專(zhuān)利名稱：利用△6-去飽和酶生產(chǎn)γ亞麻酸的制作方法
亞油酸(18∶2)(LA)經(jīng)△6-去飽和酶的作用轉(zhuǎn)變成γ亞麻酸(18∶3)(GLA)。當(dāng)△6-去飽和酶或者是編碼這種酶的核酸被轉(zhuǎn)入到產(chǎn)LA的細(xì)胞中后即可產(chǎn)生GLA。本發(fā)明提供了含有△6-去飽和酶基因的核酸。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的核酸包括△6-去飽和酶基因的啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止區(qū)。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及含有與異源調(diào)節(jié)順序進(jìn)行功能性結(jié)合的△6-去飽和酶編碼區(qū)的重組構(gòu)建體。本發(fā)明的核酸和重組體構(gòu)建體可用在轉(zhuǎn)基因生物體中生產(chǎn)GLA。
不飽和脂肪酸，如亞油酸(C18△9，12)和α-亞麻酸(C18△9，12，15)是每日食物攝入的必需成分，它不能被脊椎動(dòng)物自身合成，因?yàn)榧棺祫?dòng)物細(xì)胞只能在脂肪酸的△9位置引入雙鍵，但不能在△9雙鍵和脂肪酸鏈的甲基末端之間引入另外雙鍵。亞油酸和α-亞麻酸是其它產(chǎn)物的前體，所以它們是必需脂肪酸，并且通常是從植物中獲取。亞油酸可以由哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)變?yōu)棣?亞麻酸(GLA，C18△6，9，12)，再轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉ南┧?20∶4)?；ㄉ南┧崾且环N相當(dāng)重要的脂肪酸，因?yàn)樗谴蠖鄶?shù)前列腺素必不可少的前體。
通過(guò)轉(zhuǎn)變?yōu)镚LA和花生四烯酸，亞油酸食品中滿足了食物中的GLA和花生四烯酸的需要。然而，已經(jīng)證明了飽和脂肪酸的消耗和疾病的發(fā)生如高膽固醇血癥、粥樣硬化以及與冠脈疾病易感性相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)紊亂之間的關(guān)系。而消耗不飽和脂肪與血膽固醇的降低有關(guān)，患粥樣硬化的危險(xiǎn)性就減小。GLA飲食的治療性優(yōu)點(diǎn)來(lái)自于GLA可作為花生四烯酸的前體，繼而有助于前列腺素的合成。因此，更多的不飽和的GLA而不是亞油酸將益于健康，但是，在任何商業(yè)性生產(chǎn)的谷類(lèi)植物中實(shí)際上都不存在GLA。
亞油酸在△6-去飽和酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镚LA?！?-去飽和酶具有約359個(gè)氨基酸，有一個(gè)膜結(jié)合區(qū)和一個(gè)脂肪酸去飽和作用的活化位點(diǎn)。當(dāng)△6-去飽和酶轉(zhuǎn)入一個(gè)本身只產(chǎn)生亞油酸而不產(chǎn)生GLA的細(xì)胞中時(shí)，該細(xì)胞就可以產(chǎn)生GLA。本發(fā)明通過(guò)提供△6-去飽和酶的基因編碼，產(chǎn)生含有功能性△6-去飽和酶并產(chǎn)生GLA的轉(zhuǎn)基因生物體。除了產(chǎn)生大量的GLA外，本發(fā)明還提供了新的GLA飲食來(lái)源。
本發(fā)明涉及一種被分離的△6-去飽和酶基因，具體地說(shuō)，這種被分離的基因含有△6-去飽和酶啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止密碼區(qū)。
本發(fā)明還涉及含有△6-去飽和酶啟動(dòng)子、編碼區(qū)、終止密碼區(qū)的表達(dá)載體。
本發(fā)明還涉及包括△6-去飽和酶編碼區(qū)與外源調(diào)節(jié)區(qū)即非源于△6-去飽和酶基因的單元進(jìn)行功能性結(jié)合的表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明載體的細(xì)胞和生物體以及這類(lèi)生物體的子代。
本發(fā)明還提供了被分離的細(xì)菌性△6-去飽和酶，進(jìn)一步還涉及被分離的編碼細(xì)菌性△6-去飽和酶的核酸。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生增高γ-亞麻酸(GLA)含量的植物的方法，通過(guò)用本發(fā)明的分離的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及用上述高GLA含量的植物細(xì)胞再生植物。
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生耐寒植物的方法。


圖1描繪了集胞藻屬菌(synechocystis)△6-去飽和酶(圖1A)和△12-去飽和酶(圖1B)的推測(cè)氨基酸順序的水療法圖。用實(shí)線表示推測(cè)的膜距區(qū)(membranespanningregions)。用19個(gè)氨基酸殘基的窗格大小計(jì)算疏水指數(shù)(kyte，etal，1982，J.Molec.Biol.157)。
圖2表示野生型魚(yú)腥藻屬細(xì)菌(圖2A)和轉(zhuǎn)基因魚(yú)腥藻屬細(xì)菌(圖2B)的氣液色譜圖。
圖3是帶有重疊區(qū)和亞克隆的粘性質(zhì)粒cSy75、cSy13和cSy7的簡(jiǎn)圖。cSy75、cSy75-3.5和cSy7的亞克隆的起始點(diǎn)用帶斜條的框線表示。還末被活化的限制性位點(diǎn)寫(xiě)在括號(hào)內(nèi)。
圖4表示野生型(圖A)和轉(zhuǎn)移基因型煙草(圖B)的氣液色譜圖。
本發(fā)明提供了一種分離的編碼△6-去飽和酶的核酸，為了鑒定編碼△6-去飽和酶的核酸，從能產(chǎn)生GLA的生物體中分離DNA。例如，所說(shuō)的生物體可以是動(dòng)物細(xì)胞、某些真菌(如被孢霉屬)，某些細(xì)菌(例如集胞藻屬)或某些植物(琉璃苣、月見(jiàn)草屬、茶藨子屬植物)?；駾NA的分離可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法進(jìn)行，例如用Sambrook等人舉證的方法(MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，NY.1989)。用物理方法或酶消化作用將分離的DNA裂解，然后再通過(guò)參考文獻(xiàn)中的(例如Sambrooketal，1989)各種已知方法把裂解片段克隆到合適的載體中，如噬菌體或粘性質(zhì)粒載體。本文特別設(shè)計(jì)了含有本發(fā)明DNA的表達(dá)載體。通過(guò)獲得的功能性分析結(jié)果鑒定編碼△6-去飽和酶的DNA。含有裂解的DNA片段的載體通過(guò)感染、轉(zhuǎn)結(jié)合和轉(zhuǎn)染等方式轉(zhuǎn)移到產(chǎn)亞油酸但不產(chǎn)GLA的宿主生物體中。本文所說(shuō)的“轉(zhuǎn)化”通常指的是將外源DNA摻入到宿主細(xì)胞中，將重組DNA導(dǎo)入宿主生物體中的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。例如可以參考的文獻(xiàn)有Sambrooketal.，1989。這些有機(jī)體的GLA的生產(chǎn)(如功能的獲得)諸如氣液色譜圖或其它普通技術(shù)人員所熟悉的方法鑒定。
經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生GLA的生物體，亦即通過(guò)載體的導(dǎo)入而獲得上述功能的生物體被證明為表達(dá)了編碼△6-去飽和酶的DNA，再?gòu)纳矬w中回收所說(shuō)的DNA?；厥盏腄NA可再次裂解，用表達(dá)載體進(jìn)行克隆，并用上述過(guò)程進(jìn)行功能性評(píng)估，以便更為精確地弄清楚編碼△6-去飽和酶的DNA。
本發(fā)明的一個(gè)例子是從藍(lán)藻細(xì)菌集胞藻屬菌(PasteurCultureCollection，(PCC)6803，AmericanTypeCultureCollection，(ATCC)27184)中分離隨機(jī)的DNA，克隆到粘性質(zhì)粒載體中，并通過(guò)轉(zhuǎn)結(jié)合作用導(dǎo)入到GLA缺陷的藍(lán)藻細(xì)菌魚(yú)腥藻屬菌菌株P(guān)CC7120，ATCC27893中。用氣相色譜監(jiān)測(cè)從魚(yú)腥藻屬菌的亞油酸生成GLA，并分離相應(yīng)的DNA片段。
用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法，例如Sambrook等人(1989)描述的方法對(duì)分離的DNA排序。
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)分離了含有△6-去飽和酶基因的DNA。更具體是說(shuō)，一段含有△6-去飽和酶基因的3.588kb的DNA已從藍(lán)藻細(xì)菌集胞藻屬菌中分離出來(lái)。測(cè)定3.588kbDNA的核苷酸順序并示于SEQIDNO1中。表明有效編碼區(qū)的開(kāi)放讀碼存在于核苷酸317-1507和核苷酸2002-3081。為了明確負(fù)責(zé)編碼△6-去飽和酶的核苷酸，把提供△6-去飽和酶活性的3.588kb片段裂解為二個(gè)亞片段，其中的每一個(gè)亞片段都僅含有一個(gè)開(kāi)放讀碼。片段ORF1含有核苷酸1-1704，片段ORF2含有核苷酸1705-3588。每一個(gè)片段都以向前和逆向兩種方向亞克隆到結(jié)合的表達(dá)載體中(AM542，Wolk et al，1984 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1561)，該載體含有一種藍(lán)藻細(xì)菌羧化酶啟動(dòng)子。所得到的構(gòu)建體[即ORF1(F)，ORF1(R)，ORF2(F)和ORF2(R)]通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如參見(jiàn)Wolk，et al，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1561)結(jié)合到野生型魚(yú)腥藻屬菌PCC7120中。在選擇性培養(yǎng)基(含有30ug/ml新霉素的標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)培養(yǎng)基BG11N，參見(jiàn)Rippka et al，1979，J.Gen Microbiol.111，1)生長(zhǎng)二周后，從死亡的非結(jié)合性細(xì)胞的棕色背景中被結(jié)合的魚(yú)腥藻屬細(xì)胞為NeoR綠色菌落。篩選出綠色菌落，并在選擇性液體培養(yǎng)基(含有15ug/ml新霉素的BG11N)中生長(zhǎng)。用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如Dahmer et al，1989，Journal of American Oil Chemical Society 66，543)從所得的含有向前和逆向定位的ORF1和ORF2構(gòu)建體的轉(zhuǎn)結(jié)合體中提取脂類(lèi)，作為對(duì)比，同樣也從魚(yú)腥藻屬菌和集胞藻屬菌的野生型培養(yǎng)物中提取脂類(lèi)。通過(guò)氣液色譜(GLC)，例如用裝有氫火焰電離檢測(cè)器和毛細(xì)管柱的Tracor-560氣液色譜分析脂肪酸甲基酯。GLC分析結(jié)果示于表1中。
表1野生型和轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻細(xì)菌中C18脂肪酸來(lái)源18:018:118:2γ18:3α18:318:4魚(yú)腥藻屬菌(野生型)+++-+-魚(yú)腥藻屬菌+ORF1(F)+++-+-魚(yú)腥藻屬菌+ORF1(R)+++-+-魚(yú)腥藻屬菌+ORF2(F)++++++魚(yú)腥藻屬菌+ORF2(R)+++-+-集胞藻屬菌(野生型)++++--如GLC分析所確定的，當(dāng)含有以向前方向定位的ORF2的構(gòu)建體通過(guò)轉(zhuǎn)結(jié)合，GLA缺陷的魚(yú)腥藻屬菌便獲得了生產(chǎn)GLA的功能。帶有以相對(duì)于羧化酶啟動(dòng)子而言相反的方向定位的ORF2或以正或反兩個(gè)方向定位的ORF1的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)結(jié)合體未顯示出GLA的生成。這一分析結(jié)果表明，位于1884bp片段中的單個(gè)開(kāi)放讀碼編碼△6-去飽和酶。1884bp片段示于SEQ.IDNO3中。這也分別由示于圖1(A)和(B)中的△6-去飽和酶和△12-去飽和酶[Wadaetal，1990，Nature，347]之間水療法圖完全相似性所證實(shí)。
通過(guò)上述功能性分析，或通過(guò)用分離編碼魚(yú)腥藻屬菌△6-去飽和酶的核酸作為雜交探針的核酸雜交技術(shù)從其它的產(chǎn)GLA生物體鑒定分離的編碼△6-去飽和酶的核酸。本發(fā)明設(shè)想的基因組克隆和cDNA克隆的方法是技術(shù)人員已知的。雜交探針可以含有公開(kāi)于SEQIDNO1中的完整DNA序列或者是限制性片段或是其它的DNA片段，包括寡核苷酸探針，用交叉雜交來(lái)克隆同源基因的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如可見(jiàn)于Sambrook(1989)和Beltzetal，1983，MethodsinEnzymology100，266。
通過(guò)導(dǎo)入編碼△6-去飽和酶DNA而獲得生產(chǎn)GLA功能的轉(zhuǎn)基因生物體也獲得了產(chǎn)十八碳四烯酸(octadecatetraenoicacid)(18∶4△6，9，12，15的功能。十八碳四烯酸(Octadecate-traenoicacid)正常存在于魚(yú)油和紫草科的一些植物種中(Craigetal，1964，J.Amer.OilChem.Soc.41，209-211;Grossetal;1976，Can.J.PlantSci.56，659-664)。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體中，十八碳四烯酸是在△6-去飽和酶的作用下α-亞麻酸進(jìn)一步去飽和或是在△15-去飽和酶作用下GLA進(jìn)一步去飽和而得到的。
由ORF2編碼的359個(gè)氨基酸，即編碼△6-去飽和酶的開(kāi)放讀碼用SEQ.I NO2表示.本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)想了編碼SEQ ID NO2的氨基酸的其它核苷酸順序。鑒定例如由遺傳密碼簡(jiǎn)并性而產(chǎn)生的這類(lèi)順序是普通專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員已知的，而且，通過(guò)上述得到的功能性分析，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能確定含有編碼△6-去飽和酶的ORF2的1884bp片段的更次一級(jí)片段。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了任何△6-去飽和酶多肽片段以及保留有將LA轉(zhuǎn)變成GLA活性的核酸。
在本發(fā)明的另外一方面，含有1884bp片段的載體或含有△6-去飽和酶基因啟動(dòng)子、編碼順序和終止區(qū)的更小的片段被轉(zhuǎn)移到一種生物體中，例如藍(lán)藻細(xì)菌中，在所說(shuō)的生物體中，△6-去飽和酶啟動(dòng)子和終止區(qū)是能發(fā)揮功能的。因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組的△6-去飽和酶的生物體。另外一方面，本發(fā)明提供了分離的△6-去飽和酶，它能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)(例如可參見(jiàn)Ausubeletal，1987，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenPublishingAssociates，NewYork)從重組生物體中純化出來(lái)。
本發(fā)明還提供了含有編碼△6-去飽和酶的DNA的載體。在各種生物體中構(gòu)建適合的載體指導(dǎo)表達(dá)△6-去飽和酶編碼順序是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。特別優(yōu)選的是可復(fù)制性表達(dá)載體，本文所述的可復(fù)制性表達(dá)載體指的是經(jīng)過(guò)處理的用于調(diào)控目的基因即△6-去飽和酶基因表達(dá)的DNA或RNA的分子。優(yōu)選的載體是質(zhì)粒、噬菌體、粘性質(zhì)?；虿《?。諸如wolketal.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1561-1565和Bustosetal(1991)J.Bacteriol.174，7525-7533所述的往復(fù)性載體證實(shí)與本發(fā)明相符。一些文獻(xiàn)(Sambrooketal，(1989);Goeddel，ed.(1990)MethodsinEnzymology185AcademicPress;Perbal1988，APracticalGuidetoMolecularCloning，JohnWileyandSons，Inc.)對(duì)能夠插入和表達(dá)編碼所說(shuō)△6-去飽和酶核酸的載體進(jìn)行了詳細(xì)論述。這類(lèi)載體還含有能有效表達(dá)編碼△6-去飽和酶核酸的核酸順序。能夠有效進(jìn)行基因產(chǎn)物表達(dá)的順序單元包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子成分;上游活化順序、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多腺苷酸化位點(diǎn)，基本的和組織特異性的啟動(dòng)子本發(fā)明都考慮到了。為了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，花椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動(dòng)子和在植物種子突變過(guò)程中被調(diào)整過(guò)的啟動(dòng)子都特別值得感興趣。所有這類(lèi)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)成分的單個(gè)體或結(jié)合體用于本發(fā)明的可復(fù)制性表達(dá)載體，并為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解。例如Restrepo等人(PlantCell，2，987，1990)描述過(guò)CaMV35S啟動(dòng)子。還設(shè)計(jì)了經(jīng)遺傳工程處理的和遺傳突變的調(diào)節(jié)順序。
普通的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員能夠決定適于在特定宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的載體和調(diào)節(jié)成分。例如，含有來(lái)自編碼魚(yú)腥藻屬菌的羧化酶基因啟動(dòng)子的載體可連接到△6-去飽和酶編碼區(qū)，并進(jìn)一步可連接到來(lái)自集胞藻屬菌的終止信號(hào)，這些載體在藍(lán)藻細(xì)菌中適合△6-去飽和酶的表達(dá)。本文中的“可連接”(Operablylinked)指的是啟動(dòng)子和終止子順序有效地發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。另一個(gè)例子是適于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)△6-去飽和酶的載體能含有一個(gè)衍生于半日花素。napin或glycin種子特異性的啟動(dòng)子順序，該啟動(dòng)子可連接到△6-去飽和酶編碼區(qū)，并進(jìn)一步可行性連接到種子終止信號(hào)或nopaline合成酶終止信號(hào)。
本發(fā)明特別考慮了將半日花素(helianthinin)調(diào)節(jié)成分作為指導(dǎo)本發(fā)明△6-去飽和酶表達(dá)的啟動(dòng)子成分，調(diào)節(jié)成分在申請(qǐng)?zhí)枮?28、354申請(qǐng)日為1991，4，8的美國(guó)末決申請(qǐng)中公開(kāi)，該申請(qǐng)并入本文作為參考。
對(duì)本文公開(kāi)的核苷酸順序或具有所設(shè)計(jì)功能的調(diào)節(jié)成分的修飾也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這類(lèi)修飾作用包括插入、替代和缺失以及反映遺傳密碼簡(jiǎn)并性的特異性替代。
構(gòu)建這種雜交載體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并可參見(jiàn)文獻(xiàn)，如Sambrooketal，1989或大量可隨處可得的關(guān)于重組DNA技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。多種設(shè)計(jì)可用于DNA片段的連接，所做的選擇取決于DNA片段的末端性質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明，雜交載體包括便于克隆、表達(dá)或加工的其它核苷酸順序成分，例如編碼信號(hào)肽的順序，編碼使蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留所要求的KDEL的順序，或是編碼引導(dǎo)△6-去飽和酶進(jìn)入葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的順序。這些順序是本領(lǐng)域普通專(zhuān)業(yè)人員已知的。例如，VandenBroeck等人(Nature313，358，1985)已描述過(guò)比較理想的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。又如，Michaelis等人(Ann.Rev.Microbiol，36，425，1982)公開(kāi)了原核的和真核的信號(hào)順序。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供了含有編碼本發(fā)明的△6-去飽和酶DNA的生物體而不是藍(lán)藻細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的設(shè)計(jì)，轉(zhuǎn)基因生物體包括細(xì)菌、藍(lán)藻細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物。本發(fā)明分離的DNA可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)已知的方法，如感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)結(jié)合而導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。將本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移到上述生物體中的技術(shù)是普遍知曉的，可見(jiàn)于參考文獻(xiàn)中，如Sambrooketal，1989。
已知多種植物轉(zhuǎn)化方法。根據(jù)Horsch等人(Science227，1229，1985)描述的葉花盤(pán)轉(zhuǎn)化一再生方法可將△6-去飽和酶基因?qū)氲街参镏?。其它的轉(zhuǎn)化方法，如原生質(zhì)體培養(yǎng)(Horschetal，1984，Science223，496;DeBlocketal(1984)EMBOJ.2，2143，Bartonetal，(1983)Cell32，(1033)也可以應(yīng)用，且包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用土壤桿菌衍生的載體轉(zhuǎn)化植物。而且，其它的方法可用來(lái)將本發(fā)明的△6-去飽和酶基因插入到植物細(xì)胞中。這類(lèi)可選擇的方法包括biolistic方法(Kleinetal，1987，Nature327，70)、電穿孔、化學(xué)誘導(dǎo)DNA攝入以及用病毒或花粉作為載體的應(yīng)用。
當(dāng)轉(zhuǎn)化的方法需要時(shí)，本發(fā)明的△6-去飽和酶基因可以插入到植物轉(zhuǎn)化載體中，例如Bevan(1984，NucleicAcidsRes.12，8111)描述過(guò)的二元載體。植物轉(zhuǎn)化載體可以通過(guò)修飾根癌土壤桿菌的天然基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)行衍生，天然系統(tǒng)包括含有稱作T-DNA的大片段的大Ti(腫瘤誘生性)質(zhì)粒，它可被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物中。Ti質(zhì)粒的另外一個(gè)片段Vir區(qū)是負(fù)責(zé)T-DNA轉(zhuǎn)移的。T-DNA區(qū)是由末端重復(fù)區(qū)接界的。在經(jīng)修飾的二元載體中，缺失了腫瘤誘導(dǎo)基因，并利用Vir區(qū)的功能轉(zhuǎn)移由T-DNA邊界順序接界的外源DNA。T區(qū)還含有一個(gè)用于抗生素抗性的可選擇性標(biāo)記和一個(gè)作為轉(zhuǎn)移的插入順序的多克隆位點(diǎn)。這種工程菌被稱為“去武裝”根癌土壤桿菌菌株，并且允許由T-區(qū)接界的順序的有效轉(zhuǎn)化到植物的核基因組中。表面無(wú)菌的葉花盤(pán)與去武裝的含外源DNA的根癌土壤桿菌一起孵育，培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)移到含抗生素的培養(yǎng)基中。當(dāng)培養(yǎng)物在含有合適的抗生素的培養(yǎng)基中生根之后，篩選被轉(zhuǎn)化的嫩芽，再轉(zhuǎn)移到泥土中進(jìn)行再生。
本發(fā)明的另一方面是提供了含有本發(fā)明分離的DNA的轉(zhuǎn)基因植物或這些植物的子代，單子葉和雙子葉植物都考慮到了。借助上述任何一種植物轉(zhuǎn)化方法分離的編碼△6-去飽和酶的DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞通常是在胼胝體培養(yǎng)物或葉花盤(pán)中，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如，Horschetal，1985，Science，227，1129)再生成一個(gè)完全的轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是向日葵、油籽油菜、玉米、煙草、花生或大豆。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植物的子代遺傳編碼△6-去飽和酶DNA，得自被轉(zhuǎn)化植物的種子或插技常用于保持轉(zhuǎn)基因的植物系。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)GLA含量提高了的轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法包括將編碼△6-去飽和酶的DNA導(dǎo)入缺乏GLA或GLA水平較低但含有LA的植物細(xì)胞中，和從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生提高了GLA含量的植物。特別考慮了商業(yè)性生產(chǎn)的農(nóng)作物植物作為轉(zhuǎn)基因生物體，它包括但不限于向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生和煙草。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)含有GLA轉(zhuǎn)基因生物體的方法。該方法包括將編碼△6-去飽和酶DNA導(dǎo)入缺乏GLA或具有低水平GLA但含有LA的生物體中，在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將含有編碼△12-去飽和酶和△6-去飽和酶DNA的一種或多種表達(dá)載體導(dǎo)入缺乏GLA和LA的生物體中。因此，通過(guò)表達(dá)△12-去飽和酶，在缺乏LA和GLA的生物體中誘導(dǎo)LA的產(chǎn)生，然后因△6-去飽和酶的表達(dá)而產(chǎn)生GLA。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組技術(shù)方法(Sambrook，etal，1989)和已公開(kāi)的△12-去飽和酶順序(Wadaetal，1990，Nature347，200-203)可以構(gòu)建含有編碼△12-去飽和酶或是含有編碼△12-去飽和酶和△6-去飽和酶的DNA的表達(dá)載體。
此外，根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)SEQ.IDNO1的核苷酸2002-3081編碼藍(lán)藻細(xì)菌的△12-去飽和酶，據(jù)此。該順序能用于構(gòu)建有關(guān)本題的表達(dá)載體。特別考慮于商業(yè)性生產(chǎn)的農(nóng)作物植物的作為轉(zhuǎn)基因生物體，它包括但不限于向日葵、大豆、油籽菜油、玉米、花生和煙草。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種在植物中誘導(dǎo)抗寒力的方法。寒冷敏感性可能產(chǎn)生于細(xì)胞膜中脂質(zhì)的相變。膜脂中相變溫度取決于脂肪酸的不飽和度。因此，通過(guò)導(dǎo)入△6-去飽和酶使LA轉(zhuǎn)變成GLA以增加不飽和度即可誘生或改善抗寒能力。鑒此，本發(fā)明的方法包括將編碼△6-去飽和酶的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，并從所說(shuō)的被轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生改善了抗寒力的植物，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說(shuō)的植物是向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生或煙草。
下面的實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1菌株和培養(yǎng)條件集胞藻屬菌(PCC 6803，ATCC 27184)、魚(yú)腥藻屬菌(PCC 7120，ATCC 27893)和聚胞藻屬菌(Synechococcus)(PCC 7942，ATCC 33912)置BG11N+培養(yǎng)基(Rippka et al，1979，J.Gen.Microbiol.111，1-61)中在白熾燈照明條件下(60μE·m-2·s-1)于30℃行光能自養(yǎng)性生長(zhǎng)。選擇粘性質(zhì)粒和質(zhì)粒并使之在Maniatisetal，(1982)[MolecularCloningALaboratoryManual，ColdspringHarborLaboratory，ColdSpring，NewYork]等人所描述的在標(biāo)準(zhǔn)濃度的含抗生素的LB介質(zhì)的大腸桿菌菌株DH5α中生長(zhǎng)。
實(shí)施例2集胞藻屬菌粘性質(zhì)?；蚪M文庫(kù)的構(gòu)建用Sau3A部分消化得自集胞藻屬菌(PCC6803)的總的基因組DNA，并在蔗糖梯度上進(jìn)行分離(Ausubeletal，1987，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscinec，NewYork).篩選含有30-40kbDNA片段的餾份，并連接到粘性質(zhì)粒載體的脫磷酸BamHI位點(diǎn)PDUCA7(Buikemaetal(1991)J.Bacteriol.173，1879-1885)。如Ausubel等人所述(1987)在體外包裝連接的DNA，并包裝的噬菌體在含有AVal和E-co4711甲基酶輔助質(zhì)粒pRL528(Buikemaetal.1991)的E.Col-iDH5α中繁殖。隨機(jī)分離共1152克隆，并單個(gè)維持于12個(gè)96孔微量滴定板中。
實(shí)施例3魚(yú)腥藻屬菌獲得表達(dá)GLA的功能魚(yú)腥藻屬菌(PCC 7120)是一種花絲狀藍(lán)藻細(xì)菌，缺乏GLA但含有足夠量的生成GLA的前體亞油酸(圖2;表2)。實(shí)施例2中所述的集胞藻屬菌粘性質(zhì)粒文庫(kù)結(jié)合到魚(yú)腥藻屬菌(PCC 7120)中，鑒定生產(chǎn)GLA的轉(zhuǎn)結(jié)合體。在BG11N+液態(tài)介質(zhì)中，魚(yú)腥藻屬菌細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期，之后在相同介質(zhì)中懸浮至終濃度約2×108細(xì)胞/ml。生長(zhǎng)于含氨芐青霉素的LB中的E.Coli Rp4(Burkardt et al，1979，J Gen.Microbiol.114.341-348)對(duì)數(shù)中期培養(yǎng)物經(jīng)洗滌后重懸于新鮮的LB培養(yǎng)基中。然后將魚(yú)腥藻屬菌與RP4混合，并均勻地分散于含有5%LB的BG11N+平板上。粘性質(zhì)?；蚪M文庫(kù)經(jīng)平板印影培養(yǎng)到含50μg/ml卡那霉素和17.5μg/ml氯霉素的LB平板上，繼爾將上述培養(yǎng)物切成小片置于含有魚(yú)腥藻屬菌和RP4和BG11N+平板上，于30℃孵育24小時(shí)后，30μg/ml的新霉素加至平板底層于30℃繼續(xù)孵育直至出現(xiàn)轉(zhuǎn)結(jié)合體。
結(jié)合作用完成后分離單個(gè)的轉(zhuǎn)結(jié)合體，并置于含15μg/ml新霉素的2ml BG11N+液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。如下所述，從野生型培養(yǎng)物和含有10個(gè)轉(zhuǎn)結(jié)合體庫(kù)的培養(yǎng)物中制備脂肪酸甲基酯。通過(guò)離心收集野生型和轉(zhuǎn)基因型藍(lán)藻細(xì)菌培養(yǎng)物。用蒸餾水洗滌二次。按Dahmer等人所述方法(1989，J.Amer.Oil Chem.Soc.66，543-548)從這些培養(yǎng)物中提取脂肪酸甲基酯，并通過(guò)氣液色譜(GLC)用裝有氫火焰電離檢測(cè)儀和毛細(xì)管柱(30m×0.25mm，結(jié)合了FSOT Superox Ⅱ，Alltech AssociateInc.，IL)的Tra-cor-560進(jìn)行分析。以滯留時(shí)間和標(biāo)樣(得自Sigma化學(xué)公司)的共同色譜分析來(lái)鑒定脂肪酸。平均脂肪酸組成通過(guò)各個(gè)C18脂肪酸峰值區(qū)與內(nèi)標(biāo)區(qū)的比值歸一化確定。
有代表性的GLC圖譜示于圖2中，還顯示了C18脂肪酸甲基酯。通過(guò)與已知的脂肪酸甲基酯標(biāo)準(zhǔn)物的洗脫時(shí)間進(jìn)行比較鑒別出各個(gè)峰，并用氣相色譜質(zhì)譜光譜測(cè)定法進(jìn)行證實(shí)。圖2(A)描述了野生型魚(yú)腥藻屬菌脂肪酸的GLC分析。箭頭表示GLA的遷移時(shí)間。圖2(B)是帶有pAM542+1.8F的魚(yú)腥藻屬菌轉(zhuǎn)結(jié)合體脂肪酸的GLC圖譜。證明了2個(gè)產(chǎn)GLA庫(kù)(從代表250個(gè)轉(zhuǎn)結(jié)合體的25個(gè)庫(kù)中)能產(chǎn)生GLA。對(duì)每個(gè)GLA陽(yáng)性庫(kù)的單個(gè)轉(zhuǎn)結(jié)合體進(jìn)行產(chǎn)GLA的分析，兩個(gè)來(lái)自不同庫(kù)的獨(dú)立的轉(zhuǎn)結(jié)合體AS13和AS75被鑒定為能表達(dá)很高水平的GLA并分別含有粘性質(zhì)粒cSy13和cSy75(圖3)。粘性質(zhì)粒在約7.5kb長(zhǎng)度的區(qū)域重疊。cSy75的一個(gè)3.5kbNheI片段再克隆入載體pDUCA7中，并轉(zhuǎn)移到魚(yú)腥藻屬菌中從而獲得GLA表達(dá)功能(圖2)。
cSy75-3.5的3.5kbNheI片段的兩個(gè)NheI/HindⅢ亞片段(1.8和1.7kb)被亞克隆到“pBLUESCRIPT”中(Stratagene)(圖3)用于測(cè)序。按照Maniatis等人(1982)和Ausubel等人(1987)所述的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)操作。通過(guò)用AdvaneedDNATechnologiesLaboratory(BiologyDepartment，TexasA&MUniversity)合成特殊的低聚核苷酸引物用“SEQUENASE”(UnitedStatesBiochemical)進(jìn)行pBS1.8的雙鏈雙脫氧測(cè)序(Sangeretal.1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-5467)。用Devereux等人(1984，NucleicAcidsRes.12.387-395)描述的GCG(MadisonWI)軟件進(jìn)行DNA序列分析。
兩個(gè)NheⅠ/HindⅢ片段都以相對(duì)于藍(lán)藻細(xì)菌羧化酶啟動(dòng)子的向前和逆向兩個(gè)方向轉(zhuǎn)移到結(jié)合性表達(dá)載體AM542中，再經(jīng)結(jié)合作用導(dǎo)入魚(yú)腥藻屬菌。含有向前方向定位的1.8kb片段(AM542-1.8F)的轉(zhuǎn)結(jié)合體產(chǎn)生大量的GLA和十八碳四烯酸，(圖2，表2)。含有其它構(gòu)建體(無(wú)論是逆向定位的1.8kb片段還是向前和逆向定位的1.7kb片段)的轉(zhuǎn)結(jié)合體不能產(chǎn)生可檢測(cè)水平的GLA(表2)。
圖2將從野生型魚(yú)腥藻屬菌中提取的C18脂肪酸圖譜(圖2A)與含有向前方向定位的cSy75-3.5的1.8kb片段的轉(zhuǎn)基因魚(yú)腥藻屬菌提取物中的C18脂肪酸圖譜(圖2B)進(jìn)行了比較。得自AM542-1.8F的脂肪酸甲基酯的GLC分析顯示了一個(gè)與可靠的GLA標(biāo)準(zhǔn)物滯留時(shí)間一致的峰。經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜光譜測(cè)定法進(jìn)行的有關(guān)該峰的分析證實(shí)，它的質(zhì)譜裂解方式與GLA參照樣品的相同。改變了多不飽和脂肪酸含量的轉(zhuǎn)基因魚(yú)腥藻屬菌在生長(zhǎng)速度和形態(tài)學(xué)方面與野生型魚(yú)腥藻屬菌相似。
表2野生型和轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻細(xì)菌中C18脂肪酸的比較脂肪酸菌株18:018:118:218:3(α)18:3(γ)18:4野生型集胞藻屬菌(PCC 6803)13.64.554.5-27.3-魚(yú)腥藻屬菌(PCC 7120)2.924.837.135.2--聚胞藻屬(藍(lán)藻)(PCC 7942)20.679.4----魚(yú)腥藻屬菌轉(zhuǎn)結(jié)合體cSy753.824.422.39.127.912.5cSy75-3.54.327.618.13.240.46.4pAM542-1.8F4.213.912.119.125.425.4pAM542-1.8R7.723.138.430.8--pAM542-1.7F2.827.836.133.3--pAM542-1.7R2.825.442.329.6--聚胞藻屬菌轉(zhuǎn)結(jié)合體pAM85427.872.2----pAM854-△124.043.246.0---pAM854-△618.281.8----pAM854-△6和△1242.725.319.5-16.5-18∶0，硬脂酸;18∶1，油酸;18∶2，亞油酸;18∶3(α)，α-亞麻酸，18∶3(γ)，γ-亞麻酸;18∶4，十八碳四烯酸。
實(shí)施例4用△6和△12去飽和酶基因轉(zhuǎn)化聚胞藻屬用根據(jù)公開(kāi)的集胞藻屬菌△12-去飽和酶基因順序(Wada et al，1990，Nature，347，200-203)合成的寡核苷酸篩選集胞藻屬菌基因組文庫(kù)，分離到含有△12-去飽和酶基因的第三種粘性質(zhì)粒cSy7。得自含有△12去飽和酶基因的這種粘性質(zhì)粒的1.7kb AvaI片段被鑒定并用作探測(cè)器測(cè)定cSy13，測(cè)定表明cSy13不僅含有△6-去飽和酶基因，而且含有△12-去飽和酶基因(圖3)?；蚪M的Southern吸印分析進(jìn)一步表明?！?和△12去飽和酶基因兩者在集胞藻屬菌基因組中是唯一的，所以兩種涉及C18脂肪酸去飽和作用的功能性基因緊密連接在集胞藻屬菌基因組中。
單細(xì)胞藍(lán)藻細(xì)菌聚胞藻屬菌(PCC7942)缺乏亞油酸和GLA(3)?！?2和△6去飽和酶基因被單個(gè)和一起克隆穿梭載體pAM854(Bustosetal，1991，J.Bacteriol.174，7525-7533)中，該載體含有將外源DNA整合到聚胞藻屬菌基因組中所需的順序(Goldenetal，1987，MethodsinEnzymol.153，215-231)。用這些基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化聚胞藻屬菌并篩選菌落。從轉(zhuǎn)基因聚胞藻屬菌中提取脂肪酸甲基酯，并用GLC進(jìn)行分析。
表2說(shuō)明，野生型聚胞藻屬菌中的主要脂肪酸是硬脂酸(18∶0)和油酸(18∶1)。用pAM854-△12轉(zhuǎn)化的聚胞藻屬菌表達(dá)了除主要脂肪酸以外的亞油酸(18∶2)。帶有pAM854-△6和△12轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)亞油酸和GLA(表1)。這些結(jié)果表明，含有△12和△6-去飽和酶基因的聚胞藻屬菌已經(jīng)獲得了在C18脂肪酸的△12位置上引進(jìn)第二個(gè)雙鏈和在△6位置上引進(jìn)第3個(gè)雙鍵的能力。但是，觀察表明，在含pAM854-△6的轉(zhuǎn)化體中，脂肪酸組成并沒(méi)有變化，這表明，在由△12去飽和酶合成的酶作用物缺乏的情況下，△6去飽和酶不活潑。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明1.8kbNheI/HindⅢ片段(圖3)含有集胞藻屬菌△6-去飽和酶基因的編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)。改變了多不飽和脂肪酸含量的轉(zhuǎn)基因聚胞藻屬菌在生長(zhǎng)速度和形態(tài)學(xué)方面與野生型菌株相似。
實(shí)施例5△6-去飽和酶的核苷酸順序測(cè)定了包括功能性△6-去飽和酶基因的cSy75-3.5的1.8kb片段的核苷酸順序。一個(gè)編碼359個(gè)氨基酸多肽的開(kāi)放讀碼被鑒定(圖4)。由Kyte-Doolittle(Kyteetal.，J.Mol.Biol.157.105-132水療分析鑒定疏水氨基酸的兩個(gè)區(qū)可代表轉(zhuǎn)換膜區(qū)(transmembranedomains)(圖1A)，并且△6-去飽和酶基因與△12-去飽和酶基因(圖1B，Wadaetal.)和△9去飽和酶基因(Thiedeetal.)J.BiolChem.261，13230-13235)的水療圖相似。
但是，集胞藻屬菌的△6-去飽和酶和△12-去飽和酶之間的順序相似性在核苷酸水平小于40%，在氨基酸水平約小于18%。
實(shí)施例6藍(lán)藻細(xì)菌的△6-去飽和酶轉(zhuǎn)移到煙草中將藍(lán)藻細(xì)菌的△6-去飽和酶基因轉(zhuǎn)移到植物表達(dá)載體中，再通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)移到煙草中。為了保證被轉(zhuǎn)移的去飽和酶在葉及發(fā)育的種子中合適地表達(dá)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠素中去飽和基因產(chǎn)物的確定。安裝帶有集胞藻屬菌去飽和酶開(kāi)放讀碼(ORF)的各種表達(dá)盒。這些盒的成分包括(ⅰ)35S啟動(dòng)子或衍生于向日葵半日花素基因的種子特異性啟動(dòng)子，它分別啟動(dòng)△6-去飽和酶基因在所有植物組織中表達(dá)或僅在發(fā)育的種子中表達(dá);(ⅱ)一種推測(cè)的信號(hào)肽，它來(lái)自胡蘿卜延伸蛋白基因或向日葵半日花素基因，引導(dǎo)新合成的△6-去飽和酶進(jìn)入ER;(ⅲ)位于△6-去飽和酶ORF羧基末端的ER腔滯留信號(hào)順序(KDEL);(ⅳ)引導(dǎo)△6-去飽和酶進(jìn)入葉綠體的理想轉(zhuǎn)運(yùn)肽。35S啟動(dòng)子是Restrepo等人(1990)所述質(zhì)粒pRTL2衍生物。VandeBroeck等人(1985)描述了理想的轉(zhuǎn)移肽順序。Chen等人(1985，EMBOJ.9，2145)描述了胡蘿卜延伸蛋白信號(hào)肽。
生產(chǎn)含有嵌合藍(lán)藻細(xì)菌性去飽和酶基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所說(shuō)的嵌合體由融合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留順序(KDEL)中的集胞藻屬菌△6-去飽和酶基因和由CaMv35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的延伸蛋白信號(hào)肽組成。轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)表明△6去飽和酶基因已被摻入到煙草基因組中，從這些轉(zhuǎn)基因煙草植物葉中提取脂肪酸甲基酯，并用氣液色譜(GLC)進(jìn)行分析。這些轉(zhuǎn)基因煙草集聚了大量的GLA(圖4)。圖4表示通過(guò)GLC確定的脂肪酸甲基酯。與已知的脂肪酸甲基酯標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫時(shí)間進(jìn)行比較鑒定出各個(gè)峰。因此，涉及脂肪酸代謝的藍(lán)藻細(xì)菌的基因可用于生產(chǎn)改變了脂肪酸組成的轉(zhuǎn)基因植物。
序列表(1)概況(i)申請(qǐng)人:Thomas,Terry L.
Reddy,Avutu S.
Nuccio,MichaelFreyssinet,Georges L.
(ii)發(fā)明名稱:利用△6-去飽和酶生產(chǎn)γ亞麻酸(iii)順序數(shù)目:3(iv)通信地址:
(A)地址:Scully,Scott,Murphy&Presser(B)街道:400 Garden City Plaza(C)城市:Garden市(D)州:紐約(E)國(guó)家:美國(guó)(F)郵政編碼:11530(V)計(jì)算機(jī)可讀形式:
(A)介質(zhì)類(lèi)型:Floppy盤(pán)(B)計(jì)算機(jī):IBM PC可容性(C)操作系統(tǒng):PC-DOS/MS-DOS(D)軟件:Patent In Release #1. OVersion#1.25(Vi)目前的申請(qǐng)資料:
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(A)姓名:McNulty,Willian E.
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(A)名稱/關(guān)鍵:CDS(B)定位:2002..3081(xi)順序描述:SEQ ID NO:1:
(2)SEQ ID NO:2(i)順序特征:
(A)長(zhǎng)度:359個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類(lèi)型:蛋白質(zhì)(xi)順序描述:SEQ ID NO:2
Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser355(2)SEQ ID NO:3:
(i)順序特征:
(A)長(zhǎng)度:1884bp(B)類(lèi)型:核酸(C)鏈股數(shù):雙(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類(lèi)型:DNA(基因組的)(xi)順序描述:SEQ ID NO:權(quán)利要求
1.一種分離的編碼細(xì)菌性△6-去飽和酶的核酸。
2.權(quán)利要求1的核酸，含有SEQ.ID NO3的核苷酸。
3.一種分離的編碼被權(quán)利要求1的核酸編碼的氨基酸順序的核酸。
4.權(quán)利要求1-3的任何一種分離的核酸，所說(shuō)的核酸包含于載體中。
5.權(quán)利要求4的分離的核酸適當(dāng)?shù)嘏c一啟動(dòng)子和/或終端信號(hào)連接能影響所說(shuō)的分離的核酸的基因產(chǎn)物表達(dá)。
6.權(quán)利要求5的分離的核酸，其中所說(shuō)的啟動(dòng)子是△6-去飽和酶啟動(dòng)子、魚(yú)腥藻屬菌羧化酶啟動(dòng)子，半日花素啟動(dòng)子、Glycin啟動(dòng)子，napin啟動(dòng)子或半日花素組織特異性啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求5的分離的核酸，其中所說(shuō)的終止信號(hào)是集胞藻屬菌終止信號(hào)、nopaline合成酶終止信號(hào)或種子終止信號(hào)。
8.權(quán)利要求1-7中任何一種分離的核酸，其中所說(shuō)的分離的核酸是包含在一種轉(zhuǎn)基因的生物體中。
9.權(quán)利要求8中的分離的核酸，其中所說(shuō)的轉(zhuǎn)基因生物體是細(xì)菌、真菌、植物細(xì)胞或動(dòng)物。
10.一種從利要求9的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生的植物或所說(shuō)植物的子代。
11.權(quán)利要求10的植物，其中所說(shuō)的植物是向日葵、大豆、玉米、煙草、花生或油籽油菜植物。
12.一種生產(chǎn)提高了γ-亞麻酸(GLA)含量的植物的方法，它包括(a)用權(quán)利要求1-7的任何一種分離的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞;(b)所說(shuō)的植物細(xì)胞再生提高了GLA含量的植物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)的植物是向日葵、大豆、玉米、煙草、花生或油籽油菜植物。
14.一種誘導(dǎo)γ-GLA產(chǎn)生的方法，包括用權(quán)利要求1-7中任何一種分離的核酸轉(zhuǎn)化所說(shuō)的生物體。
15.一種在GLA和亞油酸(LA)缺陷或GLA和LA缺乏的生物體中誘導(dǎo)γ-GLA產(chǎn)生的方法，它包括用分離的編碼細(xì)菌性△6-去飽和酶的核酸和分離的編碼△12-去飽和酶的核酸轉(zhuǎn)化所說(shuō)的生物體。
16.一種在GLA和LA缺陷或缺乏的生物體中誘導(dǎo)γ-GLA產(chǎn)生的方法，它包括用至少一種含有分離的編碼細(xì)菌性△6-去飽和酶的核酸和分離的編碼△12-去飽和酶的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所說(shuō)的生物體。
17.權(quán)利要求或15或16的任何一種方法，其中所說(shuō)的分離的編碼△6-去飽和酶的核酸包括SEQ.ID NO1的317-1507核苷酸。
18.一種在γ亞麻酸缺陷或缺乏的生物體中誘發(fā)十八碳四烯酸產(chǎn)生的方法，包括用權(quán)利要求1-7中任何一種分離的核酸轉(zhuǎn)化所說(shuō)的生物體。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所說(shuō)的生物體是細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物。
20.應(yīng)用權(quán)利要求1-7中的任何一種分離的核酸生產(chǎn)一種提高了抗寒力的植物的方法，它包括(a)用權(quán)利要求1-7中的任何一種分離的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞;(b)從所說(shuō)的轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞中再生提高了抗寒力的所說(shuō)植物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所說(shuō)的植物是向日葵、大豆、玉米、煙草、花生或油籽油菜植物。
22.分離的細(xì)菌性△6-去飽和酶。
23.權(quán)利要求22的分離的細(xì)菌性△6-去飽和酶，它具有SEQ ID NO2氨基酸順序。
全文摘要
亞油酸在△6-去飽和酶作用下轉(zhuǎn)變成γ-亞麻酸。本發(fā)明涉及一種分離的含有△6-去飽和酶基因的核酸，更具體地說(shuō)，分離的核酸含有△6-去飽和酶基因的啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止區(qū)。本發(fā)明提供包括與異源調(diào)節(jié)順序功能性結(jié)合的△6-去飽和酶編碼區(qū)的重組體構(gòu)建體。本發(fā)明的核酸和重組體構(gòu)建體對(duì)在轉(zhuǎn)基因生物體中GLA的生產(chǎn)有用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1072722SQ9211308
公開(kāi)日1993年6月2日 申請(qǐng)日期1992年10月10日 優(yōu)先權(quán)日1991年10月10日
發(fā)明者T·托馬斯, A·S·雷迪, M·努西奧, G·弗雷西內(nèi) 申請(qǐng)人:羅納-布朗克農(nóng)業(yè)化學(xué)公司