專利名稱：利用微生物生產(chǎn)d-酒石酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物生產(chǎn)d-酒石酸的方法。
d-酒石酸〔(2R，3R)-2，3-二羥丁烷-1，4-二羧酸〕是一種天然有機酸，在食品工業(yè)中可作為酸味劑用于糖果和清涼飲料，亦可作防腐劑和乳化穩(wěn)定劑;在制藥工業(yè)中除作為醫(yī)藥原料外，還作為拆分劑被大量使用。過去，d-酒石酸是用生產(chǎn)葡萄酒的付產(chǎn)物生酒石為原料生產(chǎn)的。由于需求的增加，由此獲得的d-酒石酸遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。
目前利用微生物生產(chǎn)d-酒石酸的方法是首先，用添加順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的微生物;然后，在上述微生物培養(yǎng)物或處理物中加入順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽，經(jīng)酶催化反應(yīng)，生成d-酒石酸或其鹽;接著，采用鈣鹽沉淀或離子交換的分離方法，分離提取反應(yīng)物中的d-酒石酸。
已報道能水解順式環(huán)氧琥珀酸為d-酒石酸的微生物有無色桿菌屬(Achromobacter)，醋酸桿菌屬(Acetobacter)，土壤桿菌屬(Agrobacterium)，產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)，不動桿菌屬(Acinetobacter)，諾卡氏菌屬(Nocardia)，根瘤菌屬(Rhizobium)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，棒桿菌屬(Corynebacterium)。
但利用上述微生物生產(chǎn)d-酒石酸的方法，還未見達(dá)到工業(yè)規(guī)模試驗要求的報道。
本發(fā)明的目的是提供一種適合工業(yè)規(guī)模試驗要求的利用微生物生產(chǎn)d-酒石酸的方法。
本發(fā)明所采用的微生物是本發(fā)明者從土壤中分離獲得的新菌種，是具有同化順式環(huán)氧琥珀酸能力的節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)微生物，它們的培養(yǎng)物或其處理物能水解順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽，生產(chǎn)d-酒石酸。本發(fā)明以順式環(huán)氧琥珀酸為微生物生長的唯一碳源來分離獲得上述微生物，其分離的具體方法如下首先將采集的土樣用無菌水稀釋后涂布于含順式環(huán)氧琥珀酸二鈉1%，硫酸銨1%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂(含七分子水)0.05%，硫酸亞鐵(含七分子水)0.001%，酵母膏0.2%，瓊脂2%的培養(yǎng)基(PH7.0)平板上，30℃7天培養(yǎng)。挑取在上述平板上生長的微生物，再經(jīng)初篩和復(fù)篩。本發(fā)明將獲得具有生產(chǎn)價值的兩菌株編號成JZ-1、-2。(該兩菌株已以CGMCC NO.的保藏號于1992年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)。上述兩菌株的細(xì)菌學(xué)特征見表1。
表1
續(xù)上表
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<p>續(xù)上表
根據(jù)表1細(xì)菌學(xué)特征，JZ-1和JZ-2菌株被鑒定屬于節(jié)桿菌屬的細(xì)菌。
在培養(yǎng)這些細(xì)菌時，培養(yǎng)基中含有順式環(huán)氧琥珀酸。順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽的添加方式可采用預(yù)先添加在培養(yǎng)基中，也可采用首先加入葡萄糖等物質(zhì)的普通微生物培養(yǎng)基對上述細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，而后在適當(dāng)?shù)臅r候添加的方式。通常所用的培養(yǎng)基含有碳源(例如葡萄糖、果糖、甘露糖、順式環(huán)氧琥珀酸及其鹽)、氮源(如硫酸銨、硝酸銨)、有機營養(yǎng)物質(zhì)(例如酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿)、無機營養(yǎng)成份(例如磷酸鹽、鎂、亞鐵)等等。培養(yǎng)基可以是液體，也可以是固體。
培養(yǎng)方法可以是靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為20～35℃，最好為28～33℃范圍。培養(yǎng)時的培養(yǎng)基PH保持在中性為好。在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中，一般可采用三級培養(yǎng)方式，即首先在搖瓶中振蕩培養(yǎng)后，再接入種子罐通風(fēng)攪拌擴大培養(yǎng)，然后接入大罐進(jìn)行通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，但也可根據(jù)具體情況靈活掌握。
當(dāng)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶大量形成時，逐漸加入順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽進(jìn)行反應(yīng)，一般采用順式環(huán)氧琥珀酸二鈉為好。反應(yīng)可以靜置、振蕩或通氣攪拌的方式進(jìn)行。根據(jù)反應(yīng)進(jìn)行的程度控制順式環(huán)氧琥珀酸二鈉的加入量，一般培養(yǎng)24小時～36小時后，加入4%(W/v)，反應(yīng)過程中再逐漸加入12%，使最終的d-酒石酸濃度最高達(dá)10%左右。反應(yīng)液的PH通常為6.5～9，最好保持為7.5～8.5。反應(yīng)溫度通常為28～35℃。當(dāng)順式環(huán)氧琥珀酸基本上定量轉(zhuǎn)化成d-酒石酸后，便可進(jìn)行d-酒石酸的提取。
一般采用通用的鈣鹽沉淀法分離d-酒石酸，即在上述反應(yīng)液中加入CaCl2水溶液，形成酒石酸鈣沉淀。經(jīng)過濾水滌后再加硫酸酸解，酸解形成的硫酸鈣沉淀經(jīng)過濾水洗后除去。酸解液經(jīng)732陽離子交換樹脂除陽離子，再將離交液濃縮結(jié)晶的方法。
實例1.
將培養(yǎng)24小時的節(jié)菌JZ-2的斜面菌體接一環(huán)于種子培養(yǎng)基中，34℃振蕩培養(yǎng)12小時。吸取2.5ml上述種子液于裝有35ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)24小時，加PPE(聚醚類消泡劑)1滴，并逐漸加入40%(W/V)順式環(huán)氧琥珀酸二鈉水溶液10.5ml，共經(jīng)86小時振蕩培養(yǎng)。
合并各搖瓶培養(yǎng)液共得1100ml，平均含d-酒石酸7.3%(W/V)。在上述培養(yǎng)液中逐漸加入40%(W/V)CaCl2水溶液160ml，同時不斷攪拌。室溫放置過夜，真空吸濾，水洗后得91克酒石酸鈣(干計)。加自來水400ml，加熱至60℃時，逐漸加入濃H2SO4約26ml，繼續(xù)加熱攪拌至95℃，加活性炭2克，95℃保溫30分鐘。真空吸濾水洗得到含15.2%(W/V)d-酒石酸的酸解液420ml，經(jīng)732陽離子交換柱除去陽離子，將離交液減壓濃縮，最終得到63.3克d-酒石酸，總得率為78.8%。
精確稱取20.0克樣品，配制成濃度為20%(W/V)的溶液，用WZZ-1型旋光儀測得旋光度α20℃D＝+4.92(20cm旋光管)，其比旋光度為〔α〕20℃D＝+12.3，用1.0048M NaOH溶液滴定，其含量為99.65%。
斜面培養(yǎng)基組成(%) 種子培養(yǎng)基組成(%) 產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成(%)葡萄糖 1.0 葡萄糖 1.0 葡萄糖 0.5牛肉膏 1.0 玉米漿 2.0 (NH4)2SO40.3蛋白胨 1.0 (NH4)2SO40.2 K2HPO4·3H2O 0.1Nacl 0.5 K2HPO4·3H2O 0.1 MgSO4·7H2O 0.05瓊脂 2.0 MgSO4·7H2O 0.05 FeSO4·7H2O 0.001PH 7.2 FeSO4·7H2O 0.001 順式環(huán)氧1.0121℃滅菌20分鐘 PH 7.2 琥珀酸二鈉121℃滅菌20分鐘 PH 7.2121℃15分鐘蒸氣滅菌實例2.
在20只1000ml三角瓶中裝200ml如實例1的種子培養(yǎng)基，接入經(jīng)24小時培養(yǎng)的節(jié)桿菌JZ-2斜面菌體各一環(huán)，30～34℃振蕩培養(yǎng)15小時，傾入接種瓶中。
在1500l發(fā)酵罐中，盛900l如實例1的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，PH7.2，121℃滅菌20分鐘，冷卻后接入上述種母，30～33℃通氣攪拌培養(yǎng)24小時，加PPE1l，并逐漸加入40%(W/V)順式環(huán)氧琥珀酸二鈉水溶液430l，繼續(xù)通氣攪拌培養(yǎng)48小時，得反應(yīng)液1400l。反應(yīng)液中d-酒石酸含量為11.0%(W/V)。順式環(huán)氧琥珀酸對d-酒石酸的克分子轉(zhuǎn)化率為99.8%。
實例3.
采用如實例2同樣的方法培養(yǎng)6瓶節(jié)桿菌JZ-2種子液，并傾入接種瓶中。
在250l種子罐中，加入200l如實例1同樣的種子培養(yǎng)基，PH7.2，121℃滅菌20分鐘，冷卻后接入搖瓶種母，33℃通氣攪拌培養(yǎng)12小時。
在8000l發(fā)酵罐中，盛4500l如實例1同樣的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，PH7.2，121℃滅菌20分鐘，冷卻后將種子罐中的種母接入，30～33℃通氣攪拌培養(yǎng)24小時，加PPE5l，并逐漸加入40%(W/V)順式環(huán)氧琥珀酸二鈉溶液1650l，共通氣攪拌培養(yǎng)66小時，得反應(yīng)液7320l，反應(yīng)液中d-酒石酸含量為7.71%(W/V)。順式環(huán)氧琥珀酸對d-酒石酸的克分子轉(zhuǎn)化率為93.8%。
采用如實例1同樣的分離精制方法，得d-酒石酸結(jié)晶160kg，含量為60%(W/V)d-酒石酸母液約440l，總得率為75.1%。
產(chǎn)品經(jīng)輕工業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心南京站檢驗〔α〕20℃D＝+12.2°，含量99.6%。
實例4.
采用1500l種子罐對節(jié)桿菌JZ-2進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同實例3。
在25000l發(fā)酵罐中，盛15000升如實例1同樣的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，PH7.2，121℃滅菌10分鐘，冷卻后接入種子罐種母約1000l，30～33℃通氣攪拌培養(yǎng)24小時，加PPE 15l，并逐漸加入40%(W/V)順式環(huán)氧琥珀酸二鈉共5250l，通氣攪拌培養(yǎng)120小時，得反應(yīng)液23000l。反應(yīng)液中d-酒石酸含量為8.05%(W/V)。順式環(huán)氧琥珀酸對d-酒石酸的轉(zhuǎn)化率為96.5%。
采用如實例1同樣的分離精制方法，得d-酒石酸結(jié)晶527kg，含量為60%(W/V)d-酒石酸母液約1400l，總得率為73.8%。產(chǎn)品經(jīng)測定，其比旋光度為〔α〕20℃D＝+12.5，含量為99.8%。
實例5.
將培養(yǎng)24小時的節(jié)桿菌JZ-1的斜面菌體接一環(huán)于如實例1同樣的種子培養(yǎng)基中，32～34℃振蕩培養(yǎng)12小時，吸取5ml上述種子液于裝有100ml下列產(chǎn)酶培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中，30～33℃振蕩培養(yǎng)24小時，加PPE 2滴，并逐漸加入順式環(huán)氧琥珀酸二鈉16克，30℃振蕩培養(yǎng)至72小時。反應(yīng)液中d-酒石酸含量為9.8%(W/V)。
采用如實例1同樣的分離精制方法，所得d-酒石酸結(jié)晶經(jīng)測定，其比旋光度〔α〕20℃D＝+12.4°(20%(W/V))，含量為99.8%。
產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成(%)葡萄糖 0.5(NH4)2SO40.5K2HPO4·3H2O 0.1MgSO4·7H2O 0.05FeSO4·7H2O 0.001順式環(huán)氧琥珀酸二鈉 1.0PH 7.2121℃滅菌20分鐘實例6.
在7只1000ml三角瓶中裝200ml如實例1同樣的種子培養(yǎng)基，接入經(jīng)24小時培養(yǎng)的節(jié)桿菌JZ-1斜面菌體各一環(huán)，32～34℃振蕩培養(yǎng)12小時。
在150l發(fā)酵罐中盛70l如實例5同樣的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，PH7.2，121℃滅菌15分鐘，冷卻至32℃時接入上述種母，30～33℃通氣攪拌培養(yǎng)24小時，加PPE 60ml，并逐漸加入40%(W/V)24l，經(jīng)91小時通氣攪拌培養(yǎng)，得反應(yīng)液95l。反應(yīng)液中d-酒石酸含量為9.0%(W/V)，順式環(huán)氧琥珀酸對d-酒石酸的克分子轉(zhuǎn)化率為97.3%。
實例7.
采用如實例6同樣的方法培養(yǎng)7瓶節(jié)桿菌JZ-1種子液，并傾入接種瓶中。
在150l種子罐中盛80l如實例1同樣的種子培養(yǎng)基，PH7.2，121℃滅菌15分鐘。冷卻至34℃時接入搖瓶種母，32～34℃通氣攪拌培養(yǎng)12小時，冷卻至20℃，等待接種。
在1500l發(fā)酵罐中，盛800升如實例5同樣的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，pH7.2，121℃滅菌15分鐘，冷卻至32℃時接入種子罐種母，30～33℃通氣攪拌培養(yǎng)24小時，加PPH 1l，并逐漸加入40%(W/V)順式環(huán)氧琥珀酸二鈉191.4l，經(jīng)30～33℃ 107小時通氣攪拌培養(yǎng)，得反應(yīng)液1100l，反應(yīng)液中d-酒石酸含量為5.60%(W/V)，順式環(huán)氧琥珀酸的克分子轉(zhuǎn)化率為85.5%。
實例8.
采用1500l種子罐，盛350l如實例5同樣的種子培養(yǎng)基，對節(jié)桿菌JZ-1進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同實例7。
在10000l發(fā)酵罐中，盛6000l如實例5同樣的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，PH7.2，121℃滅菌15分鐘，冷卻至32℃時接入種子罐種母，30～33℃通氣攪拌培養(yǎng)24小時，加PPE 6l，并逐漸加入40%(W/V)順式環(huán)氧琥珀酸二鈉2200l，經(jīng)61小時通氣攪拌培養(yǎng)，得反應(yīng)液10600l。反應(yīng)液中d-酒石酸含量為7.0%。(W/V)，順式環(huán)氧琥珀酸對d-酒石酸的克分子轉(zhuǎn)化率為92.5%。
采用如實例1同樣的分離精制方法，得到d-酒石酸結(jié)晶124kg，60%(W/V)含量的d-酒石酸母液約480l，總得率為59.8%。產(chǎn)品經(jīng)測定其比旋光度〔α〕20℃D＝+12.2℃(20%(W/V))，含量為99.7%。
d-酒石酸最初是由葡萄酒的付產(chǎn)物-酒石中提煉獲得的。由于受原料來源的限制，不能滿足市場需求。后來出現(xiàn)了化學(xué)合成法和微生物直接發(fā)酵法。采用化學(xué)合成法生產(chǎn)的d-酒石酸中往往混有其光學(xué)異構(gòu)體l-酒石酸。用微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)d-酒石酸，發(fā)酵液中異性物質(zhì)多，提取困難，收率低，很難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明采用可大量供給的順式環(huán)氧琥珀酸為原料，在微生物的作用下，專一地、高效率地將其轉(zhuǎn)化成d-酒石酸，所生產(chǎn)的酒石酸為純的天然酒石酸，安全可靠，并且在技術(shù)上和經(jīng)濟(jì)上通過了工業(yè)規(guī)模試驗。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物生產(chǎn)d-酒石酸的方法，它包括a.首先，用添加順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的微生物；b.然后，在上述微生物培養(yǎng)物或其處理物中加入順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽，經(jīng)酶催化反應(yīng)，生成d-酒石酸或其鹽；c.接著，采用鈣鹽沉淀或離子交換的分離方法，分離提取反應(yīng)物中的d-酒石酸；其特征在于d.所說a和b中的微生物是具有同化順式環(huán)氧琥珀酸能力的節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)微生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物生產(chǎn)d-酒石酸的方法，它包括首先，用添加順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的微生物；然后在上述微生物培養(yǎng)物或其處理物中加入順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽，經(jīng)酶催化反應(yīng)，生成d-酒石酸，或其鹽；接著，采用鈣鹽沉淀或離子交換的分離方法，分離提取反應(yīng)物中的d-酒石酸。所說的微生物是具有同化順式環(huán)氧琥珀酸能力的節(jié)桿菌屬微生物。本發(fā)明生產(chǎn)的酒石酸，為純天然酒石酸，安全可靠，并且通過工業(yè)規(guī)模試驗。
文檔編號C12P7/46GK1081714SQ9210893
公開日1994年2月9日 申請日期1992年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月30日
發(fā)明者張建國, 劉曉婷 申請人:浙江大學(xué)