專利名稱：一種固定化酵母細胞及其在腺苷三磷酸生產(chǎn)上的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化酵母細胞的制備方法，以及用固定化酵母細胞生物合成腺苷三磷酸的生產(chǎn)工藝。
眾所周知，腺苷三磷酸(簡稱ATP)已廣泛用作肌肉萎縮、心肌梗塞、肝炎和各種急救病癥中的藥物。60年代末人們已利用游離酵母細胞由腺苷(簡稱A)或腺苷酸(簡稱AMP)生產(chǎn)腺苷三磷酸。但由于該法不僅酵母細胞利用低(僅使用一次)，而且由于游離酵母細胞混雜于產(chǎn)物中，帶來了分離上的困難，故ATP的實際收率不高。為此，從70年代開始，許多生物工作者，致力于開發(fā)固定化酵母細胞生產(chǎn)ATP的研究，例如Ado，Y等人在“J.Solid-phaseBiochem，1979，4，43”雜志上公開了一種將速凍酵母細胞固定在乙基纖維素微膠囊中的方法，在柱反應器中連續(xù)生產(chǎn)ATP，其初始反應時的ATP的轉(zhuǎn)化率可達70%，以后下降至50%左右;張元亮等人在“河南大學學報，1985年第二期上”公開了一種固定化啤酒酵母細胞生物合成ATP的研究，其初始轉(zhuǎn)化率可達80%，但固定化啤酒酵母細胞使用次數(shù)少?？傊?，到目前為止，用固定化酵母細胞生物合成ATP，由于其轉(zhuǎn)化率遠較游離酵母細胞法為低，再加上固定化酵母使用壽命較短，故至今未能實現(xiàn)工業(yè)化。
本發(fā)明的目的在于制備一種可長期使用的固定化酵母細胞，其生物合成ATP的轉(zhuǎn)化率可達99%以上。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的發(fā)明人在長期研究“固定化酵母細胞及其生物合成ATP”過程中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)存在如下一些缺陷(1)制備固定化酵母細胞時，溫度過高，導致酵母細胞的活性降低;
(2)使用戊二醛溶液使用固定化酵母細胞強化時，溫度過高，導致固定化酵母細胞的活性降低;
(3)吸附在固定化酵母細胞上未被封閉的戊二醛醛基存在，影響固定化酵母細胞的活性;
(4)固定化酵母細胞在強化過程中，導致部分糖酵解酶系中巰基酶失活，影響固定化酵母細胞的整體活性;
(5)在使用固定化酵母細胞生物合成ATP的過程中，其中所含的輔酶I不斷流失，導致固定化細胞的活性降低，表現(xiàn)在ATP的轉(zhuǎn)化率的迅速下降。
總之，上述諸方面的因素，不僅導致固定化酵母細胞初始活性較低(與游離酵母細胞相比，其初始活性僅為80%)，而且由于在生物合成過程中輔酶I的流失，導致了ATP轉(zhuǎn)化率的迅速下降，影響了工業(yè)化的前景。
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提出了克服這些缺陷的技術(shù)措施(1)降低制備固定化酵母細胞時溫度，選擇適宜于酵母細胞生存的微環(huán)境，使酵母細胞處于最宜的活化環(huán)境中被固定化;
(2)降低固定化酵母細胞交聯(lián)強化時的溫度，減少交聯(lián)劑戊二醛對固定化酵母細胞活性的不利影響;
(3)用含有賴氨酸的水溶液洗滌固定化酵母細胞，使吸附在固定化酵母細胞上的戊二醛的游離醛基封閉，以消除游離戊二醛醛基對固定化酵母細胞的不良影響;
(4)用含有亞硫酸氫鈉的水溶液洗滌固定化酵母細胞，使在固定化過程中失活的糖酵解酶系中的巰基酶的巰基還原活化;
(5)采用對固定化酵母細胞低溫速凍的方法，增加固定化酵母細胞的通透性，降低酶促反應時間;
(6)在反應液(底物)中加入微量的輔酶I(腺嘌呤煙酰胺二核苷酸，可簡稱NAD)，以補充固定化酵母細胞在酶促反應過程中輔酶I的流失。
本發(fā)明亦是這樣實現(xiàn)的一.高活性固定化酵母細胞的制備(1)首先用濃度為0.1mol/L，PH為5.8的磷酸緩沖液配制成濃度為12～18%(Wt)的明膠溶液，即為固定化載體溶液;
(2)然后將裝有上述溶液容器置于33～37℃水浴中恒溫，加入已恒溫于15～37℃水浴中的酵母，攪拌混合均勻，倒入盤中鋪成2～4mm厚的膜，置于冰箱(4℃)中凝固1～3小時，取出后通過篩網(wǎng)切成10目大小的顆粒(10篩孔/厘米2);
(3)再將上述10目大小的顆粒置于0～10℃，濃度為1.5%(Wt)戊二醛水溶液中交聯(lián)強化20～25分鐘，取出后用去離子水洗凈，獲得粗制的固定化酵母細胞;
(4)將粗制的固定化酵母細胞，先用含有0.1～1%(Wt)賴氨酸的水溶液洗滌，使交聯(lián)在固定化酵母細胞上的微量未反應的戊二醛醛基封閉;再用含有0.2～2%(Wt)亞硫酸氫鈉水溶液洗滌，使交聯(lián)過程中失活的糖酵解酶系中的巰基酶的巰基還原活化;最后用去離子水洗凈后，置于-25～-40℃低溫下速凍，得到本發(fā)明所說的固定化酵母細胞。在低溫下保存?zhèn)溆谩?br> 通過上述方法制得的固定化酵母細胞，可以保持酵母細胞中20多種酶的全部活力，而且所得固定化酵母細胞具有良好的機械強度。
其中制備固定化酵母細胞時的載體溶液與酵母的混合比(Wt)為1∶1～2，最宜的混合比為1∶1.0～1.5。
固定化載體溶液的最宜溫度為34～36℃;酵母的最宜溫度為18～25℃。
載體的最宜濃度為15%(Wt)。固定化酵母細胞用戊二醛交聯(lián)強化時最宜溫度為4℃，交聯(lián)時間為22分鐘。
二.用本發(fā)明所說的固定化酵母細胞生物合成腺苷三磷酸(ATP)的工藝，主要包括如下內(nèi)容(1)優(yōu)選反應液(或稱底物水溶液)，其摩爾組成比為a腺苷或腺苷酸:30～70mMol/L,b葡萄糖:100～300mMol/L,c硫酸鎂:4～20mMol/L,d輔酶I:0～1mMol/L,e磷酸緩沖液:150～350mMol/L,PH=6.5～7.5f水:其余.
(2)固定化酵母細胞(Wt)與反應液(V)之比為1∶1～2。
(3)優(yōu)選酶促反應溫度范圍為26～38℃。
(4)優(yōu)選酶促反應時間為1.5～3小時。
其中反應液的最佳摩爾組成比為a腺苷或腺苷酸:35～45mMol/L,b葡萄糖:150～200mMol/L,c硫酸鎂:6～10mMol/L,d輔酶I:0.2～0.4mMol/L,e磷酸緩沖液:200～300mMol/L,PH=7f水其余所說的輔酶I是腺嘌呤煙酰胺二核苷酸的簡稱。
將本發(fā)明所述的固定化酵母細胞與上述組成的反應液，按固液比1∶1～2的比例加入一反應器中，反應器的夾套中通入30～38℃的恒溫水，使酶促反應維持在此溫度范圍內(nèi)進行，在反應器底部通入壓縮的氮氣，使固定化酵母細胞呈流態(tài)化，反應進行1.5～3.0小時，并每間隔0.5小時取樣一次，用常規(guī)的瓊酯糖電泳法測定ATP的轉(zhuǎn)化率，1.5～2.5小時之間取樣，ATP的轉(zhuǎn)化率可達90～99%，3小時的取樣已檢測不到腺苷或腺苷酸的存在，可見所有的腺苷或腺苷酸都轉(zhuǎn)化成了ATP，反應完畢，開啟放料閥，放掉反應器內(nèi)的料液，再加入新鮮的反應液，重復上述操作。固定化酵母細胞則可長期使用下去。從反應器中放出的料液可通過一D296陰離子樹脂交換柱，料液中的ATP為D296陰離子交換樹脂所吸附，用水洗脫雜質(zhì)后，再用含Nacl的水溶液洗脫，收集ATP的級分液，加入酒精。使ATP沉淀，經(jīng)過濾、真空干燥，可得ATPNa2·2H2O產(chǎn)品。
其中酶促反應溫度以34～36℃時為佳。固定化酵母細胞(Wt)與反應液(V)之比宜為1∶1～1.5。
下面將結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容實施例1稱取3g明膠，加入一盛有17ml、PH為5.8、濃度為0.1Mol/L磷酸緩沖液的三角燒瓶中，置于35℃恒溫水浴中，直至完全溶解，然后與保溫于18℃水浴中的30g酵母混合、攪勻，倒入瓷盤中鋪成2mm左右厚的膜，再置于冰箱(4℃)中凝固2小時，取出后通過一不銹鋼篩網(wǎng)切割成10目大小的顆粒，在4℃下置下1.5%戊二醛溶液中交聯(lián)22分鐘，取出后先用去離子水洗滌，再用含有賴氨酸的水溶液洗滌，繼用含有亞硫酸氫鈉的水溶液洗滌，最后再用去離子水洗凈，然后置于-40℃的低溫冰箱中速凍，制得本發(fā)明所說的固定化酵母細胞，并在此低溫下保存?zhèn)溆谩?br> 在250ml三角燒瓶中，按照固定化酵母細胞(Wt)反應液(V)＝1∶1的比例加入50克固定化酵母細胞與50ml的反應液，反應液的組成比為腺苷酸40mMol/L，葡萄糖150mMol/L，硫酸鎂8mMol/L，輔酶I0.2mMol/L，磷酸緩沖液(PH＝7.0)250mMol/L，其余為水。在35℃下振蕩反應2小時后，取樣。用瓊酯糖電泳測定，ATP的轉(zhuǎn)化率達96%，然后傾出反應后的料液，再加入新的反應液50ml，繼續(xù)在35℃下振蕩反應，重復上述操作步驟。ATP的轉(zhuǎn)化率可始終保持在96%。固定化酵母細胞可長期使用。
將反應后的料液200ml通過D296陰離子樹脂交換柱(濕樹脂的體積為40ml)，料液中ATP被樹脂所吸附留在柱內(nèi)。用水洗雜后，再用0.7mol/L Nacl-0.01mol/L Hcl組成的水溶液洗脫，收集ATP的級分60ml，然后用酒精沉淀。過濾、真空干燥，可得3.2克ATP Na2·2H2O產(chǎn)品。
實施例2稱取0.5kg明膠，加入一盛有2.83l，PH為5.8，濃度為0.1Mol/L磷酸緩沖液的容器中，置于40℃恒溫水浴中直至完全溶解。然后冷至37℃下恒溫一小時，再加入已在25℃水浴中保溫的4.5kg酵母，攪拌混合均勻后，倒入搪瓷盤中，鋪成2～4mm厚的膜，置于4℃冰箱中凝固2小時，取出后切割成10目大小的顆粒，再倒入溫度為4℃、濃度為1.5%(Wt)、體積為10l的戊二醛溶液中，并置于4℃的冰箱內(nèi)交聯(lián)22分鐘，取出后先用去離子洗滌，再用含有賴氨酸的水溶液洗滌，繼用含有亞硫酸氫鈉的水溶液洗滌，最后再用去離子水洗凈，然后置于-25℃以下的低溫冰箱中速凍，制得本發(fā)明的固定化酵母細胞，并在此低溫下保存?zhèn)溆谩?br> 在一容積為10l的流化床反應器中，加入上述的固定化酵母細胞4kg和反應液6l，反應液的組成比同實施例1。在反應器的夾套內(nèi)通入36℃恒溫水，使系統(tǒng)在恒溫狀態(tài)下進行酶促反應，在反應器的底部通入壓縮的氮氣(氮氣通過空氣過濾器除菌)，使反應器中固定化酵母細胞呈流態(tài)化，反應3小時后，取樣，用瓊酯糖電泳法測定，幾乎所有的腺苷(或腺苷酸)都轉(zhuǎn)化成ATP，即轉(zhuǎn)化率在99%以上，故反應3小時作為終止時間是適宜的，開啟放料閥，放掉反應完畢的料液，再加入6l新鮮的反應液，繼續(xù)重復上述的酶促反應。本發(fā)明的固定化酵母細胞可長期使用，其ATP的轉(zhuǎn)化率可保持在99%左右。提取、分離ATP的方法同實施例1。
由上可見按照本發(fā)明的方法所制得的固定化酵母細胞用于生物合成腺苷三磷酸(ATP)具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明的固定化酵母細胞的活性與游離酵母細胞的活性相當，用于生物合成腺苷三磷酸(ATP)時，其轉(zhuǎn)化率可達99%以上，大大高于現(xiàn)有技術(shù)的80%。
2.適宜的固化條件，使本發(fā)明所說的固定化酵母細胞具有足夠的強度，可滿足工業(yè)生產(chǎn)中的長期使用。
3.由于本發(fā)明在反應體系中添加了微量的輔酶I，從而抑制了固定化酵母細胞在酶促反應過程中輔酶I流失，使固定化酵母細胞中的20多種酶在參予酶促反應時全部保持良好的整體活性。
4.本發(fā)明的固定化酵母細胞適用于反應液含有較高濃度的腺苷或腺苷酸的條件。
5.采用本發(fā)明的固定化酵母細胞生物合成腺苷三磷酸(ATP)時，其酶促反應時間可縮短至1.5～3小時，至少比現(xiàn)有技術(shù)減少一半。
總之，由于本發(fā)明的固定化酵母細胞具有上述的顯著優(yōu)點，因而具有廣泛的工業(yè)應用前景。
顯然，對于任何從事腺苷三磷酸生產(chǎn)的技術(shù)人員來說，采用本發(fā)明所說的固定化酵母細胞，亦可以將含腺苷或腺苷酸濃度較低的反應液(如腺苷或腺苷酸含量為10～20mMol/L)轉(zhuǎn)化成ATP，此時反應時間可小于1.5小時。
此外，本發(fā)明所說的酵母可以是新鮮酵母，亦可以是凍干酵母，當它們被固定化后，在本發(fā)明的條件下，ATP的轉(zhuǎn)化率可達96～99%。
權(quán)利要求
1.一種以明膠為載體的固定化酵母細胞的制備方法，其特征在于(1)所說的載體系采用濃度為0.1Mol/L，PH為5.8的磷酸緩沖液配制成12～18%(wt)的明膠溶液；(2)將(1)所述的明膠溶液置于33～37℃的恒溫水浴中保溫，然后按載體與酵母11～2的比例將已在15～37℃水浴中恒溫的酵母加入到載體中去，攪拌混勻后倒入盤中鋪成2～4mm厚的膜，再置于4℃的冰箱中凝固1～3小時，取出后切成10目大小的顆粒；(3)將(2)所述的10目大小的顆粒置于0～10℃濃度為1.5%(wt)戊二醛水溶液中交聯(lián)強化20～25分鐘，取出后用去離子水洗凈，獲得粗制的固定化酵母細胞；(4)將(3)所述的粗制的固定化酵母細胞先用含有0.1～1%(wt)賴氨酸的水溶液洗滌，再用含有0.2～2%(wt)亞硫酸氫鈉的水溶液洗滌，最后用去離子水洗凈后，置于-25～-40℃低溫冰箱中速凍，得到本發(fā)明所說的固定化酵母細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中載體濃度以15%(Wt)為佳。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于載體與酵母的混合比宜為1∶1.0～1.5。
4.如權(quán)利要求1～3之一的方法，其特征在于固定化時載體(明膠溶液)宜恒溫至34～36℃，酵母宜恒溫至18～25℃。
5.如權(quán)利要求1-4之一的方法，其特征在于用1.5%(Wt)戊二醛交聯(lián)強化固定化酵母細胞的溫度為4℃，交聯(lián)時間為22分鐘。
6.如權(quán)利要求1-5之一的方法所制得的固定化酵母細胞用于生物合成腺苷三磷酸時，其工藝條件的特征為(1)反應液(底物)摩爾比為a 腺苷或腺苷酸: 30～70 mMol/L,b 葡萄糖: 100～300 mMol/L,c 硫酸鎂: 4～20 mMol/L,d 輔酶I: 0～1 mMol/L,e 磷酸緩沖液: 150～350 mMol/L,(PH=6.5～7.5)f 水: 其余;(2)固定化酵母細胞(Wt)與反應液(V)之比為1∶1～2;(3)酶促反應的溫度范圍為26～38℃;(4)酶促反應時間為1.5～3小時。
7.如權(quán)利要求6所述的工藝，其特征在于反應液的摩爾比為a 腺苷或腺苷酸: 35～45 mMol/L,b 葡萄糖: 150～200 mMol/L,c 硫酸鎂: 6～10 mMol/L,d 輔酶I: 0.1～0.3 mMol/L,e 磷酸緩沖液PH=7: 200～300 mMol/L,f 水: 其余.
8.如權(quán)利要求6或7所述的工藝，其特征在于酶促反應溫度為34～36℃。
9.如權(quán)利要求6-8之一所述的工藝，其特征在于固定化酵母細胞(Wt)與反應液(V)之比宜為1∶1～1.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化酵母細胞的制備方法及其在腺苷三磷酸(ATP)生產(chǎn)上的應用。采用本發(fā)明的固定化酵母細胞可將腺苷或腺苷酸定量地轉(zhuǎn)化成腺苷三磷酸，轉(zhuǎn)化率可達99％以上。
文檔編號C12P19/32GK1072957SQ9211381
公開日1993年6月9日 申請日期1992年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月18日
發(fā)明者邱蔚然, 徐茜, 王永法 申請人:華東化工學院