專利名稱：用同工酶檢測西瓜甜瓜種子純度的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測西瓜甜瓜雜交種真實(shí)性與純度的方法。
目前利用雜種優(yōu)勢來提高作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性已在許多農(nóng)作物上得到證實(shí)，其中西瓜和甜瓜的雜種優(yōu)勢極為明顯，因此，近年來，在西瓜種植上絕大多數(shù)都是使用的雜種一代;甜瓜雜種一代的利用也在逐年迅速增加。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，不少奸商把一些低劣的西瓜和甜瓜種子冒充優(yōu)良的雜交種推銷給瓜農(nóng)，使瓜農(nóng)蒙受很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前檢測種子純度的方法是一般把秋天采收的雜交種帶到海南島去，利用當(dāng)?shù)貧鉁貤l件通過實(shí)地種植來驗(yàn)證、對比雜交種子的真實(shí)性和純度，另外，可在當(dāng)?shù)胤N植視測后，待隔年種植。這種方法檢測浪費(fèi)人工和資金，而且時間長，給瓜農(nóng)帶來諸多不便，影響雜交種的利用。
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，而提供一種可在實(shí)驗(yàn)室對西瓜甜瓜雜交種的真?zhèn)螜z測法。
本發(fā)明是在聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)中發(fā)現(xiàn)西瓜、甜瓜雜交種有雜種酶帶的存在，而且在相同的生育期和相同的組織(或部位)的酶譜因品種不同而存在差異，本檢驗(yàn)方法就是利用西瓜、甜瓜雜交種的雜種酶帶的有無和酶譜的差異來辯認(rèn)、對比雜交種的真實(shí)性與純度，從而可實(shí)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室檢測取代在田間實(shí)地種植的檢測。
本發(fā)明相比上述現(xiàn)有技術(shù)有如下效果由于可在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雜交種的檢測，從播種到取樣檢測完畢約15-20(天)，是原來時間的四分之一;可在溫室完成幼苗培育，不受季節(jié)限制，隨時隨地都可進(jìn)行育苗檢測，節(jié)約了去南方實(shí)地種植的費(fèi)用、人力;同時采用本法檢測準(zhǔn)確率高。


圖1是本發(fā)明工藝流程圖;
圖2是子一代西瓜的標(biāo)準(zhǔn)酶譜圖片;
圖3是子一代甜瓜的標(biāo)準(zhǔn)酶譜圖片;
下面將對本發(fā)明進(jìn)行詳述由工藝流圖所示，以西瓜、甜瓜純父本、母本和子一代種子(第一代雜交種)分別種植生出真葉為檢驗(yàn)體，利用聚丙烯酰胺凝膠作電泳，經(jīng)染色子一代的過氧化物酶同工酶酶譜帶有偏(親)父帶和偏母帶，并以該子一代的酶譜帶作檢測同父本、母本的雜交種酶譜帶的標(biāo)準(zhǔn)。
上述純父本、母本和子一代可在15-20℃溫室里分別種植，甜瓜播種15天左右，西瓜20天左右可生出第一片真葉，以此時的幼苗為最佳取樣期;將樣苗洗凈吸干在0-4℃下加2倍苗重的提取緩沖液研成勻漿，經(jīng)2-8層藥用紗布過濾，濾液在離心機(jī)上(3500-4000r/min)離心10-15min后入瓶置在冰箱中作檢驗(yàn)體液。電泳槽上的凝膠模子，可采用市場上的標(biāo)準(zhǔn)凹型玻璃板與配套的玻璃板、有機(jī)玻璃條，可在凹型玻璃(除凹型邊)一面三邊上涂凡士林，粘上有機(jī)玻璃條后再粘上配套玻璃板，制成厚度為0.4-0.9mm夾層模子。模子里要注入模子高度的三分之二分離膠和3-5mm隔絕水層;其分離膠可用[A液iNHCle(鹽酸)48ml+TEMED(四甲基乙二胺)0.23ml+Tris(三羥甲基胺基甲烷)6.6g+水定溶至100ml配成PH＝8.9的溶液]∶[C液Acr(丙烯酰胺)30.0g+Bis(甲叉雙丙烯酰胺)0.8g]∶水∶E液Per(過硫酸銨)0.56+水定溶至100ml]＝1∶2∶4∶1的容積比例配制，濃度為7.5%;其具體配制過程是將前三種按比例混合后，置抽氣瓶中脫氣未有氣泡時止，立即加入適量per混勻后注入上述模子里聚合1h(小時)左右;聚合后除去膠面的水層再注入濃縮膠至模子口部加配套樣梳，40W日光燈下光聚合30min后取出樣梳。其濃縮膠可用[B液1NHC148ml+TEMED0.46ml+Tris5.98g+水定溶至100ml配成PH＝6.7的溶液]∶[(D液Acr10.0g+Bis2.5g+水定溶至100ml]∶水∶[F液Ribofl(核黃素)4.0mg+水定溶至100ml]＝1∶2∶4∶1的容積比例配制，濃度為2.8%;其具體配制過程是將前三種按比例混勻脫氣后加Ribofl。上述提取緩沖液可用0.3M蔗糖102.6g+0.1M氯化鉀0.746g+0.05M磷酸二氫鈉2.184g+0.05M磷酸氫＝鈉12.89g+水定溶至1000ml來制備。
去掉樣梳后，要在所形成的樣孔上依次從(左)一端點(diǎn)1-2孔純母本，1-3孔純父本，余孔點(diǎn)純一代(F1)的檢驗(yàn)體液，每孔劑量點(diǎn)入約10-100μl，每點(diǎn)完一孔后要用蒸餾水沖凈點(diǎn)樣器，再點(diǎn)下一孔;點(diǎn)完后可撤去凝膠模子底邊的有機(jī)玻璃條形成電泳通路，裝到電泳槽上，將上、下電泳槽注滿電泳液后接到電泳儀上，上槽接負(fù)極，下槽接正級，電壓200-300v，電流30-40mA，電泳時間4-5h(小時)。電泳后取下凝膠模子，去掉封條，用鑷子小心撬開玻璃板，將凝膠板經(jīng)水沖洗下來后置染色液里5-10min(分鐘)，待其上酶譜帶顯示后，經(jīng)水沖洗多次，譜帶由蘭色變棕色;以純2孔母本、1-3孔父本和多孔子一代的檢驗(yàn)體液作成的譜帶為標(biāo)準(zhǔn)樣譜帶，鑒別種的譜帶可與同父本、母本的子一代標(biāo)準(zhǔn)樣譜帶作對比，經(jīng)分析可鑒別真?zhèn)巍?br> 電泳液可用Tris5.5g+Gly(甘氨酸)30.0g+水定溶至1000ml，同時再稀釋10倍。用2g聯(lián)苯胺溶于18ml冰醋酸中加水72ml，取醋酸聯(lián)苯胺溶液5ml再加3%的過氧化氫2ml再加水93ml可配成本發(fā)明所用染色液。
采用本法鑒別西瓜、甜瓜雜交種的真?zhèn)?，因品種多，鑒別前必須作出該品種純父本、母本和子一代(雜交種)的酶譜帶，以該子一代的酶譜帶作標(biāo)準(zhǔn)譜帶;因子一代的酶譜帶具有父本、母本的酶譜帶的特征，即具有偏父本和偏母本的子一代酶的譜帶;其它鑒別種子的酶譜帶與同父本、母本的子一代標(biāo)準(zhǔn)譜帶作比較，經(jīng)過分析，根據(jù)兩種譜帶是相同、近似還是有差異，經(jīng)過多粒鑒別種子的酶譜帶比較分析、可定出真?zhèn)巍?br> 權(quán)利要求
1.一種用同工酶檢測西瓜甜瓜種子純度的方法，其特征以純父本、母本和子一代的種子分別種植生出真葉為檢測體，利用聚丙烯酰胺凝膠作電泳，經(jīng)染色其子一代的過氧化物酶同工酶酶譜帶有偏(親)父帶和母帶，并以該子一代的酶譜帶作檢測同父本、母本的雜交種酶譜帶的標(biāo)準(zhǔn)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征可取種植剛生出第一片真葉苗為檢測體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征檢測體可在0-4℃下加2倍苗重的提取緩沖液里成漿過濾，在離心機(jī)上離心10-15min后可制成檢測體液。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征凝膠在凝結(jié)后所形成凝膠板的厚度可為0.4-0.9mm。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在制凝膠板的模子里可注入模子高度三分之二分離膠，并注隔絕水層;靜止聚合約1小時后除隔絕水層注濃縮膠至模子端口再插配套樣梳，在光下聚合約30min后取出樣梳，即為凝膠板;在凝膠板上所形成的凹孔上從一端點(diǎn)2孔純母本、1-3孔純父本余孔點(diǎn)純子一代的檢測體液，每孔點(diǎn)劑量約10-100μl，可進(jìn)行電泳。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征可用(A液iNHCI48ml+TEMED0.23ml+Tris36.6g+H2O定溶至100ml)∶(C液Acr30.0g+Bis0.8g+H2O定溶至100ml)∶(H2O)∶(E液Per0.56g+HO定溶至100ml)＝1∶2∶4∶1的比例容積配制成濃度為7.5%的分離膠。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征可用(B液INHCI48ml+TEMED0.6ml+Tris5.98g+H2O定溶至100ML)∶(D液Acr10.0g+Bis2.5g+H2O定溶液至100ml)∶(H2O)∶(F液Ribofl4.0mg+H2O定溶至100ml)＝1∶2∶4∶1的容積比例配制成濃度為2.8%的濃縮膠。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征可用0.3M蔗糖102.6g+0.01氯化鉀0.746g+0.5M磷酸二氫鈉2.18g+0.5M磷酸氫二鈉12.89g+水定溶至1000ml可配制提取緩沖液。
9.如權(quán)利要求1、5所述的方法，其特征經(jīng)電泳后的凝膠板于染色液中5-10min，其染色液可用2g聯(lián)苯胺溶于18ml冰醋酸中加水72ml，取5ml該溶液加3%的H2O22ml，再加93ml的H2O配成。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在電泳過程中所用電泳液可用Tris5.5g+Gly30.0g+H2O定溶至1000ml，用時再稀釋10倍。
全文摘要
用同工酶檢測西瓜、甜瓜雜交種子純度的方法，解決了不用在適宜季節(jié)實(shí)地種植結(jié)瓜來鑒別，而是在當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室15—20天可鑒別真?zhèn)?，省時省力，同時準(zhǔn)確率高。它是以純父本、母本和子一代(該父本、母本的雜交)的種子分別在溫室里(寒冷季節(jié))種植生出真葉為檢驗(yàn)體，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，經(jīng)過染色發(fā)現(xiàn)子一代的檢驗(yàn)體過氧化物酶同工酶酶譜帶有偏(親)父帶和偏母帶，以該子一代的酶譜帶作檢驗(yàn)鑒別種子的酶譜帶的標(biāo)準(zhǔn)譜帶，經(jīng)過與多粒鑒別種子的酶譜作比較，分析可定真?zhèn)巍?br> 文檔編號C12Q1/28GK1070947SQ92105578
公開日1993年4月14日 申請日期1992年7月4日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月4日
發(fā)明者黃永紅, 王付德 申請人:大慶師范?？茖W(xué)校