuǎn)移至宿主植物細(xì)胞中的其他序列可以從植物病原病毒或植物轉(zhuǎn)位因子得到。另外，已經(jīng)發(fā)展的微注射，DNA粒子轟擊，電擊穿技術(shù)能夠轉(zhuǎn)化各種單子葉和雙子葉植物。
在制備重組構(gòu)件時(shí)，通常將該構(gòu)件或其片段的各種成分插入合適的克隆載體中，該載體能夠在細(xì)菌宿主例如大腸桿菌中復(fù)制。在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了存在的許多載體。每次克隆后，可以將質(zhì)粒分離并進(jìn)行進(jìn)一步操作，例如限制、插入新的片段、連接、缺失、插入及切除等，以制作所需序列的成份。一旦該構(gòu)件制作完成，就可以根據(jù)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法將該構(gòu)件轉(zhuǎn)移至合適的載體中以進(jìn)行進(jìn)一步的操作。
通常，重組結(jié)構(gòu)中包含具有在宿主中表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)區(qū)并且提供對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇的結(jié)構(gòu)基因。該基因能提供對(duì)細(xì)胞毒性劑例如抗菌素、重金屬和毒素等產(chǎn)生抗性，還能夠?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主補(bǔ)充養(yǎng)分使之成為原養(yǎng)型，以及提供病毒免疫性等。同樣，也可以使用編碼能產(chǎn)生通過(guò)顏色變化而識(shí)別的化合物如GUS的酶或編碼能發(fā)光物質(zhì)的酶如熒光素酶的基因。根據(jù)引入表達(dá)構(gòu)件的宿主種類(lèi)的不同，可以使用一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記以對(duì)轉(zhuǎn)化組織進(jìn)行選擇或檢測(cè)，此時(shí)對(duì)于不同宿主使用不同的選擇條件。
如果用土壤農(nóng)桿菌進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化，要求在核酸序列的一個(gè)或兩個(gè)末端加上T-DNA作邊緣，具體地說(shuō)是左和右邊緣區(qū)，尤其是至少有右邊緣區(qū)。如果使用其他的轉(zhuǎn)化方法，也可以使用這些邊緣區(qū)。
如果將土壤農(nóng)桿菌或Rhizogenes序列用于轉(zhuǎn)化植物，可以利用這樣的載體，該載體引入土壤桿菌宿主后能與宿主中存在的Ti-或Ri-質(zhì)粒上的T-DNA進(jìn)行同源重組。可以將含有重組所需的T-DNA的Ti-或Ri-進(jìn)行裝配(能夠使半乳糖苷酶形成)，也可以去除裝配物(不能使半乳糖苷酶形成)，后者只有當(dāng)其在轉(zhuǎn)化的土壤農(nóng)桿菌宿主中能補(bǔ)充vir基因的功能時(shí)才是允許的，其中vir基因編碼將DNA轉(zhuǎn)移至植物宿主中所必需的轉(zhuǎn)移作用因子。利用裝配的土壤農(nóng)桿菌菌株可以產(chǎn)生正常植物細(xì)胞的混和物，其中的一些含有所需的核苷酸序列，在腫瘤形成基因存在下植物細(xì)胞可以形成半乳糖苷酶。可以從混合物中篩選出含有所需核酸序列，但缺失腫瘤基因的細(xì)胞以獲得正常的轉(zhuǎn)基因植物。
在優(yōu)選的方法中，以土壤農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，將連接有T-DNA邊緣區(qū)的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體插入到能在大腸桿菌和土壤農(nóng)桿菌中復(fù)制的寬宿主范圍載體中，這里所說(shuō)的寬宿主范圍載體描述于文獻(xiàn)中。通常使用的pRK2或其衍生物。參見(jiàn)，例如Ditta等人(Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.(1980)77∶7347-7351)和EPA0120515，這些都引入本文作參考文獻(xiàn)?；蛘呖梢詫⒋嗽谥参锛?xì)胞中表達(dá)的序列插入到含有獨(dú)立復(fù)制序列的載體中，這些結(jié)構(gòu)之一可以使E.coli中的載體穩(wěn)定，而另一個(gè)可以使載體在土壤農(nóng)桿菌中穩(wěn)定。參見(jiàn)，例如，McBride和Summerfelt(Plant Mol.Biol.(1990)14∶269-276)，其中利用了pRiHRI(Jouanin等人，Mol.Gen.Genet.(1985)201∶370-374)的復(fù)制原點(diǎn)，并且能夠?yàn)橥寥擂r(nóng)桿菌宿主細(xì)胞提供增加穩(wěn)定性的植物表達(dá)載體。
優(yōu)選使用能夠在土壤桿菌中復(fù)制的如上所述的載體。在此方法中，不需要進(jìn)行質(zhì)粒重組，并且宿主土壤農(nóng)桿菌vir區(qū)域可以提供將序列的T-DNA邊緣區(qū)轉(zhuǎn)移到植物宿主細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)移作用因子。
對(duì)于蕓苔屬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，例如，可以使用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法。Radke等人描述了其中的一種方法(Theor.Appl.Genet.(1988)75∶685-694)。
現(xiàn)在已大體上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，通過(guò)參照下面的實(shí)施例將更加容易理解本發(fā)明，除非特別說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1 ?；o酶A還原酶的測(cè)定本實(shí)施例描述了測(cè)定微粒體膜制劑中或加溶蛋白質(zhì)制劑中酰基輔酶A還原酶活性的方法。
A.放射性標(biāo)記物用14碳氰化鉀和相應(yīng)的烷基甲磺?；磻?yīng)，然后堿解所得的烷腈生成游離脂肪酸制得比活為51-56Ci/mol的(1-14碳)長(zhǎng)鏈脂肪酸，即11-順-二十烷酸，13-順-二十二烯酸和15-順-二十四碳烯酸。用醚制重氮甲烷將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為其甲基酯，然后用制備性硝酸銀薄層層析(TLC)純化。將脂肪酸甲酯水解重新生成游離脂肪酸。用正常相硅膠TLC、硝酸銀TLC和C18反相TLC三種方法評(píng)估放射化學(xué)純度。由上述方法測(cè)得的放射化學(xué)純度是92-98%。用Young和Lynen的方法(J.Bio.Chem.244∶377，1969)從相應(yīng)的[1-14碳]長(zhǎng)鏈游離脂肪酸制備[1-14碳]長(zhǎng)鏈?；o酶A(比活為10Ci/mol)。其它的[1-14碳]?；o酶A，如[1-14碳]二十四碳烯基輔酶A購(gòu)自Amersham(Arlington Heights，IL)。應(yīng)用經(jīng)稍微修改的Pletcher和Tate的方法(Tet.Lett.1601-1602，1978)對(duì)[1-14碳]十六烷醇進(jìn)行重鉻酸鹽氧化制備[1-14碳]十六烷-1-醇。所得產(chǎn)物經(jīng)制備性硅膠TLC純化。貯存于己烷溶液中置-70℃?zhèn)溆谩?br> B.測(cè)定微粒體膜制劑中還原酶活性1.測(cè)定1微粒體膜制劑中的還原酶活性，是將20μm[1-14碳]?；o酶A(通常是二十四碳烯基輔酶A，比活為2-5Ci/mol)與要檢測(cè)的樣本和2mMNADPH于0.25ml的總體積中一起保溫測(cè)得。保溫混合物還含有10%w/v甘油，1mMDTT，并經(jīng)50mM HEPES(4-[2-羥乙基]-1哌嗪乙烷磺酸)緩沖(這里或下文所指的HEPES是從其pH7.5的1M貯存液中取用的)。
測(cè)定是從加入?；o酶A底物開(kāi)始，于30℃保溫一小時(shí)。然后把測(cè)定管置于冰上中止測(cè)定，并馬上加入0.25ml異丙醇∶乙酸(5∶1v/v)。再加入0.1mg未標(biāo)記的蠟酯和0.1mg油醇作為載體。用經(jīng)按比例縮小的Hara和Radin方案(Anal.Biochem.90∶420，1978)提取[14碳]脂類(lèi)。向中止測(cè)定的管中加入6ml己烷/異丙醇(3∶2，v/v)。旋轉(zhuǎn)混合樣本后加入2ml硫酸鈉水溶液(5.5%w/v)，再次旋轉(zhuǎn)混合樣本。
2.測(cè)定2微粒體膜制劑中還原酶活性的測(cè)定，是將20μm[1-14碳]?；o酶A(通常是二十四碳烯基輔酶A，比活為2-5Ci/mol)與待檢樣本及2mM NADPH于0.25ml的總體積中一起保溫。保溫混合物還含有10%w/v甘油，1mM DTT，并用50mM HEPES(4-[2-羥乙基]-1-哌嗪乙烷磺酸)緩沖(這里或下文指的HEPES是從其pH7.5的1M貯存液中取用的)。如果需要抑制同時(shí)存在于膜制劑中?；o酶A乙醇酰基轉(zhuǎn)移酶活性(該酶消耗還原酶反應(yīng)的產(chǎn)物)，可以在測(cè)定混合物中含有0.3%w/v CHAPS。該濃度的CHAPS對(duì)還原酶的影響最小但能完全抑制酰基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，從而簡(jiǎn)化對(duì)還原酶活性的定量測(cè)定。
測(cè)定從?；o酶A底物的加入開(kāi)始，于30℃保溫1小時(shí)，然后將測(cè)定管置于冰上中止測(cè)定，隨后加入0.25ml異丙醇∶乙酸(4∶1v/v)。加入25μg未標(biāo)記的蠟酯，50μg油醇和50μg油酸作為載體。用按比例縮減的Hara和Radin方案(Anal.Biochem.90∶420，1978)提取[14碳]脂類(lèi)。向中止測(cè)定的管中加入4ml己烷/異丙醇(3∶2，v/v)，旋轉(zhuǎn)混合樣本后加入2ml硫酸鈉水溶液(6.7%w/v)，再次旋轉(zhuǎn)混合樣本。
C.測(cè)定溶解還原酶活性為了測(cè)定溶解還原酶活性，需要進(jìn)行包括添加使酶激活的鹽在內(nèi)的幾種變化。在溶解還原酶測(cè)定中所用的測(cè)定緩沖液就是上述微粒體膜制劑測(cè)定中的緩沖液，但作如下的改變a.加入終濃度為0.3-0.5M的NaCl;
b.包含～1mM EDTA;
c.將一般含0.75%CHAPS的待測(cè)酶樣本稀釋到≤0.3%(CHAPS的CMC是-0.5%)。
D.測(cè)定產(chǎn)物的分析為了分析微粒體膜制劑還原酶測(cè)定中或溶解還原酶測(cè)定中的產(chǎn)物，提出了兩種方案。一種是在下文被稱(chēng)作“廣泛測(cè)定”的方案，它較為費(fèi)時(shí)，但能獲得更高產(chǎn)量，另一種方案在下文稱(chēng)為“快速檢測(cè)”，它也是對(duì)還原酶活性的測(cè)定，但更為快速，方便，產(chǎn)量較少。
1.廣泛分析向樣本中加入硫酸鈉并旋轉(zhuǎn)混合樣本，然后移出上層有機(jī)相，用4ml己烷/異丙醇(7∶2v/v)洗滌下層水相。收集有機(jī)相并在氮?dú)庵姓舭l(fā)中至干燥。脂質(zhì)殘余物重新懸浮于小體積的庚烷中，取一份等量試樣經(jīng)液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定放射活性，樣本的剩余部分或者用于進(jìn)行標(biāo)記物種類(lèi)的TLC分析，或者用于裂解蠟酯的衍生過(guò)程，從而檢測(cè)所產(chǎn)生的醇總量。
對(duì)于脂類(lèi)分析而言，向硅膠TLC板上樣，把該板鋪展于己烷/二乙基醚/乙酸(80∶20∶1或70∶30∶1 v/v/v)中。用AMBIS放射分析顯影系統(tǒng)(AMBIS Systems InC.，San Diego，CA)檢測(cè)放射性在脂類(lèi)，主要是蠟酯(當(dāng)有連接酶存在的情況下，如同在微粒體膜制劑測(cè)定中)，游離脂肪酸，脂肪醇和起始時(shí)的極性脂之間的分布。如果需要，可以從TLC板上回收單一脂類(lèi)作進(jìn)一步分析。
對(duì)于蠟脂的裂解，可應(yīng)用基于對(duì)Pina等人的(Lipids 22∶358-361，1987)Grignard衍生方法按比例縮減進(jìn)行。在固定了襯聚四氟乙烯螺絲帽的小玻璃管中干燥加有200μg蠟酯載體的樣本。然后依次加入0.4ml干二乙基醚，3μl乙酸乙酯和溶于0.1ml二乙基醚中的3M溴化乙基鎂。旋轉(zhuǎn)混合樣本后，靜置于室溫下至少2小時(shí)，然后小心加入經(jīng)水飽和的二乙基醚以除去過(guò)剩的試劑。加入2ml1M HCl和2ml己烷，旋轉(zhuǎn)試管。上層有機(jī)相用水洗滌(2×2ml)，在50-100μl乙醇存在下蒸發(fā)至干燥。
將樣本重新懸浮于50-100μl己烷中，向TLC板上樣。正常相和反相TLC系統(tǒng)兩者都用于樣本分析。正常相TLC用硅膠TLC板，并鋪展于己烷/二乙基醚/乙酸(70∶30∶2v/v/v)中。反相系統(tǒng)用C18板，鋪展于甲醇中。
2.快速分析在向樣本中加入硫酸鈉并旋轉(zhuǎn)混合后，取出已知百分比的有機(jī)相，用液體閃爍計(jì)數(shù)。這一計(jì)算值用于評(píng)估有機(jī)相中的總數(shù)。然后取出有機(jī)相的其余部分，通氮?dú)飧稍?，重新溶解于庚烷中，如在具體測(cè)定中描述的方法于TLC板上點(diǎn)樣和鋪展，掃描。用這種方式即可確定摻入到醇類(lèi)中總數(shù)的百分比。
實(shí)施例2 希蒙德木屬中?；o酶A還原酶的定性本實(shí)施例描述了獲得具還原酶活性的希蒙德木蛋白制劑的方法和有關(guān)酶活性研究結(jié)果。
A.種子發(fā)育和酰基輔酶A還原酶活性對(duì)Davis，CA的5種植物的胚發(fā)育追蹤了兩個(gè)夏季，發(fā)現(xiàn)胚鮮重和干重從約80天到約130天以相當(dāng)穩(wěn)定的速度增加。脂質(zhì)提取物顯示出當(dāng)胚鮮重達(dá)約300mg(約第80天)時(shí)，脂質(zhì)重與干重的比達(dá)最大值的50%。
發(fā)育胚中?；o酶A還原酶活性的測(cè)定如實(shí)施例1所述。由于所測(cè)定的希蒙德木種子表皮是某種抑制因子的來(lái)源，所以在于液氮-70℃凍存植物胚之前去掉種子表皮。
對(duì)無(wú)細(xì)胞勻漿或是膜部分中?；o酶A還原酶活性的發(fā)育全貌的檢定都表明還原酶活性的很大誘導(dǎo)作用，其峰值在開(kāi)花期之后約115天。收集開(kāi)花期后約90-110天的胚用于酶學(xué)研究，如果該時(shí)期還原酶活性高，其脂沉積未達(dá)到最高水平，且種子表皮易于剝除。觀察到還原酶的最大增長(zhǎng)率是在花開(kāi)期后80-90天。因此收集花開(kāi)期后80-90天的胚用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)，推定這一時(shí)期還原酶蛋白合成速率將達(dá)到最大。并推測(cè)出編碼?；o酶A還原酶的mRNA水平在這一時(shí)期也達(dá)到最高。
B.分離研究早期用于分離希蒙德木屬胚胎樣品的方法導(dǎo)致在離心后的脂肪墊，上清液及特定餾分中還原酶活性的可變性分布。進(jìn)行了許多可能對(duì)活性分布具有效影響的處理試驗(yàn)，如超聲波處理，浮選梯度法以及向提取緩沖液中添加各種試劑。在提取緩沖液中包含鹽類(lèi)可以使以100，000Xg離心1小時(shí)所得的上清部分中回收的活性連接酶得到最大改善。提取緩沖含有3M NaCl、0.3M蔗糖、100mM HEPES、2mM DTT和蛋白酶抑制劑，1mM EDTA、0.7μg/ml、抑蛋白酶醛肽、0.5μg/ml抑胃肽和17μg/ml苯甲磺酰氟(PMSF)。
C.微粒體膜制劑含高水平還原酶活性的顆?？傻米陨鲜鼋?jīng)透析后離心(100，000Xg)的上清部分或經(jīng)硫酸銨分離的上清部分。透析方法的詳細(xì)描述見(jiàn)實(shí)施例3。對(duì)這些具有還原酶活性顆粒進(jìn)行諸如密度梯度離心、凝膠滲透層析和蛋白/磷脂分析的進(jìn)一步分析表明，這些顆粒是一個(gè)膜部分。該膜制劑還具有高細(xì)胞色素C還原酶活性，該活性作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜的標(biāo)志。這些研究表明該還原酶活性是與膜相關(guān)的。
對(duì)于硫酸銨分離法，100，000Xg離心上清得自基本如實(shí)施例3所述的希蒙德木屬胚。將等體積的硫酸銨溶液(33.2g/100ml)緩慢加到上清部分(同時(shí)不斷攪拌)，使硫酸銨濃度達(dá)到30%，該濃度將有效地沉淀還原酶。再攪拌30分鐘后將懸液離心(26，000Xg)30分鐘，所得沉淀重新懸浮于含25mM HEPES、1M NaCl、1mM DTT和0.1mM PMSF溶液中，其體積是第一次上清部分(S1)的1/10。懸液再離心(100，000Xg)1小時(shí)，所得沉淀再懸浮于25mM HEPES，10%甘油中(體積為1/10的S1體積)。離心(100，000Xg)該懸液產(chǎn)生洗滌過(guò)的微粒體丸P4，將P4再懸浮于1/20S1體積的25mM HEPES，10%甘油中，使蛋白濃度達(dá)到約3-4mg/ml。分等量試樣凍存于-70℃?zhèn)溆谩?br> D.膜相關(guān)性還原酶活性的研究應(yīng)用Bordier描述的Triton X114相分離方法(J.Biol.Chem.256∶1604-1607，1981)測(cè)定希蒙德木屬還原酶是否是一種完整的膜蛋白，或者是更緊密地與膜層(親水性更高的蛋白)相聯(lián)。該技術(shù)一般包括將膜與1% Triton X114一起于冰上溫育，然后在這些條件下將混和物溫度升至去垢劑的濁點(diǎn)以上(濁點(diǎn)是指較大的膠粒開(kāi)始自發(fā)形成的溫度，1% Triton X114的濁點(diǎn)是-20℃)。通過(guò)離心，可以觀察到兩個(gè)不同的相下層相富含去垢劑，上層相缺乏去垢劑(這里指的是水相)。已經(jīng)表明完整的膜蛋白優(yōu)先分配到富含去垢劑相而親水性更高的蛋白質(zhì)可從水相中回收。當(dāng)希蒙德木屬膜制劑用這一Triton X144相分離方法處理時(shí)，還原酶活性是與富含去垢劑相有關(guān)而在水相中檢測(cè)不到還原酶活性。這一事實(shí)證明該還原酶是一種完整膜蛋白。
E.還原酶更進(jìn)一步的特征上述微粒體膜制劑用于進(jìn)一步鑒定還原酶的特征。還原酶顯示出活性的pH值范圍是5-9。確定還原酶特征的實(shí)驗(yàn)是在pH7.5中進(jìn)行，該pH值接近所推測(cè)的胞漿生理pH值。
1.鹽效應(yīng)用0.5M標(biāo)準(zhǔn)濃度的一元堿鹽檢測(cè)各種鹽對(duì)還原酶活性的影響。含二價(jià)陽(yáng)離子或陰離子的鹽用0.167M濃度(與0.5M一元堿鹽產(chǎn)生相同的離子強(qiáng)度)也可以在0.5M進(jìn)行檢測(cè)，加入0.5M NaCl后觀察到產(chǎn)生了15倍的刺激作用。盡管單價(jià)或雙價(jià)的其它鹽類(lèi)(如LiCl、KCl、MgCl2、CaCl2和Na2SO4)與NaCl的刺激作用相比一般說(shuō)來(lái)程度較低，但它們都顯示出了對(duì)還原酶活性的刺激作用。強(qiáng)的離液序列高的鹽，如KSCN和NaSCN對(duì)還原酶活性不產(chǎn)生刺激作用或產(chǎn)生勉強(qiáng)的刺激作用。
2.其它效應(yīng)物已發(fā)現(xiàn)二硫蘇糖醇(DTT)對(duì)還原酶活性有刺激性，但不是專(zhuān)性的，而乙二胺四乙酸(EDTA)產(chǎn)生一定刺激作用的合適濃度是2.5mM。在0.02-0.075mg/ml低濃度BSA(牛血清白蛋白)中觀察到弱的刺激活性，而B(niǎo)SA在濃度為或大于0.2mg/ml時(shí)產(chǎn)生抑制活性。
早期觀察到?；o酶A還原酶具NADPH特異性的結(jié)果(Pollard etal.，同上文)得以證實(shí)。在上述背景下(＜2%的NADPH依賴性活性)可檢測(cè)出非NADH依賴性活性。而且，還原酶反應(yīng)的水溶性終產(chǎn)物輔酶A和NADP+在毫摩爾濃度產(chǎn)生明顯的抑制活性，而NADH和NAD+對(duì)還原酶活性只有勉強(qiáng)的影響。
3.底物特異性把不同鏈長(zhǎng)的脂肪酸的硫酯、?；］d體蛋白(acyl-ACPS)和?；o酶A作為還原酶的底物。由于二十四碳烯基輔酶A(24∶1輔酶A)底物在較高的濃度時(shí)顯示了強(qiáng)的底物抑制作用，所以試驗(yàn)在底物濃度為10μM條件下進(jìn)行。在這些測(cè)定中NaCl濃度為0.5M。底物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于下文表1中。
表1還原酶的乙酰特異性還原酶活性(Pmol/min/μl)Acyl-ACP Acyl-CoAAcyl基 (10μM) (10μM)12∶0 ＜0.01 ＜0.1516∶0 2.9 ＜0.418∶0 - 1.418∶1 1.05 0.7520∶1 - 1.022∶1 - 1.024∶1 - 19.9二十四碳烯基輔酶A在這些試驗(yàn)物中具有最高的底物活性，因此它被用于酶的進(jìn)一步純化和確定特征的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行還原酶測(cè)定。令人感興趣的是，棕櫚酰輔酶A(C16∶0-CoA)和棕櫚酰-ACP(C16∶0-ACP)可直接當(dāng)作底物。還原酶對(duì)棕櫚酰輔酶A的活性僅僅勉強(qiáng)高于其背景活性，而還原酶對(duì)棕櫚酰-ACP的活性卻很高。以前的研究還表明硬脂酰-ACP(C18∶0-ACP)底物活性(Pollard et al.，同上文)。
還值得感興趣的是，盡管棕櫚酰輔酶A對(duì)于還原酶似不是很好的底物，但在用未標(biāo)記的棕櫚酰輔酶A(O-30μM)和[1-14碳]二十四碳烯基輔酶A(20μM)進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)中，在5μm棕櫚酰輔酶A時(shí)對(duì)還原酶還原二十四碳烯基輔酶A的活性產(chǎn)生了50%的抑制作用。因此，雖然棕櫚酰輔酶A在所用的測(cè)定條件下不是很好的酶作用底物，但它是一種有效的抑制劑。
4.還原酶抑制劑測(cè)定檢測(cè)了幾種已知的其它類(lèi)型還原酶蛋白的抑制劑對(duì)希蒙德木酰基輔酶A還原酶活性的影響。HMG-CoA還原酶(3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶)的強(qiáng)抑制劑，Mevinolin僅在比抑制HMG-CoA還原酶時(shí)的濃度(Ki約1nM)相對(duì)高的濃度(100μm)時(shí)才對(duì)希蒙德木屬?；o酶A還原酶有影響。已經(jīng)熟知Cerulinen共價(jià)結(jié)合于β-酮脂?；蝓ズ铣擅福鼘?duì)希蒙德木?；o酶A還原酶不具有強(qiáng)的抑制作用。
篩選測(cè)定Sulphydryl阻斷劑對(duì)還原酶活性的影響。N-乙基馬來(lái)酰亞胺顯示出了強(qiáng)的抑制活性，對(duì)-羥汞苯甲酸酯也有一定的抑制作用，而碘乙酰胺沒(méi)有抑制作用。據(jù)這一事實(shí)得出的結(jié)論是酰基輔酶A還原酶含有對(duì)各種Sulphydryl阻斷劑顯示出相當(dāng)?shù)倪x擇性的必要Sulphydryl基團(tuán)。
實(shí)施例3 ?；o酶A還原酶的純化本實(shí)施例描述了用于分離具有還原酶活性的希蒙德木膜制劑，增溶還原酶活性和進(jìn)一步純化還原酶蛋白質(zhì)的方法。
A.微粒體膜制劑在開(kāi)花后約90-110天收集希蒙德木屬胚，這可以通過(guò)檢測(cè)胚的水含量(45-70%)來(lái)確定。去掉外殼和種子表皮，將豬耳草于液氮中快速冷凍，并貯存于-70℃?zhèn)溆?。?duì)于初蛋白制劑，在液氮溫度下于鋼研缽和研杵中將冷凍胚搗成粉末狀。在一般的實(shí)驗(yàn)中經(jīng)處理的胚為70克。
將所得粉末以每280ml溶液中含70克胚的比例加入到下列高鹽溶液中3M NaCl、0.3M蔗糖、100mM HEPES、2mM DTT和蛋白酶抑制劑，1mM EDTA、0.7μg/ml抑蛋白酶醛肽、0.5μg/ml抑胃肽和17μg/mlPMSF。將粉末胚分散于存在于Polytron組織勻漿器中的緩沖液中，約30秒后形成無(wú)細(xì)胞勻漿(CFH)。再將勻漿通過(guò)有三層結(jié)構(gòu)的Miracloth(CalBioChem，LaJolla，CA)濾器進(jìn)行過(guò)濾，所得濾液離心(100，000Xg)1小時(shí)。
離心所得樣本包括沉淀、上清液和漂浮的脂肪塊。去掉脂肪塊，收集上清部分并相對(duì)含1M NaCl、100mM HEPES、2mM DTT和1mM EDTA的溶液進(jìn)行透析過(guò)夜(更換緩沖液3次)。將透析液離心(200，000Xg)1小時(shí)產(chǎn)生沉淀DP2。將DP2懸浮于相當(dāng)于初始CFH體積約1/20的25mM HEPES(pH7.5)，10%(w/v)甘油，1mM EDTA和0.5M NaCl中產(chǎn)生微粒體膜制劑。
如實(shí)施例1所述進(jìn)行活性測(cè)定。檢測(cè)到回收的?；o酶A還原酶活性是無(wú)細(xì)胞勻漿中原始活性的約30%。當(dāng)膜制劑貯存于-70℃時(shí)其中的?；o酶A還原酶活性是穩(wěn)定的。
B.還原酶蛋白質(zhì)的溶解將固體CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)-二甲基-ammonio]1-丙磺酸鹽)加到微粒體膜制劑中使終濃度達(dá)到2%(w/v)。樣本于冰上緩慢搖動(dòng)溫育約1小時(shí)，然后用25mM HEPES(pH7.5)，10%甘油，1mM EDTA，0.34M NaCl稀釋樣本使其中CHAPS濃度降低至0.75%，NaCl濃度約為0.4M。再將樣本離心(200，000Xg)1小時(shí)，上清的回收和還原酶活性的測(cè)定如實(shí)施例1所示。一般情況下，可從上清部分回收來(lái)自微粒體膜制劑還原酶活性的85%。當(dāng)樣本貯存于-70℃時(shí)，溶解的還原酶活性是穩(wěn)定的。
C.Blue A柱層析制備柱床體積約25ml并含有Blue A(Cibacron Blue F3GA;Amicon Division，W.R.Grace & Co.)的柱(1.8×～10cm)，用含0.4MNaCl的緩沖液A(25mM HEPES(pH7.5)，20%(w/v)甘油，0.75%CHAPS，1mMEDTA)對(duì)柱進(jìn)行平衡處理。將上述溶解的還原酶制劑上樣到Blue A柱上。
用幾倍于柱體積的含0.4M NaCl的緩沖液A沖洗層析柱，然后再用含0.5M NaCl的緩沖液A沖洗。90%以上的還原酶活性結(jié)合至層析柱上，而85%以上的其它蛋白質(zhì)從柱中沖走。用含1.0M NaCl的緩沖液A從柱中洗脫還原酶活性物，如實(shí)施例1所述收集餾份并對(duì)還原酶活性進(jìn)行測(cè)定。收集到的含還原酶活性的餾分貯存于-70℃。一般情況下，用含1.0M NaCl的緩沖液洗脫能回收上樣還原酶活性的30-50%。
D.大小篩析層析(Size Exclusion Chromatography)將從Blue A柱收集的活性餾份在固定有YM30膜(Amicon Division，W.R.Grace)的壓力槽中通過(guò)超濾而濃縮10倍。一般說(shuō)來(lái)，從Blue A柱流出的含還原酶活性的洗脫液為～90ml，經(jīng)濃縮后為～8ml，然后上樣到下述兩個(gè)Sephacryl S100柱。該兩個(gè)層析柱(2.5×75cm)用S100HR介質(zhì)(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ)填充，并用含0.5M NaCl的緩沖液A平衡。用下列蛋白標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)層析柱體積牛血清白蛋白(66KD)、碳酸酐酶(29KD)、細(xì)胞色素C(12.4KD)和藍(lán)葡聚糖(Blue dextran)(用于確定空隙體積)。將濃縮樣本的4ml等份試樣上樣于每一個(gè)S100柱，它們以約17厘米/小時(shí)的線性流速展開(kāi)。收集～4小時(shí)內(nèi)流出的餾份，用實(shí)施例1所述方法檢測(cè)餾份中的還原酶活性。
在洗脫出的表觀分子質(zhì)量約為49KD的一條主峰中回收的活性大于上樣活性的60%。收集的活性餾份的體積是～30-35ml/柱。
E.親和層析用棕櫚酰輔酶A瓊脂糖(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)填充層析柱，并用緩沖液B(含0.1M NaCl的緩沖液A)進(jìn)行平衡。從凝膠過(guò)濾柱收集的活性餾份通過(guò)上述超濾處理濃縮～16倍。濃縮樣本經(jīng)用緩沖液A稀釋其中的NaCl水平從0.5M降至～0.1M。將稀釋樣品上柱，然后用幾倍于柱體積的緩沖液B沖洗層析柱。再用10ml含15mM NADH的緩沖液B沖洗柱，接著用緩沖液B作進(jìn)一步?jīng)_洗。用15ml含15mM NADPH的緩沖液B流過(guò)層析柱而洗脫還原酶活性。一般情況下，在一定時(shí)間從一個(gè)凝膠過(guò)濾柱收集的物質(zhì)再經(jīng)親和柱處理，經(jīng)NADPH洗脫回收的活性大于樣品上柱時(shí)活性的70%。收集活性餾份進(jìn)行還原酶活性，蛋白質(zhì)濃度和多肽成份分析。根據(jù)Bradford描述的染料結(jié)合法(Analy.Biochem.72∶248-254，1978)用商售藥盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Richmond，CA)估測(cè)蛋白質(zhì)濃度。BSA用作參照蛋白質(zhì)。
F.SDS-PAGE分析樣本的多肽成分用SDS-PAGE分析(Laemmli，U.K.(1970)Nature London)227∶680-685)。通過(guò)加入SDS和二硫蘇糖醇貯存液至終濃度分別為2%和30mM而制備樣品用于電泳。將約50μl的樣品上樣到含有12%分離膠(NOVEX，San Diego，CA)的丙烯酰胺凝膠樣孔中。分子量標(biāo)準(zhǔn)物購(gòu)自Bio-Rad Laboratories。通過(guò)銀染法(Blum et al.，Electrophoresis 8∶93-99，1987)檢測(cè)蛋白質(zhì)。
在來(lái)自親和柱的活性樣本中檢測(cè)到表觀分子量約52KD和54KD的兩條主要多肽帶，它們一起代表了該制劑中95%以上的蛋白質(zhì)。因?yàn)樵谧匀粻顟B(tài)下還原酶的表現(xiàn)大小約為49KD(由如上文所述和大小篩析層析法確定)，所以這些條帶很可能表示還原酶的相關(guān)形式而不是一種酶的兩個(gè)不同亞單位。
G.蛋白質(zhì)吸印到膜上為了進(jìn)行氨基酸測(cè)序，在SDS-PAGE電泳后將上述還原酶多肽轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上，或轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜(Millipore;Bedford，MA)或ProBlott膜(Applied Biosystems;Foster City，CA)上以進(jìn)一步分離蛋白質(zhì)。如果要對(duì)蛋白質(zhì)按順序地酶解時(shí)最好選用硝酸纖維素膜，而PVDF對(duì)N-末端測(cè)序法和對(duì)來(lái)自溴化氰消化的肽的測(cè)序有用。
1.吸印至硝酸纖維素膜如果蛋白質(zhì)經(jīng)電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上時(shí)，則于5-20%甲醇中含25mM Tris、192mM甘氨酸的緩沖液中轉(zhuǎn)印的時(shí)間一般是1-5小時(shí)。電轉(zhuǎn)印后，將膜在存在于1%(v/v)乙酸中的0.1%(w/v)麗春紅S中染色2分鐘，在0.1%(v/v)乙酸中脫色，更換脫色液2-3次，每次持續(xù)2分鐘。然后將膜濕潤(rùn)著于-20℃存于熱封閉的塑料袋中。如果時(shí)間允許的話，吸印膜不必冷凍而馬上進(jìn)行消化以產(chǎn)生如下文所述確定的氨基酸序列的肽。
2.轉(zhuǎn)印至PVDF當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移到Immobilon P PVDF上時(shí)，在溶于10%(v/v)甲醇的12.5mM Tris/5mM甘氨酸的緩沖液中的轉(zhuǎn)印時(shí)間一般約1-2小時(shí)。電轉(zhuǎn)印之后，將膜在溶于50%(v/v)甲醇/10%(v/v)乙酸的0.1%(w/v)考馬斯蘭中染色5分鐘，再于50%(v/v)甲醇/10%(v/v)乙酸中脫色，更換脫色液2-3次，每次脫色持續(xù)2分鐘。然后將PVDF膜于空氣中干燥30分鐘，再將干燥的膜置入熱封口的塑料袋中貯于-20℃。吸印到PVDF膜，如ProBlott上的蛋白質(zhì)可直接用于完整蛋白質(zhì)的N-末端序列測(cè)定。在下文的實(shí)施例4A中描述了電轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)至ProBlott上的方法。
實(shí)施例4 氨基酸序列的測(cè)定本實(shí)施例描述了測(cè)定與?；o酶A還原酶活性相關(guān)的植物蛋白質(zhì)的氨基酸序列的方法。
A.用溴化氰裂解蛋白質(zhì)和肽的分離用在《探針設(shè)計(jì)肽分離系統(tǒng)技術(shù)手冊(cè)》(Probe-Design PeptideSeparation System Technical Manual)(Promega，Inc.Madison，WI)中描述的方法對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行溴化氰裂解。如上所述將還原酶蛋白吸印到PVDF膜上。從吸印膜上剪下蛋白質(zhì)條帶，放入溶于70%(v/v)甲酸的溴化氰溶液中，一起于室溫下溫育過(guò)夜。溫育之后去除溴化氰溶液，收集，并用Reacti-Vap蒸發(fā)器(Pierce，Rockford，IL)于連續(xù)氮?dú)饬飨逻M(jìn)行干燥處理。用肽洗脫溶劑，如70%(v/v)異丙醇，0.2%(v/v)三氟乙酸，0.1mM賴氨酸和0.1mM巰基乙酸對(duì)溴化氰肽進(jìn)行再次洗脫以保證溴化氰完全去除，去除洗脫液，加到含干燥過(guò)的溴化氰的試管中按上述方法干燥?？梢杂眯迈r洗脫溶劑重復(fù)洗脫過(guò)程。加50μl HPLC級(jí)的水到干燥肽中，再經(jīng)Speed-Vac(Savant，Inc.，F(xiàn)armingdale，NY)蒸發(fā)去掉水份。
用類(lèi)似于Schagger和von Jagow描述的方法(Anal.Biochem.166∶368-379，1987)借助于Tris/N-三羥甲基甘氨酸SDS-PAGE系統(tǒng)分離肽。在125-150V的恒壓下進(jìn)行凝膠電泳約1小時(shí)或電泳至指示染料跑出凝膠的底邊為止。轉(zhuǎn)移前，先將凝膠浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中(125mM Tris、50mM甘氨酸、10%(v/v)甲醇)15-30分鐘。在50V恒壓下將凝膠轉(zhuǎn)印到ProBlott測(cè)序膜(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上，轉(zhuǎn)印2小時(shí)，將轉(zhuǎn)印膜在考馬斯蘭(0.1%溶于50%(v/v)甲醇/10%(v/v)乙酸)中染色，再于50%(v/v)甲醇/10%(v/v)乙酸中脫色3次，每次2分鐘。膜在空氣中干燥30-45分鐘，然后貯存于-20℃。
吸印到ProBlott上的肽可直接上樣到蛋白質(zhì)測(cè)序儀的筒(cartridge)上而不需加入包被Polybrene的玻璃纖維濾器。用經(jīng)細(xì)微改動(dòng)的反應(yīng)循環(huán)BLOT-1(由Applied Biosystems提供)對(duì)肽測(cè)序。另外，溶液S3(丁基氯化物)也用50∶50的S1和S2(正庚烷和乙酸乙酯)的混合物代替。當(dāng)對(duì)吸印到ProBlott上的樣本測(cè)序時(shí)都用到了這兩處變動(dòng)。
B.蛋白酶消化和肽的分離吸印到硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)可以用蛋白酶進(jìn)行消化而獲得用以測(cè)序的肽。所用的方法是Aebersold等人描述的(PNAS84∶6970，1987)。從硝酸纖維素膜上取下還原酶蛋白條帶，同時(shí)取等量空白硝酸纖維素膜用作對(duì)照，用HPLC級(jí)的水對(duì)獲取的膜沖洗數(shù)次以去掉麗春紅S。沖洗后，將1.0ml溶于0.5%乙酸中的0.5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40，Aldrich，Milwaukee，WI)加到膜條帶中，并于37℃溫育30分鐘。為了徹底去除PVP-40，用大體積的HPLC級(jí)水(8×5ml)沖洗硝酸纖維素條塊，并用分光光度計(jì)檢測(cè)洗出液在214nm的吸光度。而且，如果硝酸纖維素條帶在PVP-40處理和沖洗兩個(gè)步驟之后才切割成小片，PVP-40就更容易去掉。這兩處改動(dòng)消除了PVP-40干擾的問(wèn)題。
將處理后的小片然后懸浮于適宜的消化緩沖液中，例如胰蛋白酶消化緩沖液，100mM碳酸氫鈉pH8.2，或蛋白內(nèi)切酶gluC緩沖液，25mM碳酸銨/1mMEDTA，pH7.8。向消化混合物中加入乙腈使其濃度為5-10%(v/v)。用消化緩沖液稀釋蛋白酶，然后加到消化混合物中，一般情況下，蛋白酶與所消化蛋白質(zhì)之比為1∶10(w/w)。溫育18-24小時(shí)進(jìn)行消化。例如，胰蛋白酶消化于37℃溫育，而蛋白內(nèi)切酶gluG消化要在室溫下溫育。同樣地，其它蛋白酶，包括lysC和aspN可以用于消化還原酶蛋白。盡管單個(gè)的消化緩沖液條件可以不同，但消化、肽分離、純化和測(cè)序過(guò)程基本與上述用gluC和胰蛋白酶消化的相應(yīng)程序相同。
溫育過(guò)夜后，加入10μl(v/v)三氟乙酸(TFA)或1μl100%TFA中止消化反應(yīng)。從硝酸纖維素片塊上除去消化混合物，用1-5 100μl體積的含5-10%乙腈的消化緩沖液沖洗硝酸纖維素片塊，并且將該體積溶液于Speed-Vac中濃縮至小于100μl。用安裝于應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)130-型高效液相色譜(HPLC)上的Vydac反相C18柱(2.1mm×100mm)分離肽，用于洗脫肽的移動(dòng)相是緩沖液A0.1nM磷酸鈉pH2.2;緩沖液B溶于0.1mM磷酸鈉中的70%乙腈(pH2.2)。所應(yīng)用的流速為50μl/分的三步梯度洗脫是10-55%緩沖液B二小時(shí)，55-75%緩沖液B5分鐘和75%緩沖液B常液洗脫15分鐘。于214nm檢測(cè)肽，由專(zhuān)人收集后貯存于-20℃。
C.蛋白質(zhì)和肽的N-末端測(cè)序應(yīng)用在Applied Biosystems 477A液相脈動(dòng)蛋白測(cè)序儀進(jìn)行Edman降解而進(jìn)行所有測(cè)序步驟;由測(cè)序儀產(chǎn)生的乙內(nèi)酰苯硫脲(PTH)氨基酸是用相聯(lián)的應(yīng)用生物系統(tǒng)120A PTH分析儀進(jìn)行分析。借助用于Apple Macintosh的應(yīng)用生物系統(tǒng)610A型數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)和用來(lái)自PE NELSON，Inc.(Cupertino，CA)的ACCESS＊CHROM軟件的數(shù)字微型Vax計(jì)算機(jī)收集和貯存數(shù)據(jù)。從經(jīng)PTH分析儀接收輸入的圖型記錄儀閱讀到測(cè)序數(shù)據(jù)，并用得自610A型軟件的定量數(shù)據(jù)證實(shí)讀到的測(cè)序數(shù)據(jù)。所有測(cè)序數(shù)據(jù)由兩個(gè)操作人員借助于數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)各自讀出。
對(duì)于得自HPLC峰圖的肽樣本，可上樣于已在測(cè)序儀中經(jīng)過(guò)3次預(yù)循環(huán)的包被Polybrene的玻璃纖維濾器(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上。對(duì)于已經(jīng)還原和堿解的肽，用液體閃爍計(jì)數(shù)器對(duì)每次測(cè)序儀循環(huán)所產(chǎn)生的PTH-氨基酸產(chǎn)物的一部分進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于已經(jīng)電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移到Immobilon-P上的蛋白樣本，切出感興趣的條帶，然后置于如上所述經(jīng)預(yù)循環(huán)的包被Polybrene玻璃纖維濾器上，根據(jù)制造商的指示安裝反應(yīng)筒。對(duì)于經(jīng)電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移到ProBlott上的蛋白樣本，不需要玻璃纖維濾器。
為了從小量樣本(5-30pmol)中獲得蛋白質(zhì)序列，應(yīng)用如Tempst和Riviere(Anal.Biochem，183∶290 1989)描述的477A轉(zhuǎn)換循環(huán)和120A分析儀。
D.還原酶肽的氨基酸序列應(yīng)用SDS-PAGE分離純化還原酶制劑，分離出54和56KD蛋白質(zhì)，將分離出的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素型膜(Immobilon N)上，用麗春紅R染色對(duì)條帶進(jìn)行定位。用胰蛋白酶處理從吸印膜上切割下來(lái)含56或54KD蛋白質(zhì)的部分，再經(jīng)反相HPLC分離胰蛋白酶肽。從每一個(gè)還原酶的蛋白的幾個(gè)肽獲取的序列信息示于下列表2中。
表254KD和56KD還原酶蛋白質(zhì)的肽序列56KD 還原酶肽 54KD 還原酶肽1)AILVTGATGSLAK 1)AILVTGATGSLAK2)LQNExFGKELFK 2)LGLDINVEK3)VTVVPGDITGEDL 3)TIDNVPVYYG4)LGLDINVEK 4)YVEPVTYxVGSSAAN5)TIDNVPVYYGK 5)LVDIYKp6)YVEPVTYHVGSSAANPM 6)EGIVEADMFYF
7)LSALPEMAHR 7)AINWEDYFL8)LVDIYK 8)THFPGVVEHVL9)EGIVEADMFYFD10)AINWEDYFLKTxFPGVVEXVL表中所列出的肽序列應(yīng)用的是代表氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)一字母密碼。“X”表示該位置上的氨基酸還末鑒定出。以小寫(xiě)字母出現(xiàn)的氨基酸標(biāo)示表示對(duì)該氨基酸的鑒定是不確定的。
從上述肽序列可以看到兩種還原酶蛋白質(zhì)相似性這一事實(shí)。從54KD蛋白質(zhì)得到的所有肽序列也見(jiàn)于被測(cè)序的56KD肽中。在被測(cè)定的氨基酸序列與從編碼56KD還原酶的cDNA(圖1)推導(dǎo)出的相應(yīng)還原酶氨基酸序列之間有一處不相符合，根據(jù)cDNA序列資料氨基酸460是絲氨酸，而分別來(lái)自54KD和56KD肽6和9的信息表明這一位置是甘氨酸。
對(duì)用4種不同的限制性酶消化的希蒙德木屬基因組DNA進(jìn)行的Southern吸印分析測(cè)出了與還原酶cDNA探針雜交的一條主帶和一條次帶。
實(shí)施例5 希蒙德木屬cDNA文庫(kù)本實(shí)施例描述了從收集于開(kāi)花期后80-90天的希蒙德木屬胚中分離poly(A)+RNA，然后構(gòu)建希蒙德木屬胚cDNA文庫(kù)的方法。
A.希蒙德木屬RNA的分離用Jackson和larkins最早提出(Plant physiol.57∶5-10，1976)經(jīng)由Goldberg等人改良的方法(Deve-lopmental Biol.83∶201-217，1981)從多核糖體中分離RNA。除非有特別說(shuō)明，提取過(guò)程的所有步驟都在4℃下進(jìn)行。將10mg組織在液氮中于Waring攙合器里磨碎直到所有組織都變成細(xì)粉為止。蒸發(fā)掉液氮后，加入170ml提取緩沖液(200mM Tris pH9.0、160mM KCl、25mM EDTA、70mM MgCl2、1%Triton X-100、0.5%脫氧膽酸鈉，1mM亞精胺，10mMβ-巰基乙醇和500mM蔗糖)，并將組織勻漿化約2分鐘。勻漿經(jīng)無(wú)菌的(miracloth)過(guò)濾，再離心(12，000Xg)20分鐘。將上清液輕輕倒入500ml無(wú)菌燒瓶中，并于室溫下加入1/19體積的20%去垢劑溶液(20%Brij35，20%吐溫40，20%Noidet p-40w/v)。用中速在4℃下攪拌所得溶液30分鐘，再將上清離心(12，000Xg)30分鐘。
約30ml上清被等分后加入到已放有7ml溶液(40mM Tris pH9.0、5mM EDTA、200mM KCl、30mM MgCl2，1.8M蔗糖，5mMβ-巰基乙醇)的無(wú)菌Ti60離心管中。用提取緩沖液將離心管充滿，用Ti60轉(zhuǎn)子于4℃離心(60，000rpm)4小時(shí)。離心后，吸掉上清，向每只離心管中加入0.5ml重懸浮緩沖液(40mM Tris pH9.0、5mM EDTA、200mM KCl、30mM MgCl2，5mMβ-巰基乙醇)。將離心管置于冰上10分鐘，到沉淀團(tuán)丸徹底重新懸浮后貯存。然后將上清再離心(120Xg)10分鐘以去掉不溶性物質(zhì)。將1體積的溶于20mM Tris pH7.6、200mM EDTA，2%N-月桂基-肌氨酸中的自消化性蛋白酶K(1mg/ml)加到上清中，混合物于室溫下溫育30分鐘。
加入1/10體積乙酸鈉和2體積乙醇沉淀RNA于-20℃下沉淀數(shù)小時(shí)后，經(jīng)于4℃下離心(12，000Xg)30分鐘沉淀RNA。將團(tuán)丸重新懸浮于10mlTE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA)中，并用等體積的Tris pH7.5飽和酚提取。于4℃下離心(10，000Xg)20分鐘進(jìn)行相分離，移去水相，用1體積TE緩沖液重新抽提有機(jī)相。然后收集水相，用1體積氯仿提取。經(jīng)離心再次分相，如前所述用乙醇沉淀水相獲得多核糖體RNA。
多核糖體RNA制劑中的多糖雜質(zhì)是通過(guò)把RNA于高鹽緩沖液(0.5M NaCl、20mM Tris pH7.5、1mM EDTA、0.1%SDS)過(guò)纖維素柱(Sigma-cell 50)來(lái)去除。雜質(zhì)結(jié)合于柱上而從洗出液中收集RNA。收集洗出液餾份并用乙醇沉淀RNA。沉淀得到的總RNA重新懸浮于一小體積溶液中，應(yīng)用寡聚-dT纖維素柱分離多腺苷酸化的RNA。
B.用質(zhì)粒載體構(gòu)建cDNA文庫(kù)用多腺苷酸化的RNA在質(zhì)?？寺≥d體pCGN1703中構(gòu)建cDNA文庫(kù)，pCGN1703是從商售克隆載體Blue-scribe M13-(Stratagene Cloning Systems;San Diego，CA)衍生而來(lái)，具體做法如下。通過(guò)用BamHI消化，用綠豆核酸內(nèi)切酶處理，而改變Bluescribe M13的多接頭，連接平齊末端構(gòu)建成缺失BamHI的質(zhì)粒pCGN1700。用EcoRI和SstI(吡鄰的限制性位點(diǎn))消化pCGN1700，用具有BamHI，PstI，XbaI，ApaI和SmaI限制性位點(diǎn)，5′AATT延伸物，3′TCGA延伸物的合成連接頭進(jìn)行退火。連接頭插入到pCGN1700中消除了EcoRI位點(diǎn)，重新構(gòu)成了見(jiàn)于Bluescribe中的SstI(有時(shí)也稱(chēng)為“SacI”)位點(diǎn)，增添了包含于連接頭中的新限制性位點(diǎn)。用HindIII消化所得的質(zhì)粒pCGN1702，并用Klenow酶進(jìn)行鈍端化處理;用PvuII對(duì)線性DNA進(jìn)行部分消化，并在稀釋液中用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。篩選缺失lac啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)化體(pCGN1703)用作質(zhì)?？寺≥d體。
用于cDNA合成的克隆方法簡(jiǎn)要說(shuō)明如下。用SstI消化質(zhì)粒克隆載體，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用于所得的3′延伸粘末端產(chǎn)生同聚物T-尾。用oligo(dA)纖維素層析從未消化的質(zhì)粒或未加尾的質(zhì)粒中分離出加尾質(zhì)粒。所得的載體充當(dāng)合成共價(jià)結(jié)合于載體質(zhì)粒任一端的cDNA第一條鏈的引物。在鳥(niǎo)苷三磷酸存在下用末端轉(zhuǎn)移酶處理cDNA-mRNA-載體復(fù)合物，于cDNA鏈末端產(chǎn)生G-尾。經(jīng)BamHI消化去除鄰近BamHI位點(diǎn)的其它c(diǎn)DNA-mRNA復(fù)合物，剩下在一端為BamHI粘末端而另一端為G-尾的cDNA-mRNA-載體復(fù)合物。
用一退火合成的環(huán)化連接使上述復(fù)合物環(huán)化，該連接子具有5′BamHI粘性末端、限制性酶NotI、EcoRI和SstI的識(shí)別序列及3′C-尾端。在連接和修復(fù)之后，將環(huán)化復(fù)合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α株(BRL，Gaithersburg，MD)形成cDNA文庫(kù)。希蒙德木胚cDNA庫(kù)含有約1.5×108克隆，平均cDNA插入量約500bp。
C.用λ載體構(gòu)建cDNA文庫(kù)希蒙德木多腺苷酸化RNA也用于在克隆載體λZAPII/EcoRI(Stratagene，San Diego，CA)中構(gòu)建cDNA文庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)所用的方案，DNA和菌株由制造商提供。同樣，根據(jù)制造商的說(shuō)明用Gigapack Gold包裝提取物(Stratagene)包裝克隆。
以上述方式構(gòu)建的cDNA文庫(kù)含有約1×108克隆，其平均cDNA插入量約400bp。
D.還原酶cDNA的分離用根據(jù)還原酶肽序列設(shè)計(jì)引物和PCR技術(shù)生產(chǎn)還原酶核苷酸序列的約1Kb部分，用于篩選pCGN1703細(xì)菌性載體中的希蒙德木文庫(kù)。
應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)中的已知技術(shù)，例如Manistis等人所述(見(jiàn)上文)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。獲得了含56KD還原酶蛋白質(zhì)的克隆pCGN7571，并測(cè)定了其DNA序列。pCGN7571的核苷酸序列和推測(cè)出的其氨基酸序列示于圖1中。
實(shí)施例6 用還原酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物A.Napin/還原酶表達(dá)構(gòu)建體用Napin基因的5′和3′調(diào)節(jié)區(qū)制備在植物細(xì)胞中表達(dá)還原酶的構(gòu)建體的方法如下在未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中(申請(qǐng)?zhí)?7/550，804)描述了Napin表達(dá)盒pCGN1808，該專(zhuān)利申請(qǐng)引入本文作參考文獻(xiàn)。pCGN1808經(jīng)修飾后含有位于兩側(cè)的限制性位點(diǎn)，僅允許表達(dá)序列而不允許抗生素耐性標(biāo)記向雙載體如pCGN1557(McBride and Summerfelt，同上文)移動(dòng)。將含KpnI、NotI和HindIII限制性位點(diǎn)的合成寡核苷酸進(jìn)行退火，與pCNG1808唯一的HindIII位點(diǎn)連接，于是便恢復(fù)了唯一的HindIII位點(diǎn)。序列分析證實(shí)了所得的質(zhì)粒pCGN3200在napin3′調(diào)節(jié)序列的3′端含有唯一的HindIII、NotI和KpnI限制性位點(diǎn)。
用HindIII和SacI消化pCGN3200并與用HindIII和SacI消化的pIC19R(Marsh，et al.Gene 32∶481-485，1984)相連接而將napin表達(dá)盒中的主要部分進(jìn)行亞克隆以形成pCGN3212。借助于利用pCGN3200作模板以及位于SacI位點(diǎn)兩側(cè)的二條引物的PCR技術(shù)并與napin5′啟動(dòng)子和來(lái)自pCGN1808構(gòu)建體的pCGN3200的pUC主要成分相連接重新構(gòu)建napin啟動(dòng)子區(qū)的5′端最大序列。向前的引物含有ClaI、HindIII、NotI和KpnI限制性位點(diǎn)及napin5′序列的408-423核苷酸(從EcoRV位點(diǎn)計(jì)數(shù))，反向引物含有與包括5′啟動(dòng)子中唯一的SacI位點(diǎn)的napin序列718-739互補(bǔ)的序列。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用Perkin Elmer/Cetus熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR。PCR片段作為平齊末端片段亞克隆到經(jīng)HincII消化的pUC8(Vieira and Messing Gene.19∶259-268，1982)中形成pCGN3217。對(duì)pCGN3217上的napin插入序列進(jìn)行測(cè)序證實(shí)，通過(guò)PCR未引入不正確的核苷酸。pCGN3217中的napin5′序列連接到經(jīng)ClaI和SacI酶解并連接于經(jīng)ClaI和SacI消化的pCGN3212上的napin表達(dá)盒的剩余部分。所得的表達(dá)盒pCGN3221用HindIII酶解，經(jīng)凝膠純化napin表達(dá)序列，連接到用HindIII酶解的pIC20H(Marsh，同前文。)最終的表達(dá)盒是pCGN3223，它含有一氨芐青霉素抗性遺傳背景，基本上同于pCGN1808中的1.725napin 5′和1.265 3′調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)區(qū)位于HindIII、NotI和KpnI限制性位點(diǎn)的側(cè)端，唯一的SalI、BglII，PstI和XhoI克隆位點(diǎn)位于5′和3′非編碼區(qū)之間。
還原酶cDNA pCGN7571用SphI(該位點(diǎn)在3′未轉(zhuǎn)譯序列的1594-1599堿基處)酶解，并于該位點(diǎn)處插入SalI連接子。用BamHI和SalI酶解所得質(zhì)粒，經(jīng)凝膠電泳純化含還原酶cDNA的片段，并克隆到BglII/XhoI消化的pCGN3223(即上文所述的napin盒)中產(chǎn)生pCGN7585。
含有napin5′/還原酶/napin3′構(gòu)建體的pCGN7586的HindIII酶解片段克隆到經(jīng)HindIII酶解的pCGN1578(McBride and Summerfelt，同上文)中形成一種用于植物轉(zhuǎn)化的雙向載體pCGN7586。應(yīng)用Holsters等人的方法(Mol.Gen.Genet.163∶181-187，1978)和下文描述的植物轉(zhuǎn)化方法將pCGN7586轉(zhuǎn)化到封桿菌屬細(xì)胞中，如EHA101株(Hood et al.，J.Bacteriol 168∶1291-1301，1986)。
B.植物轉(zhuǎn)化將高芥酸種子，例如Reston栽培變種和油菜的Canola型變種的種子在95%的乙醇中浸泡2分鐘，于含1滴吐溫20的1.0%次氯酸鈉溶液中進(jìn)行表面消毒約30分鐘，然后用無(wú)菌蒸餾水漂洗3次。將種子平鋪于Magenta盒中，該盒裝有1/10濃度的Murashige基本有機(jī)培養(yǎng)基(Gibco;Grand Island，NY)，培養(yǎng)基中補(bǔ)充了吡哆素(pyriodoxine，50μg/L)、煙酸(50μg/L)，甘氨酸(200μg/L)和0.6%Phytagar(Gibco)pH5.8。種子在細(xì)胞培養(yǎng)室中于22-24℃光照16小時(shí)發(fā)芽，其中冷熒光和紅光的強(qiáng)度約45-50微愛(ài)因斯坦/米2/秒(μEm-2S-1)。
切除6-7天老秧苗中的下胚軸，切成2-4mm長(zhǎng)的小片，平鋪于飼養(yǎng)盤(pán)中(Horsh et al.，Science 227∶1229-1231，1985)。育養(yǎng)盤(pán)在用前一天制備在含約30mlMS鹽基質(zhì)(Carolina Biological，Burlington，NC)100mg/L肌醇，1.3mg/L鹽酸硫胺素、200mgKH2PO4(含3%庶糖)、2，4-D(1.0mg/L)、0.6%w/v Phytagar(高壓滅菌前調(diào)pH至5.8)(MS0/1/0培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿(100×25mm)中鋪入1.0ml馬鈴薯培養(yǎng)物。使用前在飼養(yǎng)層的上面放一張無(wú)菌濾紙片(Whatman 3mm)。通過(guò)將10ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到100ml上述用于飼養(yǎng)盤(pán)中并含2，4-D(0.2mg/L)和激動(dòng)素(0.1mg/L)的新鮮MS培養(yǎng)基中對(duì)馬锍薯懸浮培養(yǎng)物進(jìn)行再次培養(yǎng)一周，在未用飼養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，將胚軸組織移植塊切下后放到MS0/1/0培養(yǎng)基上部的濾紙片上。所有的胚軸組織移植塊在22-24℃，連續(xù)光照強(qiáng)度30-65μEm-2S-1條件下于飼養(yǎng)盤(pán)中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。
將含有雙向載體的根癌土壤桿菌株EHA101的單個(gè)克隆轉(zhuǎn)移到5mlMG/L肉湯中于30℃過(guò)夜生長(zhǎng)。胚軸組織移植塊浸入到其中細(xì)菌稀釋到1×108細(xì)菌/毫升的約10mlMG/L肉湯中，約10分鐘后再放入飼養(yǎng)盤(pán)中。每升MG/L肉湯含有5g甘露糖醇、1gL-谷氨酸或1.15g谷氨酸鈉，0.25g KH2PO4、0.10g NaCl、0.10g MgSO4·7H2O，1mg生物素，5g胰化胨和2.5g酵母提取物。將肉湯pH值調(diào)至7.0。與土壤桿菌共培養(yǎng)48小時(shí)后，將胚軸組織移塊轉(zhuǎn)移到含過(guò)濾除菌的羧芐青霉素(500mg/L，高壓滅菌后加入)和25mg/L硫酸卡那霉素(Boehringer Mannheim;Indianapolis，IN)的B50/1/0愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(B5鹽和維生素并補(bǔ)充1mg/L 2，4-D;0.6%Phytagar)。
在約85μEm-2S-1連續(xù)光照培養(yǎng)3-7天后，在切割表面可見(jiàn)愈傷組織，將胚軸組織移植塊轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B5BZ中(B5鹽和維生素、還補(bǔ)充了3mg/L苯氨基嘌呤，1mg/L玉米素，1%蔗糖、0.6%Phytagar調(diào)pH值至5.8)。該培養(yǎng)基還含有羧芐青霉素(500mg/L)和硫酸卡那霉素(25mg/L)。每?jī)芍軐⑴咻S組織移植塊轉(zhuǎn)至新鮮芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行亞培養(yǎng)。
1-3月后胚軸愈傷組織再生出芽。從愈傷組織切除至少1cm高的綠芽，放入含B5鹽和維生素，1%蔗糖、羧芐青霉素(300mg/L)，硫酸卡那霉素(500mg/L)和0.6%w/vPhytagar的培養(yǎng)基中。2-4周后，從基底部切除保持綠色的綠芽，轉(zhuǎn)移到含根誘生培養(yǎng)基(B5鹽和維生素、1%蔗糖、2mg/L吲哚丁酸、50mg/L硫酸卡那霉素和0.6%Phytagar)的Magenta箱中。
擬南芥屬植物的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因Arabidposis thaliana植物可以通過(guò)Valverkens等人描述的經(jīng)土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Proc.Nat.Acad.Sci.85∶5536-5540，1988)而獲得。用Holsters等人的方法(Mol.Gen.Genet.163∶181-187，1978)將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌細(xì)胞，如EHA101株中(Hood et al.，J.Bacterial.168∶1291-1301，1986)。
上述結(jié)果顯示了獲得在脂肪族醇形成中有活性的增溶性種子植物脂酰還原酶蛋白質(zhì)的能力。本發(fā)明提供了獲得?；€原酶蛋白及其氨基酸序列的方法。此外，還提供了還原酶核苷酸序列?？梢约庸ぬ幚磉@些核苷酸序列使之在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和/或在宿主細(xì)胞中表達(dá)還原酶蛋白，該蛋白質(zhì)具有廣泛的用途。
本說(shuō)明書(shū)引證的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)都引入本文作參考文獻(xiàn)，就象每一出版物或?qū)＠暾?qǐng)被特別和逐一指明引為參考文獻(xiàn)一樣。
為了清楚和理解起見(jiàn)，盡管說(shuō)明書(shū)用說(shuō)明和例證對(duì)前述發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)地描述，但根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)在不違背所附權(quán)利要求精神或范圍的前提下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行某種改動(dòng)和修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。
權(quán)利要求
1.一種部分純化的種子植物脂酰還原酶，其中所說(shuō)的還原酶在從脂?；孜镄纬芍咀宕嫉倪^(guò)程中具有活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的還原酶，其對(duì)脂酰輔酶A底物有活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的還原酶，其對(duì)具有通式C2X碳鏈的脂?；孜镉谢钚?，其中的X選自8-12。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的還原酶，其中的還原酶是NADPH依賴性的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的還原酶，可以從希蒙德木屬胚中獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的還原酶，它實(shí)質(zhì)上含有分子量約55KD的所說(shuō)還原酶。
7.一種含有編碼至少部分脂酰還原酶的核苷酸序列的重組構(gòu)建體，其中所說(shuō)的還原酶在從脂酰基底物形成脂肪族醇的過(guò)程中具有活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的重組構(gòu)建體，其中所說(shuō)的還原酶對(duì)脂酰輔酶A底物有活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的重組構(gòu)建體，其中所說(shuō)的還原酶對(duì)具有通式C2X碳鏈的脂?；孜镉谢钚?，通式中的X選自8-12。
10.權(quán)利要求7的重組構(gòu)建體，其中所說(shuō)的還原酶是NADPH依賴性的。
11.權(quán)利要求7的重組構(gòu)建體，其中所說(shuō)的核苷酸序列可從種子植物中獲得。
12.權(quán)利要求7的重組構(gòu)建體，其中所說(shuō)的核苷酸序列可以從希蒙德木屬獲得。
13.權(quán)利要求7的重組構(gòu)建體，它進(jìn)一步還包括一段至少使所說(shuō)還原酶編碼序列在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的5′非編碼序列。
14.權(quán)利要求7的重組構(gòu)建體，它進(jìn)一步還包括一段使所說(shuō)還原酶編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的5′非編碼序列。
15.權(quán)利要求13的重組構(gòu)建體，其中所說(shuō)的還原酶編碼序列位于所說(shuō)的5′非編碼序列的反意義方向。
16.權(quán)利要求13、14或15任何一個(gè)權(quán)利要求的重組構(gòu)建體，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
17.一種含有權(quán)利要求7所說(shuō)重組構(gòu)建體的細(xì)胞。
18.一種含有權(quán)利要求7所說(shuō)重組構(gòu)建體的植物細(xì)胞。
19.一種含有權(quán)利要求7所說(shuō)重組構(gòu)建體的蕓苔屬植物細(xì)胞。
20.一種含有種子植物脂酰輔酶A還原酶的原核細(xì)胞。
21.一種在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)脂酰基底物的方法，它包括培養(yǎng)含有重組構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所說(shuō)的重組構(gòu)建體含有編碼脂酰還原酶的核苷酸序列，其中的還原酶在從脂?；孜镄纬芍咀宕嫉倪^(guò)程中具有活性，其中所說(shuō)的還原酶編碼序列是由在宿主細(xì)胞起作用的調(diào)節(jié)因子控制的，在允許所說(shuō)還原酶序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞是種子植物胚細(xì)胞。
23.權(quán)利要求21的方法，所說(shuō)的宿主細(xì)胞是蕓苔屬。
24.權(quán)利要求21的方法，所說(shuō)的核苷酸序列可從種子植物獲得。
25.一種溶解的種子植物脂酰基還原酶，其中所說(shuō)的還原酶在從脂?；孜镄纬芍咀宕嫉倪^(guò)程中具有活性。
26.權(quán)利要求25的還原酶對(duì)脂酰輔酶A底物具有活性。
27.權(quán)利要求25的還原酶，對(duì)含有通式C2X碳鏈的脂?；孜镉谢钚?，其中的X選自8-12。
28.權(quán)利要求25的還原酶，其中所說(shuō)還原酶是NADPH依賴性的。
29.權(quán)利要求25的還原酶，它可從希蒙德木屬胚中獲得。
30.權(quán)利要求29的還原酶，它實(shí)質(zhì)上含有分子量約55KD的所說(shuō)還原酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了部分純化的種子植物脂酰還原酶蛋白質(zhì)，所說(shuō)的蛋白質(zhì)在從脂?；孜镄纬芍咀宕嫉倪^(guò)程中具有活性。特別感興趣的是分子量約54KD和52KD的希蒙德木屬胚還原酶蛋白質(zhì)及可從中獲得的序列。同樣值得考慮的是可從這類(lèi)脂酰還原酶獲得的氨基酸和核苷酸序列。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1064312SQ9210220
公開(kāi)日1992年9月9日 申請(qǐng)日期1992年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1991年2月22日
發(fā)明者J·G·梅茨, M·R·波拉德 申請(qǐng)人:加利福尼亞基因公司