專利名稱：重組體疫苗及制備該疫苗的方法
目前，有許多類型向來是使個體對疾病免疫的疫苗。盡管這些可獲得的疫苗通常是安全的，并且至少在某種程度上對誘導免疫應答是有效的，但它們都具有局限性。此外，對某些疾病還沒有任何疫苗。開發(fā)目前可獲得疫苗的取代物以及新疫苗以免受目前還沒有疫苗可獲得的疾病的損害是減少由許多疾病引起的發(fā)病率和死亡率的重要步驟。
本發(fā)明涉及有復制能力的重組體病毒，這些病毒包括編碼外源多肽或蛋白質(zhì)的外源核酸序列，該多肽或蛋白質(zhì)是以隨后被病毒和/或細胞酶蛋白水解處理的重組體多蛋白前體的組分所表達。從而，釋放出編碼外源多肽。該有復制能力的病毒可以是動物(非人體)病毒(例如，脊椎動物或哺乳類動物病毒)、人體病毒、或植物病毒。本發(fā)明還涉及有復制能力的重組體病毒，特別是脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中該重組體基因組包括編碼被表達的外源多肽或多個多肽的外源核酸序列(或多個序列)和一個或多個編碼相應數(shù)目人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，并且表達這些編碼多肽以及誘導產(chǎn)生對被傳入的哺乳動物中的這些多肽的特殊抗體。適當選擇的有復制能力的病毒可用于將外源蛋白質(zhì)傳送至已被傳入這些病毒的個體。如脊椎動物，特別是哺乳動物，更特定的是人體。在植物病毒的場合，例如，有復制能力的植物病毒可被插入種籽或在其另一生長階段的植物中，其要求是能表達和處理編碼外原多肽。例如，可以使用這種外源多肽防護植物免遭疾病或免受傳染侵襲。這些植物可通過口服消耗用以傳送疫苗。
本發(fā)明有復制能力重組體病毒包括廣泛種類的病毒，如細小核糖核酸病毒(例如，腸病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、足和口疾病病毒(FMDV)、鼻病毒、艾柯病毒、肝炎A病毒)、Togaviruses(例如，Sindbis病毒和風疹病毒)、以及Flaviviruses(例如，黃熱病毒)。病毒的類型部分地由被表達的目標外源抗原(多個抗原)、通過其將生成的重組體病毒給藥的方法、和所需的免疫應答特征決定。
特別是，本發(fā)明涉及有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，這些病毒與親本病毒的區(qū)別在于，它們以這樣的方式被修飾過，使它們不會致病并含有外源核酸序列和一個或多個人工蛋白水解分裂位點，以致在病毒感染過程中，它們穩(wěn)定地將編碼外源產(chǎn)物表達為重組體多蛋白前體的組分。該前體被蛋白水解分裂，釋放出正常的脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)和編碼外源蛋白質(zhì)。此外，該有復制能力的重組體病毒可含有多聚接頭序列(EcoR1，Not1，BssH2，和Xhol)以便于容易地將所需外部核酸序列插入。它們也可含有聚氨基酸鏈，如多聚甘氨酸鏈，它通常是與插入的序列相鄰以便增強區(qū)域的結(jié)構(gòu)靈活性并可能提高蛋白水解處理的效率。
本發(fā)明還涉及一種制備重組體病毒的新方法，在該方法中，將外源核酸序列插入病毒基因組中。在本發(fā)明的方法中，利用了病毒生活周期的基本方面，從而該重組體病毒產(chǎn)生其正常的蛋白質(zhì)組分并復制，在感染的細胞中產(chǎn)生顯著量的由外源核酸序列(多個序列)編碼的氨基酸序列(外源蛋白質(zhì))。在本方法中，親本病毒，該病毒的基因組將由病毒或細胞酶蛋白水解處理的多蛋白前體編碼得到一種或多種成熟的蛋白質(zhì)，被如下所修飾將編碼所生成的多肽的一種外源核酸序列和編碼蛋白水解處理(分裂)在病毒生活周期中由親本病毒產(chǎn)生的前體多蛋白的病毒或細胞蛋白酶的一個人工蛋白水解分裂位點或多個位點的一個核酸序列，或多個序列引入病毒基因組中，產(chǎn)生重組體病毒。這些序列可以在任何位置被引入病毒基因組，只要其存在不會使病毒復制所需的病毒序列破裂。例如，可以在任何將多蛋白處理以產(chǎn)生兩種天然蛋白質(zhì)的天然位點(即在任何天然多蛋白正常蛋白水解分裂的位點)插入二種序列。在外源核酸序列被插在編碼一種蛋白質(zhì)的病毒序列的末端那些情況下，僅需要一種蛋白水解處理序列。如果一種以上編碼所產(chǎn)生的多肽的外源核酸序列被引入病毒基因組中，則可能需要額外的蛋白水解分裂位點-編碼核酸序列。例如，如果在病毒基因組范圍內(nèi)(在內(nèi)部)引入兩種或兩種以上多肽-編碼核酸序列并且編碼蛋白質(zhì)分裂，產(chǎn)生兩種或兩種以上單獨的蛋白質(zhì)是合乎要求的，則也必須引入足夠數(shù)量編碼分裂位點的核酸序列。例如，如果兩種外源核酸序列，各自編碼所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，在病毒基因組范圍內(nèi)被引入并且兩種單獨的(各個)蛋白質(zhì)是合乎要求的，則需要三或四個編碼蛋白水解分裂位點的核酸序列(即，如果兩種蛋白質(zhì)被病毒基因組中存在的兩種核酸序列所編碼而不插入核酸序列，則是三個，如果兩種核酸序列被插入的核酸序列所分離，必須除去該序列的編碼產(chǎn)物以“分離”兩種編碼蛋白質(zhì)，則是四個)。在該序列被插入病毒基因組范圍中(不是在末端)的那些情況下，需要兩個蛋白水解處理序列以使外源核酸序列的二端被釋放;這些序列可以相同或不同。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，以這樣的方式將兩個序列引入在編碼病毒蛋白質(zhì)的病毒序列的5′端的第一或單一起始密碼子和第二密碼子之間的親本病毒基因組中，使在重組體基因組中的次序為親本病毒的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-親本病毒的單一起始密碼子-編碼所表達產(chǎn)物的外源核酸序列-編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-親本病毒的第二密碼子-親本核酸序列的剩余物。在另一具體實施方案中，將編碼外源多肽的外源核酸序列結(jié)合在病毒基因組范圍內(nèi)，在生成的重組體病毒基因組中序列的次序為親本病毒的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-親本病毒的單一起始密碼子-親本病毒轉(zhuǎn)譯區(qū)的開始密碼子(多個密碼子)-編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-外源核酸序列-編碼人工蛋白水解分解位點的核酸序列-親本病毒基因組的剩余物。該編碼蛋白水解分裂位點可以相同或不同。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，其中制得一種重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒(它表達一種外源核酸序列或多種序列)，將編碼所表達蛋白質(zhì)(例如一種抗原)的核酸序列、和編碼一種脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶的人工識別序列、或幾種序列引入親本脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中。在另一個具體實施方案中，將編碼一種脊髓灰質(zhì)炎病毒2A蛋白酶的人工識別序列(幾種序列)的一種核酸序列或幾種序列與一種或多種編碼所表達的蛋白質(zhì)的核酸序列一起引入病毒基因組中。在DNA病毒的場合，基因組將被處理成其DNA形式。在RNA病毒的場合，基因組被處理成其cDNA形式。這兩種形式都被認為是親本病毒的基因組。在該具體實施方案中，將編碼一種外源多肽的外源核酸序列結(jié)合入脊髓灰質(zhì)炎病毒的末端，生成的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組構(gòu)成如下親本脊髓灰質(zhì)炎病毒的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-脊髓灰質(zhì)炎病毒單一的起始密碼子-外源核酸序列-人工脊髓灰質(zhì)炎病毒3C或2A蛋白酶識別部位-脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的第二密碼子-脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的剩余物。在將編碼一種外源多肽的外源核酸序列結(jié)合在親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組范圍內(nèi)的位點上(即內(nèi)部位點)的具體實施方案中，生成的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組如下親本脊髓灰質(zhì)炎病毒的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-脊髓灰質(zhì)炎病毒單一的起始密碼子-脊髓灰質(zhì)炎蛋白質(zhì)編碼區(qū)-編碼人工3C蛋白酶識別部位或2A蛋白酶識別部位的核酸序列-外源核酸序列-編碼人工3C蛋白酶識別部位或2A蛋白酶識別部位的核酸序列-脊髓灰質(zhì)炎病毒的剩余物。如上所述，在一種以上蛋白質(zhì)或多肽被表達的那些場合，一種以上的外源核酸序列，與適當數(shù)目的人工蛋白水解分裂位點一起，被包括在重組體有復制能力的脊髓灰質(zhì)炎病毒中(即編碼各個被表達的蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列)。
當轉(zhuǎn)譯修飾的脊髓灰質(zhì)炎病毒時，制得大于正常的前體，但被親本脊髓灰質(zhì)炎病毒中存在的3C和/或2A蛋白酶恰當?shù)胤至殉杉顾杌屹|(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)組分的通常列陣。3C和/或2A蛋白酶也準確地識別并分裂人工識別(蛋白水解分裂)部位，釋放被外源核酸序列編碼的外源多肽。如本文所述，本發(fā)明的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒表達可探測量的編碼外源蛋白質(zhì)。親本病毒繼續(xù)復制并且也產(chǎn)生天然蛋白質(zhì)。
由重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒所舉例說明的，本發(fā)明的有復制能力的重組體病毒可用作抗細菌、病毒、真菌(例如，酵母)感染，寄生蟲疾病，癌或變應性病的疫苗。它們也可用來傳送避孕藥(例如精液抗原)。是或者包括本文所述有復制能力的重組體病毒的疫苗和避孕藥組合物也是本發(fā)明的主題。
當需要引入粘膜免疫性以予防感染時，本發(fā)明的重組體脊髓灰質(zhì)炎疫苗特別有利。例如，有效的引入粘膜免疫性有利于預防或減輕HIV、輪狀病毒、呼吸合胞體病毒(RSV)、肝炎A病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、乳頭狀瘤病毒、麻疹病毒和流感病毒的感染。該重組體病毒也可用于誘導抗如Vibriocholerae和產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌引起的那些細菌疾病的免疫性。此外，該重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒通過將一種以上外源核酸序列(即兩種或多種核酸序列，各個序列編碼不同的抗原)引入親本脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中，可用以提供對由一種以上生物體感染的防護。另一方面，二種或二種以上各自表達不同抗原的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的混合物或組合物可用以使個體對一種以上生物體或傳染體免疫。通過利用分子生物學出現(xiàn)的工具開發(fā)改進的或新的疫苗，由TaskForce在ChildSurvival上所公開的對“理想的疫苗”的推導，作為可能有希望實現(xiàn)的一種“在出生時一次給藥將提供對多種疾病的防治”的疫苗。
重組體病毒也可用以在組織培養(yǎng)物中產(chǎn)生外源多肽，該多肽可從所產(chǎn)生的細胞或病毒中析出或分離。它們也可用以在脊髓灰質(zhì)炎細胞、哺乳動物細胞，包括人體細胞、和植物細胞中產(chǎn)生外源多肽。


圖1是本發(fā)明重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的示意圖解，其中示出了使外源核酸序列插入脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的一個末端并表達外源多肽的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組(SEQID＃24和25)的修飾。也示出了當其分裂為天然脊髓灰質(zhì)炎病毒多蛋白(PO)前體和外源蛋白質(zhì)插入物時，病毒3C蛋白酶水解處理圖樣。
圖2是本發(fā)明重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的示意圖解，其中示出了導致表達外源多肽的將外源核酸序列插在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的一個末端和在其范圍之內(nèi)。也示出了與插入序列相鄰的多聚甘氨酸鏈，使區(qū)域的結(jié)構(gòu)靈活性增強。
圖3是噬斑分析結(jié)果的照片，示出了親本脊髓灰質(zhì)炎病毒的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的表型。在所示的噬斑分析中，HeLa細胞感染了攜帶輪狀病毒VP4蛋白質(zhì)(B、C和D)所產(chǎn)生的抗原決定基、或來自成熟霍亂毒性亞單位B(CTB)(E)的完全編碼序列的親本脊髓灰質(zhì)炎病毒(A)和重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。
圖4展示了試驗結(jié)果，這些結(jié)果顯示了攜帶Vibrio霍亂B毒性亞單位或輪狀病毒VP4序列的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的表達和處理。
圖4A是使用由感染親本脊髓灰質(zhì)炎病毒(行1)或?qū)嵤├?所述的霍亂毒性B-脊髓灰質(zhì)炎病毒重組體病毒(行2)的HeLa細胞提取物制得的Western印跡照片。結(jié)果表明，B亞單位得到表達并恰當?shù)乇惶幚碓谥亟M體脊髓灰質(zhì)炎病毒的范圍內(nèi)(箭頭所示)。
圖4B是來自感染親本脊髓灰質(zhì)炎病毒(行1)或霍亂毒性B(CTB)-脊髓灰質(zhì)炎重組體病毒(行5)(實施例2)并且使用識別脊髓灰質(zhì)炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的免抗體探測的相同HeLe細胞的提取物照片。結(jié)果表明，在脊髓灰質(zhì)炎病毒重組體中制得比正常的更大的P1多蛋白前體，但接著是恰當?shù)牡鞍姿馓幚?，產(chǎn)生脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)產(chǎn)物的常規(guī)補足物，以及釋放由CTB核苷酸序列產(chǎn)生的外源CTB蛋白質(zhì)。行2-4包括攜帶由輪狀病毒VP4蛋白質(zhì)得到的抗原決定基(長度為21-104氨基酸)的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。
圖5示出了為分析重組體病毒粒子的結(jié)構(gòu)和組成所進行的SDS-PAGE分析結(jié)果。這兩種病毒(親本和重組體)的遷移圖樣實際上是不能區(qū)分的，這揭示了重組體病毒的病毒顆粒具有正常的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成。表明了脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼蛋白質(zhì)的一致共同性。
圖6示出了為測定重組體脊髓灰質(zhì)炎誘導接種疫苗的宿主中的免疫應答的活性而進行的Western印跡分析與對比值和模擬注射比較的結(jié)果。
本發(fā)明涉及重組的有復制能力的病毒，這些病毒包括一種編碼一種在病毒生活周期中所產(chǎn)生的外源多蛋白的外源核酸序列，以及一種編碼一種分裂親本病毒所產(chǎn)生的前體多蛋白的病毒或細胞蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列。這兩種類型的序列可在親本病毒基因組的任何位置存在，只要其存在不致分裂病毒復制所需的病毒序列。
本發(fā)明基于申請人的論證，可將一種編碼一種外源多肽的外源核酸序列在病毒生活周期中產(chǎn)生的病毒基因組的末端或在病毒基因組范圍內(nèi)的位置(即在內(nèi)部位點)，作為一種前體多蛋白結(jié)合入病毒基因組中，該前體多蛋白被分裂親本病毒所正常產(chǎn)生的前體多蛋白的病毒或細胞蛋白酶所分裂(親本病毒即是其中引入外源核酸序列的病毒)。在一個具體實施方案中，將一種編碼一種外源多肽的外源核酸序列結(jié)合進病毒基因組的末端，在生成的重組體病毒基因組中序列的次序是親本病毒的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-親本病毒單一起始密碼子-外源核酸序列-編碼一種人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-親本病毒的第二密碼子-親本病毒基因組的剩余物。病毒基因組的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)的重組體基因組部分，當在親本病毒中存在時，可以是全部或部分5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)。在另一具體實施方案中，將一種編碼一種外源多肽的外源核酸序列結(jié)合在病毒基因組范圍內(nèi)，在生成的重組體病毒基因組中序列的次序是親本病毒的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-親本病毒的單一起始密碼子-親本病毒轉(zhuǎn)譯區(qū)的開始密碼子-編碼一種人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-外源核酸序列-編碼一種人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-親本病毒基因組的剩余物。
編碼外源多肽在正常病毒蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯范圍內(nèi)被表達為重組體或融合前體多肽的組分(該組分包括外源多肽、一個人工蛋白水解識別部位或多個位點和病毒多蛋白)。重組體前體多肽被病毒或細胞蛋白酶蛋白水解處理，該蛋白酶將親本病毒前體多蛋白處理，導致由病毒蛋白質(zhì)釋放游離的外源蛋白質(zhì)。修飾成包括外源序列的病毒稱之為親本病毒，該病毒可以是天然病毒(既可是致病的或較佳為非致病的)、減毒的病毒、疫苗菌株或重組體病毒。本文所用的術(shù)語多肽包括蛋白質(zhì)或其部分(肽)、二種或二種以上蛋白質(zhì)或肽的融合及一種蛋白質(zhì)和一種肽的融合。
在一特定的具體實施方案中，申請人已制得有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，該病毒包括結(jié)合入脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的末端或脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組范圍內(nèi)的位點的一種編碼一種所表達的外源蛋白質(zhì)的外源核酸序列，和一種編碼一種脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶和/或2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列。它們已證明，外源蛋白質(zhì)被表達并通過蛋白水解處理由脊髓灰質(zhì)炎病毒中分離。該生成的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒與親本病毒不同之處在于它們包括編碼一種外源多肽或多種多肽以及一種或多種人工蛋白水解分裂位點的外源核酸序列，并且表達病毒感染期間的外源產(chǎn)物。該親本脊髓灰質(zhì)炎病毒可以是天然的或廣泛類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒、減毒的病毒、疫苗菌株或重組體或基因工程的脊髓灰質(zhì)炎病毒(在該場合下，改變或突變的序列不能編碼本文所述對本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎病毒的目的有用的外源蛋白質(zhì))。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，編碼外源多肽的外源核酸序列和編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列位于脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的一個末端，在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的單一起始密碼子和第二密碼子之間，以使重組體基因組中序列的次序如下脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-脊髓灰質(zhì)炎病毒單一起始(第一)密碼子-外生核酸序列-人工蛋白酶識別部位-脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的第二密碼子-脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的剩余物。因而，重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的表達產(chǎn)生包括外源蛋白質(zhì)、人工蛋白水解分裂位點和脊髓灰質(zhì)炎病毒多蛋白的重組體或融合多蛋白前體。申請人已指出，重組體多蛋白先質(zhì)通過包含人工蛋白水解分裂位點的蛋白酶的蛋白水解處理，導致產(chǎn)生正常的脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)組分并釋放外源蛋白質(zhì)。結(jié)果也發(fā)生病毒復制，但在脊髓灰質(zhì)炎病毒粒子中不包括外源蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的兩種重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，被描繪于圖1和圖2(pMOV1.3)中，其中外源核酸和編碼一種人工蛋白水解分裂位點的核酸序列結(jié)合在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的末端。該重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組包括核酸序列(緊接單一起始密碼子的3′)，該序列編碼五個氨基酸殘基出現(xiàn)在脊髓灰質(zhì)炎病毒的Mahoney1型菌株的氨基末端。這些序列的存在并非必要，但其存在可以影響表達的效能。如圖1所描繪的，該重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組也可包括與插入的(外源)序列相鄰的多聚甘氨酸鏈。
如由脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組所例證的，編碼所表達的蛋白質(zhì)或多肽的外源核酸序列可被引入病毒基因組范圍中。如圖2所示，在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組范圍內(nèi)有一系列額外的位置，在這些位置上可放置編碼外源多肽的外源核酸序列和編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，產(chǎn)生表達編碼產(chǎn)物的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。這些脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組范圍內(nèi)的位點包括Vp1編碼區(qū)和2A編碼區(qū)的接點、2A編碼區(qū)和2B編碼的接點以及2C編碼區(qū)和3A編碼區(qū)的接點。多聚接頭/蛋白水解處理的主題已被插在這些位點并且生成的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒已表明是有復制能力的。使用本文所述的方法和已知的方法，可將一種外源核酸序列或多種序列引入這些位點。將多聚接頭/蛋白水解主題插在Vpg編碼區(qū)和3C編碼區(qū)的接點處可消除病毒復制。
為促使處理病毒多蛋白內(nèi)部范圍內(nèi)的外源序列，在插入的兩端必須包括適當?shù)牡鞍姿馓幚硇盘枴亩?，脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組內(nèi)序列的次序如下，其中編碼外源多肽的外源核酸序列和編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列插在例如Vp1編碼區(qū)和2A編碼區(qū)的接點處脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-脊髓灰質(zhì)炎單一起始密碼子-Vp0編碼區(qū)-Vp3編碼區(qū)-Vp1編碼區(qū)-編碼人工3C蛋白酶識別部位或2A蛋白酶識別部位的核酸序列-編碼人工3C蛋白酶識別部位或2A蛋白酶識別部位的核酸序列-脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的剩余物。
測定在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中有多個位點，在這些位點上可以進行插入外源核酸序列以產(chǎn)生有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，在廣義上意味著在設計和制備例如可用作疫苗和蛋白質(zhì)制品的重組體病毒中有相當大的靈活性和可能的變化。可將一種或多種編碼一種被表達的和蛋白水解處理的外源蛋白質(zhì)或多肽的外源核酸序列引入本文所述病毒基因組中(在一個末端或在范圍內(nèi))的一個或多個位點。此外，可以識別能夠進行插入而不會使病毒的復制活性消失的其他位點。有可能，某些外源核酸序列，當它們結(jié)合在病毒基因組的特定位點時將有更好的耐藥力或更有效地被表達和/或蛋白水解處理。如以脊髓灰質(zhì)炎病毒舉例說明的，可以利用本文所述的方法和從而制得的重組體病毒評價這一點是否正確。
可將另外的特色結(jié)合設計有復制能力的重組體病毒，如多聚接頭序列(例如，EcoR1、Not1、BssH2、和Xho1)以使得易于將所需的外部序列插入重組體載體中。還有，鄰位插入的序列可以插入變異體，如多聚甘氨酸鏈，以增強區(qū)域的結(jié)構(gòu)靈活性并有可能提高蛋白水解處理的效率。
一種以上編碼一種所產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列可以被包括在有復制能力的重組體病毒中，從而產(chǎn)生相應數(shù)目的蛋白質(zhì)或多肽。兩種或更多的核酸序列可以各自編碼不同產(chǎn)物或可以編碼相同產(chǎn)物(例如，當需要增強的蛋白質(zhì)或多肽制劑時)。此外，對于脊髓灰質(zhì)炎病毒，蛋白水解分裂位點可以是3C分裂位點、2A分裂位點或兩者都是。
盡管本發(fā)明通過制備重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒得到了舉例說明，但任何在其中發(fā)生病毒前體蛋白質(zhì)的蛋白水解處理的病毒可以被修飾，以產(chǎn)生表達一種外源蛋白質(zhì)并將其適當處理的重組體病毒。例如，可以用與重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒所述的類似方法制備和使用重組體細小核糖核酸病毒(例如，腸病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、FMDV、鼻病毒、艾柯病毒、肝炎A病毒)和重組體Flaviviruses(例如，黃熱病毒)。
本發(fā)明制備表達和蛋白水解處理一種外源蛋白質(zhì)的有復制能力的重組體病毒的方法如下利用已知的基因工程技術(shù)(Sambrook，J.etal.，MolecularChoningALaboratoryManual(2ded.)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)修飾在其生活周期中(指親本病毒)產(chǎn)生被病毒或細胞蛋白酶水解處理的蛋白質(zhì)前體的病毒，將至少兩種類型核酸序列引入病毒基因組中一種編碼一種被重組體病毒表達和處理的外源蛋白質(zhì)或多肽的外源核酸序列(一種由引入類型病毒以外來源得到的核酸序列)和一種編碼一種將處理表達的重組體蛋白質(zhì)以釋放病毒和外源蛋白質(zhì)的病毒和/或細胞蛋白酶的人工識別部位的核酸序列。一種補充類型的核酸序列，如多聚甘氨酸鏈，可以被插入鄰接外源核酸序列處，以增強區(qū)域的結(jié)構(gòu)靈活性并有可能提高效率。
實施例1中描述了脊髓灰質(zhì)炎病毒載體cDNA克隆的構(gòu)成，本發(fā)明的例證。用這一方法可以引入一種或多種各自包括編碼一種外源產(chǎn)物的一種外原核酸序列或多種序列的“單元”，一種或多種人工蛋白水解識別部位以及任選地，額外的核酸序列，如多聚甘氨酸鏈。例如，可在病毒基因組的5′末端引入一種單元，該單元包括一種編碼一種對所需免疫應答的外源蛋白質(zhì)抗原和一種蛋白水解處理的人工識別部位的核酸序列。另一方面，可以將包括編碼一種以上蛋白質(zhì)或多肽和適當數(shù)目蛋白水解分裂位點的核酸序列的兩種或多種這些“單元”或一種“單元”(例如，導致表達和釋放兩種或多種不同蛋白質(zhì)抗原或一種蛋白質(zhì)抗原的兩種復制品)引入病毒基因組中。編碼所表達的蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列可以在串聯(lián)的“單元”中(即，沒有任何插入的序列)或被未編碼所表達的蛋白質(zhì)或多肽的核酸所分離?？梢詫⒁环N或多種單元引入病毒基因組中的相同或全部位點。得到的重組體多蛋白前體將包括一種或多種外源蛋白質(zhì)或肽以及一種或多種蛋白水解分裂位點。重組體多蛋白前體的處理導致釋放外源產(chǎn)物。
可使用重組體病毒，如本文所述的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，以誘導對個體中抗原的免疫應答，從而，提供了對由其中產(chǎn)生抗原的外源病原體(細菌、病毒、真菌、寄生蟲)的攻擊或感染的防護。從而，它們可用作疫苗以提供對這些病原體的防護。如實施例2所述，已構(gòu)成的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒包含有編碼來自輪狀病毒VP4蛋白質(zhì)的抗原決定基的核酸序列。還是如實施例2所述，已構(gòu)成的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒包含有來自霍亂毒素亞單位B的完全編碼區(qū)。還制得了包括編碼流感A病毒抗原或Vibrio霍亂的霍亂弧菌傘毛蛋白的核酸序列的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。這些重組體和親本脊髓灰質(zhì)炎病毒的表型示于圖3。在HeLa細胞中表達了含有來自霍亂毒素亞單位的完全編碼區(qū)的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒并且鑒定了其表達和處理。結(jié)果表明，B亞單位在重組體病毒的范圍內(nèi)被表達并被適當?shù)靥幚?4A)。結(jié)果還表明，在重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒中制得比正常的要大的P1多蛋白，但發(fā)生適當?shù)牡鞍姿馓幚恚杉顾杌屹|(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)產(chǎn)物的正常組分和游離霍亂毒素B亞單位序列(圖4B)。在HeLa細胞中也表達了含有由輪狀病毒VP4蛋白質(zhì)得到的抗原決定基(長度為21-104的氨基酸)的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。圖4B的行2-4含有攜載這些抗原決定基的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。
實施例3描述了本文所述制得的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的免疫遺傳學評定。通過肌肉內(nèi)注射使表達人體脊髓灰質(zhì)炎病毒受體的突變家鼠感染在Mahoney或薩賓(Sabin)基載體范圍內(nèi)表達完全霍亂毒素B亞單位(CTB)的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。將對比家鼠模擬感染抑或感染表達Vibrio霍亂傘毛蛋白的重組體病毒。Western印跡分析表明(圖6)，用Mahoney基CTB-重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫的家鼠明顯地含有與CTB單體和五聚物反應的IgG抗體。而對比家鼠，正如所預期的，缺少這種特殊的抗體。此外，用薩賓基CTB-重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫的家鼠在這一場合下，未產(chǎn)生CTB特殊抗體反應。這一原因尚不清楚，但可能涉及到重組體脊髓灰質(zhì)炎的復制特性以及可能通過提高重組體病毒疫苗的劑量得到解決。
可以用類似于對霍亂毒素亞單位B和輪狀病毒VP4蛋白質(zhì)所述的方法制得含有編碼其他對所需免疫反應的抗原的核酸序列的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。該重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒特別可用于預防可能需要誘導粘膜免疫性以預防感染的疾病(或減輕它們產(chǎn)生的嚴重程度)。例如，重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒可能特別用于提供防護或減輕由HIV、輪狀病毒、RSV、肝炎A病毒和流感病毒感染的嚴重程度。
人體粘膜表面覆蓋大于400m2并且代表免疫系統(tǒng)和環(huán)境之間的最大接觸面積。和粘膜表面相聯(lián)的全部淋巴細胞數(shù)超過所有結(jié)合其他淋巴組織的這些細胞數(shù)，這些細胞負擔合成至少60%每天產(chǎn)生的全部免疫球蛋白(Childers，N.K et al.，Annu.Rev.Microbiol.43∶503-536(1989))。在分泌物中，如沒有局部抗原暴露中的眼淚、唾液、乳汁，存在特殊的IgA抗體，導致普通粘膜免疫系統(tǒng)的概念。據(jù)信在內(nèi)臟相聯(lián)的淋巴網(wǎng)狀組織(GALT)中被激活的免疫細胞后代被遷移至，并且保護，遠處的粘膜表面。不顧粘膜免疫系統(tǒng)的范圍和重要性，有關(guān)在粘膜表面上細胞和體液免疫的決定因素是較少為人所知的。響應淋巴細胞的較難得到，以及將優(yōu)良特征抗原傳送至可重現(xiàn)的目標位置的困難限制了對這些排出物的實驗評價。重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒可以以可重現(xiàn)的方式傳送優(yōu)良特性的抗原，并可以改善某些實驗障礙。目前，一系列相當重要的病毒和細菌疾病不能為接種疫苗所預防。這些疾病包括由輪狀病毒、RSV感染造成的呼吸疾病、以及由V.霍亂或產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌誘發(fā)的胃腸炎所引起的疾病。在被這些病原自然感染后，產(chǎn)生粘膜免疫性，使得對再感染具有顯著或完全的抗性。本發(fā)明的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒可以用以將有關(guān)的防護抗原傳送至粘膜免疫系統(tǒng)，從而提供了一種新的疫苗對策。
脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗已被廣泛地使用并且非常安全和有效。所用的脊髓灰質(zhì)炎病毒的生物活性分子克隆包括脊髓灰質(zhì)炎病毒1型(Mahoney菌株)(Racaniello，V.etal.，Proc.Natl.AcadSci.，U.S.A.78∶4887-4891(1981))和脊髓灰質(zhì)炎病毒1、2和3型薩賓疫苗菌株(Omata，T.etal.，Grene32∶1-10(1984);Toyoda，H.etal.，J.Mol.Bio.174∶561-585(1984))。也可以制成不大可能回復到毒性形式的脊髓灰質(zhì)炎病毒的衍生物，或可以通過核苷酸序列的插入、缺失、和/或修飾的定向誘變位點由毒性形式制成無毒性。
重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗可能是目前所用的口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的有用的取代物，該口服疫苗需要混合三種不同的減毒菌株(PV1、PV2和PV3)，這些菌株各自具有可變值的抗原效力并有回復到野生型病原形式的小風險。PV1被認為是最安全和最佳的抗原組分，而PV3公知具有回復到病原型式最高出現(xiàn)率的缺點。腸道病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒、以及NewerEnteroviruses。Melnick，J.L.InVirology(2ded.)，D.N.Fields，D.M.Knipeetal.(ed.)RavenPressLtd，NY1990，pp.549-604;Nkowane，B.M.etal.，Vaccine-AssociatedParalyticPoliomyelitisUnitedStates1973-1984JAMA，257∶1335-1340(1987);Melniok，J.L.PopulationGeneticsAppliedtoLivePoliovirusVaccine，Am.J.Pub.Health52∶472-438(1962)。一種以插入PV2和PV3的PV1為基的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒可能表明是比現(xiàn)有可獲得的更為安全的疫苗。此外，用以PV1為基的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，通過提供含有來自所有三種脊髓灰質(zhì)炎病毒血清類型抗原因子的最大限度減毒的，抗原有效的重組體病毒，有可能對全部脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒菌株達到有效的免疫性。
將重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒作為疫苗使用的特殊優(yōu)點是它一般是穩(wěn)定的，并且隨脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組因其復制可從細胞到細胞傳播，則可再現(xiàn)地攜帶插入的信息。結(jié)果，對有限制的若干劑量的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒而言，免疫應是有效的。此外，由于引入的抗原在感染的細胞內(nèi)得以表達，則細胞和體液兩者的免疫性將受激。雖然外源的核酸序列被重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒攜帶并在復制運行期間表達出來，但外源的蛋白不包括在成熟的病毒顆粒中。因此，重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒的病毒體結(jié)構(gòu)和載體范圍不以外源蛋白而變。許多重要的變量限制了現(xiàn)有疫苗的效能，特別是用在發(fā)展中國家，其中某些是實際的或經(jīng)濟屬性的結(jié)果，另些則具有生物學的基礎。用麻疹疫苗免疫是生物學障礙的良好實例，本發(fā)明用來克服這個障礙。麻疹在發(fā)展中國家造成每年死亡兩百萬個兒童。見Bloom，B.R.，Nature，342∶115-120(1989)。有效疫苗的存在可防止麻疹病毒感染，而母系衍生并可中和疫苗的抗體的存在則難以使它包含在兒童中的效能。見Murphy，B.R.和R.M.Chanock，InViroogy(2ded.)，B.N.Fields等人.(ed)，RavenPress，NY，pp.469-502(1990);Perblud，S.R和S.L.Katz，Vaccines，S.A.Plotkin和E.A.Mortimer，W.B.SaundersPublishing，Philadelphia(1988)。在發(fā)展中國家，麻疹感染的流行病學實況是使許多兒童在有效接種之前便生了此病。攜帶由麻疹病毒衍生的抗原的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒則能有助于克服這個障礙。脊髓灰質(zhì)炎病毒在出生后便可很快給用，它的效能不因存在母系衍生的抗體而明顯損失。脊髓灰質(zhì)炎-麻疹重組體病毒可在感染的細胞內(nèi)表達麻疹抗原，允許產(chǎn)生免疫響應。然而，由于麻疹抗原不包括在重組體病毒顆粒中，疫苗載體的復制應不受連累。
本發(fā)明的疫苗還能應用在其他領域。例如，腹瀉病能造成每年死亡5百萬至1千萬人。見醫(yī)療研究所，新疫苗部的著作，EstablishingPriorties，國家科學院出版，華盛頓，D.D.(1985)。輪狀病毒在嬰幼兒中是嚴重腹瀉的單一的最重要的病因?qū)W病原，可確信它每年造成近百萬人的死亡。見Kapikian，A.Z.和R.M.Chanok，InVirology(3ded.)，B.N.Field等人(Ed.)，RavenPress，NY，pp.1353-1404(1990)。在確定輪狀病毒感染對宿主的免疫響應方面已作出顯著進步的同時，疫苗的效果仍受病毒遺傳學的復雜性和現(xiàn)行疫苗株衰退而影響效能的限制。與之類似，霍亂病毒(V.Chlerae)抗原被描繪成很可能是保護性免疫響應的目標。然而抗霍亂的候選疫苗或受不希望有的副作用限制，或受不適當?shù)拿庖咝韵拗?。攜帶來自輪狀病毒和霍亂病毒的免疫原的，非病原的保護性決定因素的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒則對評估候選疫苗作了保證。
感染病原所致的呼吸病每年造成死亡一千萬人(用RSV代表初級病毒病原體)。見McIntosh，K.和R.M.Chanock，InVirology，(2ded.)，B.N.Field等人(Ed.)，RavenPress，N.Y.，pp.1045-1074(1990)。致力于研究RSV疫苗至今未果，但在鑒別保護性抗原方面已作出明顯進展。對RSV疫苗的要求是它必須有效，必須誘導粘膜免疫，而且在出生后很快給用，還要能避免母系衍生抗體的中和作用。重組體RSV-脊髓灰質(zhì)炎病毒能潛在地滿足所有這些要求。
預防B型肝炎病毒疾病也是本發(fā)明制備疫苗的目的。
B型肝炎病毒屬于叫做Hepadnaviridae的病毒族，該病毒含小環(huán)狀DNA片段，它局部是單鏈的。傳染性病毒也含有DNA聚合酶，它使DNA基因組完全成雙鏈的。B型肝炎病毒(HBV)的復制作業(yè)包括形成RNA中間物。
B型肝炎病毒散布于全世界。對于該病毒，人類象是它們的主要儲存庫，即使在某些非人類的初級動物種內(nèi)也發(fā)現(xiàn)這種病毒的表面抗原。據(jù)統(tǒng)計在美國每十萬人有22個肝炎病例，可以想象這個統(tǒng)計低估了十倍之多。這些病倒中的45%歸因于B型肝炎。因此可以估計出，在美國有1-1.25百萬人感染慢性B型肝炎。
傳播B肝病毒最有效的途徑是腸外方式引入。病毒已在受感染者的其它身體分泌物中被發(fā)現(xiàn)。但病毒傳播的其它模式尚未很好地確認。
HBV還與病毒的慢性感染者發(fā)展成初級肝細胞癌有關(guān)。這種病在非洲、中國、東南亞、阿提斯加和格陵蘭沿岸最流行。肝細胞癌和頑固的HBV感染常常伴隨著在相同緯度的地區(qū)散布。
本發(fā)明的另一個目的是預防由Bordetella百日咳造成的疾病。這種細菌是百日咳或哮喘咳的病原體，它是一種嚴重的有可能致命的呼吸道感染疾病。目前使用的百日咳疫苗含有B.百日咳的化學不活潑的健全細胞。非細胞的百日咳疫苗業(yè)已取得進展，它是基于B.百日咳培養(yǎng)基利用化學和物理分凝所得的物質(zhì)。
此外，將多種單一特定的百日咳抗原進行純化制備多種疫苗，然后合并成一種疫苗，此方法已有資料公開(EP申請484621)。這種疫苗中含有的抗原之一是69千道爾頓(69KD)的外部膜蛋白(Shahin，R.D.等人，美國微生物學會第89次年會文摘，p51，1989)，按照本發(fā)明可以制備這種抗原。
預防和治療皰疹造成的疾病(Herpetoviridae)也是本發(fā)明的又一目的。皰疹病毒是大的DNA病毒，它可建立潛伏感染，即可在宿主的活體內(nèi)存留，靜止期以后，這種病毒通過如免疫抑制或放散那樣的刺激而活躍起來。
1型皰疹單病毒是口腔病變?nèi)纭袄錆儭钡牟≡w。2型皰疹單病毒是生殖皰疹的病原體，它進一步牽連到宮頸癌。這些皰疹病毒目前在人群中蔓延，尚未有抗止病毒的疫苗注冊。
在研制抗皰疹病毒的過程中，疫苗利用了糖蛋白，它們由于病毒的進入而基本進入細胞。特別感興趣的糖蛋白是記作gD的皰疹單型1和2。編碼gD-1和gD-2的基因的DNA序列在US4818694和4891315中有述。按照本發(fā)明也可制備這兩種糖蛋白。還令人感興趣的是記作gB皰疹單型1和2。編碼gB-1和gB-2基因的DNA序列在資料中有述，見Stuve，L.L.等人，Virology，61∶326-335(1987)和Bzik，D.J.等人，Virology，155∶322-333(1986)。這兩種糖蛋白也按本發(fā)明的方法制備。
輪狀病毒所致的疾病是本發(fā)明的又一目標。輪狀病毒現(xiàn)已由WHO確認是嬰兒腸胃炎的主要成因，很早就以制備合適的疫苗將這種疾病置于人類控制之下(Bull.W.H.O.61∶251-254，1983)。
輪狀病毒基因組由雙鏈RNA的十一個片段構(gòu)成。這些基因編碼至少6個病毒的生成，它們在完整的病毒顆粒內(nèi)以雙骨架排列而存在。這些蛋白中的三個是外部骨架的糖蛋白。
在研制這種疫苗方面，所采用的一種方法是利用重組體DNA技術(shù)制備幾個輪狀病毒的外部骨架糖蛋白。這些糖蛋白之一被記作VP7。編碼VP7基因的DNA序列見資料Both，G.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80∶3091-3095(1983)。這種糖蛋白可按本發(fā)明的方法制備。
編碼外源生物的肽或蛋白質(zhì)的任何DNA序列(當它被表達時產(chǎn)生抗這種生物的，或抗被抗原造成的病況或失調(diào)的保護性免疫)可被認為是用于本發(fā)明目的的外源核酸。編碼一個或多個外源多肽的核酸序列(例如抗原或決定基)可包含在本發(fā)明的疫苗中。如果多于一種的外源抗原或決定基被外源核酸序列編碼，則它們是一種單一病原體的抗原或決定基，或者是來自多于一個病原體(不同的病原體)的抗原或決定基。在優(yōu)選實施方案中，這種生物是病原體的微生物。例如，這種外源決定基可在作為疾病或失凋病原體的細菌、寄生物、病毒或真菌上被發(fā)現(xiàn)。此外，變態(tài)反應源、精子和癌細胞的決定基均可被使用。這些細菌、寄生物、病毒或真菌包括在下面所列的，但非限制性的舉例中。
有復制能力的重組體病毒可用作疫苗抗廣泛范圍的病原體。例如，可由下列任何生物中獲取DNA或RNA，并用來制備重組體病毒。
寄生物瘧原蟲.
艾美球蟲屬spp.
血吸蟲spp.
錐蟲spp.
巴貝蟲spp.
利士曼蟲spp.
似隱孢菌spp.(Cryptosporidia)弓形體蟲spp.
肺囊蟲spp.
細菌霍亂弧菌膿鏈球菌腦脊膜炎雙球菌淋病雙球菌白喉柯南氏菌破傷風梯狀芽胞桿菌粘膜炎布蘭漢氏菌百日咳博德特氏菌嗜血桿菌spp.(如流感)衣原體spp.
大腸埃氏菌共生亞種病毒人體免疫缺乏病毒，Ⅰ型人體免疫缺乏病毒Ⅱ型猿猴免疫缺乏病毒，人體T淋巴熱病毒，Ⅰ和Ⅱ型呼吸合胞體病毒A型肝炎病毒B型肝炎病毒C型肝炎病毒非A非B型肝炎病毒Ⅰ型皰疹單體病毒Ⅱ型皰疹單體病毒細胞巨化病毒流感病毒副流感病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒輪狀病毒日冕形病毒屬風疹病毒麻疹病毒流行性腮腺炎病毒水痘病毒愛-巴二氏病毒腺病毒屬乳頭狀瘤病毒屬黃熱病毒狂犬病毒真菌念球菌疹spp.(尤其是白體)隱球菌spp.(尤其是新型細球菌)
芽生菌spp.(皮炎的)組織胞漿菌spp.(尤其是capsulatum)球孢子菌spp.(尤其是immitis)類球孢子菌spp.(尤其是brasiliensis)曲霉屬spp.
適于構(gòu)成疫苗的潛在有用的抗原可以下列各種判據(jù)來鑒別，例如在中和病原體感染性中內(nèi)抗原的拖累(Norrby，E.，1985，Summary，InVaccines85，Larnet，R.A.，R.M.Chanock以及F.Brown(eds).，ColdSpringHarborLaboratry，ColdSpringHarbor，NY，pp388-389)、抗原的類型或組別特異性、以病員的抗血清或免疫細胞識別、和/或以抗血清或免疫細胞對抗原的保護性作用證明。此外，編碼的決定基最好在編碼時或在同病原體的不同分離體中間應顯示很小程度或不顯示抗原的改變。
已知的含抗原決定因素的肽或蛋白可被結(jié)合進重組體病毒。如果未知特定的抗原，應進行免疫活性序列的識別和特征化。實現(xiàn)此目的的一種方法是通過將產(chǎn)生的單克隆抗體用于病原體表面或用于病原體的其它分子。能被抗體識別的肽序列是限定的決定基。作為選擇，接合在載體分子上的少量合成肽可在完整的分子上對結(jié)合劑相應于肽的位點的單克隆抗體進行實驗(例如見Wilson等人，Cell37∶767(1984))，為鑒別和特征化抗原決定因素的本領域公知采用的其它方法，也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的疫苗構(gòu)成中，外源蛋白也可包括外源生物的決定基。當外源多肽在脊椎動物宿主內(nèi)被表達時，它引出免疫響應，保護宿主抵抗由含該決定基造成的病況或失調(diào)。例如，在本發(fā)明的這種實施方案中，可使用下列物的決定基或蛋白的外源蛋白蛇毒、蜂毒、激素、精子(避孕用)，誘發(fā)變態(tài)反應性抗原，或任何免疫響應所要求的抗原。在另一實施方案中，特殊腫瘤的抗原可被表達作重組體外源蛋白，以便誘發(fā)抗癌的保護性免疫響應。
編碼被本發(fā)明重組體病毒所表達的外源蛋白的基因序列可用本領域公知技術(shù)分離，它非限制地包括由微生物基因DNA純化、利用重組體DNA的方法(Maniatis等人，MolecularCloning，ALaboratoryManual，1982，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)，或者利用化學合成。
當把它們用作疫苗時，可用公知方法將本發(fā)明的重組體病毒投藥于個體。它們一般被投藥的途徑與常規(guī)(現(xiàn)有可得的)疫苗的投藥途徑相同，和/或通過使感興趣病原體發(fā)生感染所用的途徑。例如，重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗可口服給藥，而另外的疫苗如重組體麻疹或重組體黃熱病屬疫苗則可皮下給藥。它們可以以疫苗組合物的形式給藥，除含有有復制能力的重組體病毒之外，該組合物含有生理學許用的載體。該組合物還可含有免疫激勵劑或佐劑，香味劑或穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的重組體病毒，尤其是重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒也可被用作一種體系，用以在宿主細胞內(nèi)產(chǎn)生外源多蛋白，諸如在哺乳動物尤其是人的細胞或其它類型細胞內(nèi)(例如被修飾成有脊髓灰質(zhì)炎病毒受體的哺乳動物細胞)產(chǎn)生外源多蛋白。然后用公知的方法將外源蛋白從產(chǎn)生它的細胞中分離出來。
在兩種應用中(即免疫或組織培養(yǎng)基的制備)，引入病毒的外源核酸序列可從下列的一個源中獲取天然產(chǎn)生它的源，用基因工程方法或化學合成制備的源。引入病毒的外源核酸序列可編碼完整的，所需免疫響應所抗的抗原，或抗原決定基或抗原部份。插入病毒基因組的核酸序列的大小未顯現(xiàn)出受限制?？梢詼y定外源核酸序列的最大尺寸，例如用前述的分析其對病毒的復制作用來測定。編碼至少150個附加氨基酸(即450個核甙酸)的外源核酸序列已被插進脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，并且沒有明顯的病毒復制效能的損失。預料插入的序列對宿主而言存在免疫體系，抗原結(jié)構(gòu)則由初始序列和結(jié)構(gòu)型態(tài)兩者限定。
植物病毒也可用作親代病毒，如前所述向其中引入外源核酸序列。例如，可使用帶DNA基因組的植物病毒(如菜花花葉病毒)或帶RNA基因組的植物病毒(如煙葉病毒，蘿卜黃葉病毒)?？蓪⑵渫ㄟ^引入將在植物內(nèi)表達的編碼外源多肽(如抗昆蟲或疾病的毒素)的外源核酸序列(或序列組)來修飾。所得有復制能力的重組體植物病毒隨后被引入植物(例如引入種子或在植物生長的其它階段引入)，在其內(nèi)產(chǎn)生外源多肽。例如，編碼毒素(例如蝎子或蜘蛛毒素)的外源核酸序列可以這樣引入，使其在植物內(nèi)表達，從而保護它不受靠其為生的昆蟲的損害。此外，在其內(nèi)表達外源核酸序列的植物也可當做被編碼蛋白或多肽的來源而口服給藥。
與此類似，親代病毒可以是動物病毒，它被修飾成包括有待在動物內(nèi)表達的外源核酸序列(例如保護動物或令其抗病原體免疫或提供生長增益因子)。
下列實施例將說明本發(fā)明，但毫無意圖以任何形式限制本發(fā)明。
實施例實施例1.構(gòu)成脊髓灰質(zhì)炎病毒載體cDNA克隆分子克隆的全部操作都遵循標準重組體DNA方法學(Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsInMolecularBiology，GreenePublishing-WileyInterscience，NecoYork，1987)。所用的脊髓灰質(zhì)炎病毒的生物活性分子克隆包括1型脊髓灰質(zhì)炎病毒(Mahoney菌株)(Racaniello，V.等人，Proc.Natl.AcadSci.，U.S.A.78∶4887-4891(1981))和1、2及3型脊髓灰質(zhì)炎病毒的Sabin疫苗菌株(Omata，T.等人，Gene32∶1-10(1984);Toyoda，H.等人，J.Mol.Bio.174∶561-585(1984))。這些分子克隆已通過在病毒基因的5′末端插入T7RNA聚合酶啟動子而被修飾，以便促進通過感染性脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA的T7RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄。(見Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePablishing-WileyInterscience，N.Y.(1987))。脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組已進一步被修飾成包括一種含有多個限制性酶識別部位的編碼內(nèi)合成多聚接頭(即EcoRⅠ和XhoⅠ)。在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組內(nèi)插入的序列包括在其3′邊緣的編碼脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒3C蛋白酶(AXXQG)識別和分裂部位的這些序列(Palmenbery，A.C.，Ann.Rev.Microbic.44∶603-623(1990))?？衫霉囊灾丿B擴展形式將聚合酶鏈反應(PCR)變型的方法來進行這些修飾(Horton，R.M.等人，Biotechniques8∶528-535(1990))?？捎靡韵?型脊髓灰質(zhì)炎病毒的實施例來說明。
簡言之，使用1和2，以及3和4(見表)低聚核甙酸進行兩個獨立的PCR反應，以使分別放大1-740和740-1540位置的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的部份。
表1.用于放大的引物低聚核甙酸號數(shù)序列1-5'-TAC GGT CGA CCT AAT TAC GAC TCA CTATAGG-3'(SEQ ID #1)2-5'-TTG AAA CAA AGC CTC CCT CGA GGG GAATTC CTG AGC ACC CAT TAT G-3'(SEQ ID#2)3-5'-CCC TCG AGG GAG GCT TTG TTT CAA GGTGCT CAG GTT TCA-3'(SEQ ID #3)4-5'-ATT ATC TGG TGC GGG AAC ACA AAG GC-3'(SEQ ID #4)5-5'-TCA GGA ATT CAC ACC TCA AAA TAT T-3'(SEQ ID #5)6-5'-TCA GCT CGA GGG ATT TGC CAT ACT AAT-3'(SEQ ID #6)含有待插入片段的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化，而第二PCR放大則用1和4號低聚核甙酸引物進行。由這種放大而得的1582堿基對(bp)DNA片段表示42核甙酸插入物(攜帶新的限制性酶位點和編碼蛋白酶水解加工信號的片段)和序列1-740，以及740-1540。(42核甙酸插入物插在堿基740和741之間)。這個片段可用SaⅠ1-Aat2消化，以凝膠電泳純化并捆扎到SaⅠ1-Aat2消化的脊髓灰質(zhì)炎病毒克隆的pSR-XpA上(前面已述的含全長脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA克隆的質(zhì)粒(Andino，R.等人，Cell63∶369-380(1990))。所得質(zhì)粒(稱作pMV2.2)通過用ClaI消化使之線性化，并且通過常規(guī)程序用T7聚合酶進行病毒RNA的體外合成(Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsInMolecularBiology，GreenePublishing-WileyInterscience，NewYork，1987)。
通過將體外合成的脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA轉(zhuǎn)染進HeLaS3細胞，以回收有復制能力的脊髓灰質(zhì)炎病毒，如資料所述(Lnthman，H.等人，Nucl.AcidsRes.11∶1295-1308(1983))。通過標準技術(shù)并參考復制能力、結(jié)構(gòu)組成和核甙酸序列進行回收病毒的特征化(Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsInMoleculorBiology，GreenePublishing-WileyInterscience，NewYork，1987)。
由各種病毒和細菌病原體衍生的外源基因序列已在這些重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)表達。通過下文中完整的霍亂毒素B亞單位的實施例說明所用的一般對策。含有下列序列的低聚核甙酸(挑選允許編碼內(nèi)插入脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的)被用來放大質(zhì)粒pJM17內(nèi)含有的整個霍亂毒素B亞單位編碼區(qū)(Pearson，D.N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.79∶2978-2980(1982))5′-TCA GGA ATT CAC ACC TCA AAA TAT T-3′(SEQ ID #5)5′-TCA GCT CGA GGG ATT TGC CAT ACT AAT-3′(SEQ ID #6)在表中這些是列出的5和6號引物。
所得的312bpDNA用EcoRI和XhoI消失(通過PCR引物引入的位點)，并捆扎在EcoRⅠ和XhoⅠ分裂的pMV2.2上。所得質(zhì)粒記作pPCH-52，并將繼RNA轉(zhuǎn)染獲得的病毒記作PCH52。類似的方法可用來插入由霍亂弧菌(tcpA)的毒素共調(diào)節(jié)毛發(fā)的質(zhì)?？寺⊙苌男蛄?Sun，D.等人，Infect.Immun.59∶114-118(1991))，輪狀病毒VP4基因(Gorziglla，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.87∶7155-7159(1990))和插入流感A病毒凝血基因(Wiley，D.C.等人，Ann.Rev.Biochem.56∶365-394(1987))。對tcpA，核酸序列插入在蛋白質(zhì)的相應的氨基酸的羧基終端(157-199)。對流感A病毒，核酸序列插入在相應的氨基酸134-284。通過Western印跡分析可進行重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的免疫學特征化以記錄合適的表達，脊髓灰質(zhì)炎病毒構(gòu)成和插入序列的加工(Ausubel，F(xiàn).M.等人.，CurrentProtocolsInMolecularBiology，GreenePublishing-WileyInterscience，NewYork，1987)。天然病毒體組成和結(jié)構(gòu)的保留可以被證實，方法是通過被感染細胞有新陳代謝標記的溶胞產(chǎn)物(35S)進行常規(guī)蔗糖梯度(15-30%)離心沉淀。然后用標準的SDS-PAGE分析法分析梯度餾份(Ausubel，F(xiàn).M，等人，CurrentProtocolsInMolecularBiology，GreenePublishing-WileyInterscince，NewYork，1987)。
實施例2.攜帶霍亂弧菌B毒素亞單位的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的構(gòu)成及評估重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒被構(gòu)成為或是含有來自霍亂毒素亞單位B的整個編碼區(qū)(103個氨基酸)，或是含有輪狀病毒VP4殼體蛋白的幾個部份(21-104氨基酸長度)。編碼亞單位B或VP4肽的DNA片段可被放大，并且其尾端通過包括以克隆為目的的合適的限制性位點來修飾。由毒素A亞單位的分離物中表達的霍亂B亞單位是無毒性的，但提供了一種抗原刺激物以提高保護性免疫響應。DNA片段被插入脊髓灰質(zhì)炎病毒載體cDNA克隆，并且RNA由所得質(zhì)粒被轉(zhuǎn)錄?；魜y毒素亞單位B和輪狀病毒VP4重組體cDNA克隆分別被轉(zhuǎn)染進HeLa細胞。于37℃培養(yǎng)3天后得到了重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒斑(見圖2)。圖2顯示了親體和重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒斑的形貌。由經(jīng)野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒(第1行)感染或是經(jīng)霍亂毒素B-脊髓灰質(zhì)炎病毒重組體病毒(第2行)感染的HeLa細胞制備的萃取用SDS-PAGE凝膠進行電泳并進行Western印跡分析。對于完整的霍亂毒素(A和B亞單位)用兔抗原有效物研究Western印跡。正如所見到的，表達了B亞單位，并在重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的范圍內(nèi)進行了適宜的加工(箭頭所示)。
用親本脊髓灰質(zhì)炎病毒(圖3B，第1行)或用霍亂毒素B-脊髓灰質(zhì)炎重組體病毒(圖3B，第5行)，將感染的同樣的HeLa細胞的萃取物用兔抗體進行探測識別脊髓灰質(zhì)炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白。正如所見，在重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)制造了比正常較大的P1多蛋白，這是因為存在外源多肽所致。合適的蛋白水解加工隨后產(chǎn)生脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白產(chǎn)物的正常補體，以及放出外源霍亂毒素序列。重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的免疫特征化以Western印跡分析來進行(Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBilolgy，GreenePublishing-WileyInterscience，NewYork，1987)。以常規(guī)密度梯度離心沉淀和Western印跡分析來證實天然病毒體結(jié)構(gòu)的保留(Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishing-WileyInterscience，NewYork，1987)。
實施例3.重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫力評估研究初始免疫力的核型采用表達人類脊髓灰質(zhì)炎病毒受體的轉(zhuǎn)移基因的鼠體(Ren等人，Cell 63∶353-362，1990;由Vincent Racaniello博士友好提供)。向轉(zhuǎn)移基因的鼠體肌內(nèi)注射重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒(50μl的2×108pfu/ml原種)令其感染，該病毒在Mahoney范圍或Sabin為基的載體(分別記作MoSB和MsSB)內(nèi)表達整個的霍亂毒素B亞單位(CTB)。對照的鼠體假感染，或用表達霍亂弧菌傘毛蛋白(TcpA)(MoPi)的重組體病毒感染。在以30天隔開的兩個時刻對鼠體進行感染43天后，對接種的鼠體用在不完整的Freund佐劑內(nèi)的10μg純化CTB(Calbiochem)作腹膜內(nèi)注射。五天后，將鼠體放血，并檢驗其血清中IgG抗體與純化CTB反應的出現(xiàn)情況。隨后以Western印跡分析測定與CTB反應的抗體。在一個10%聚丙烯酰胺凝膠的單獨的寬通道內(nèi)，使CTB(5ng)經(jīng)受SDS-PAGE分離作用，并將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維上。由被免疫的動物取血清(1∶100稀釋)裝入多溝槽儀器的單獨通道中(Mini-ProteanⅡ型，多重濾網(wǎng)，BioRad)。使用親合性純化的與過氧化物酶連接的兔體抗鼠IgG，按標準方法(ECL，Amersham)檢測結(jié)合的抗體。
這項分析的結(jié)果列于圖6。用CTB-重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫的五只鼠體取五份血清(MoSB(3-7通道))，血清清楚地含有與CTB單體和五聚物反應的IgG抗體。由假感染(1和2通道)或無關(guān)對比物(MoPi，12-14通道)的血清中，不出所料，缺少這種特殊抗體。此外，用Sabin為基的重組體的表達CTB的脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫的鼠體，并不顯示CTB-特定抗體的反應性(MsSB，8-11通道)。這些初步結(jié)果揭示了許多結(jié)論。首先，用重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的免疫，或是能直接產(chǎn)生，或是專門引出免疫動物內(nèi)的適宜的抗體響應。類似地用純化CTB免疫的對比鼠體血清中，則缺少CTB-特定抗體，并且CTB-反應抗體的IgG同模標本似乎表明接種已誘導了記憶響應。對此雖然原因不明，但可涉及重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的有關(guān)復制特性，并且通過加大重組體病毒疫苗的劑量是可分辨的。野生型和重組體Sabin的脊髓灰質(zhì)炎病毒二者的復制比其野生型Mahoney逆向部份要稍好些。進而言之，這些試驗中所用的轉(zhuǎn)移基因鼠體并不支持脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin疫苗的有效復制。因此，有限的活體外復制可以通過Sabin為基的重組體防止有效免疫的產(chǎn)生。
實施例4.重組體病毒安全性評定與實驗重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的免疫性力相平行，進行初步研究以評定該病毒的安全性。為此目的，基因轉(zhuǎn)移的鼠體接受腦內(nèi)接種，或用親代Mahomey(病原體的)，或用Sabin(減弱的)菌株，或者用表達CTB的其重組體衍生物，接種物用量要等值(5×106pfu)。雖然所有用Mahoney菌株接種的鼠體均被麻痹，但用重組體注入的鼠體卻沒有一個經(jīng)受麻痹。這個結(jié)果揭示，在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組內(nèi)插入CTB序列后，所得重組體病毒的致病力衰減而不是增大。對這種現(xiàn)象的進一步研究正在進行。
實施例5.另外的有復制能力的脊髓灰質(zhì)炎病毒的構(gòu)成圖2所示意代表的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的類似的方式構(gòu)成，使用本文所述的方法和物質(zhì)(見實施例1和2)，以及本領域的識別方法。為了對在位點而不是在重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒多蛋白的5′表達外源編碼序列的潛能進行檢查，在病毒基因組內(nèi)許多另外的位置引入多聚接頭/蛋白水解的加工特色。這些位點包括VP1和2A(pMoV2.1和pMoV2.2)之間的接點，2A和2B(pMoV2.5)的接點，2C和3A(PMoV3.1)的接點，以及Vpg和3C(PMoV3.5)的接點。為了促進在病毒多蛋白內(nèi)部外源序列的加工，在插入物的兩端包納了合適的蛋白水解的加工信號。以此方式引入時，插入物的三個新位點允許穩(wěn)定地攜帶所要求的插入物的有復制能力的重組體病毒產(chǎn)生，所得病毒在圖2中示出，記作PMoV2.1，PMoV2.2，PMoV2.5和PMoV3.1的都是有復制能力型;事實上，在接近野生型斑形貌學和復制動力學處顯示。病毒復制的取消中所造成僅有的重組體修飾位于Vpg和3C的接點處的插入序列。在病毒基因組內(nèi)至少四個可能的位置上插入外源抗原序列的能力允許了重組脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗衍生物中的靈活度。
如圖2所示，構(gòu)成包括3C分裂位點的載體和包括2A分裂位點的載體。利用脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶來釋放自多蛋白前體的外源序列的形體包括Q-G加二位點。類似的重組體病毒(它可傳播脊髓灰質(zhì)炎病毒2A蛋白酶以便對重組多蛋白前體的合適的加工起作用)包括被Y-G對和環(huán)繞的氨基酸提供的特征化2A加工位點。圖2中病毒PMoV2.1和PMoV2.2代表了這個2A為基的載體，并如上所述，在近野生型生長處顯示。構(gòu)成的脊髓灰質(zhì)炎病毒載體(圖2)含有比圖1所示重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒中存在的要更多的擴展性多聚接頭序列(EcoR1，Not1，EssH2和Xho1)，以促使所要求的外源核酸序列易于插入重組體載體。此外，還能成功地衍生變體，該變體包括鄰近插入序列的一種多甘氨酸鏈，以便增強該區(qū)域的結(jié)構(gòu)靈活度，并潛在地加大蛋白酶加工的效能?？傊?，這些載體增進了基本對策的多方適應性，提供了多種多樣的替代方法以利于疫苗載體的產(chǎn)生。
外源核酸序列或序列群(各自編碼被表達的蛋白或多肽);核酸序列或序列群[各自編碼蛋白水解分裂位點(如3C蛋白水解位點或2A蛋白水解位點)]可在任何這些位點處被引入親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，使用公知方法或本文所述方法皆可。如上所述可評定所得重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒產(chǎn)生編碼的蛋白或多肽的能力。也可評定重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的免疫力及其安全性。(見實施例3和4)。
實施例6.構(gòu)成重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的對策上述實施例1-5利用了插入含限制酶識別位點的編碼內(nèi)的合成多聚接頭的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組。本實施例6敘述了構(gòu)成重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒結(jié)構(gòu)的對策，該病毒不要求在外生基因插入位點周圍引入外源限制酶或改變側(cè)接的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組。本實施例6進行敘述具有多蛋白開放讀碼的編碼中插入外源核酸序列的對策。下面實施例7-9敘述了本發(fā)明重組脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)插入專門的外源核酸序列，以便形成表達外源多肽的載體。
本實施例6利用了Racaniello和Baltimcre體系，該體系允許脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因操作(Racaniello，V.R.和Baltimore，D.，Science，214∶916-919，1981)。含全長度脊髓灰質(zhì)基因RNA的cDNA復制品的質(zhì)粒，被發(fā)現(xiàn)隨著在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染進入合適的宿住細胞后產(chǎn)生感染病毒，這個體系已用來研究許多方面，如脊髓灰質(zhì)炎病毒的復制，基因穩(wěn)定性，以及疫苗菌株的衰減。
特別是所用的脊髓灰質(zhì)炎病毒載體是由質(zhì)粒PLED3.2衍生的。質(zhì)粒PLED3.2是由質(zhì)體pBR322構(gòu)成的，其中插入了Sabin3型脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的全長度cDNA復制品。而Sabin3型病毒通常是用在口服脊髓灰質(zhì)疫苗中的一種衰減培養(yǎng)后的菌株。脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA在噬菌體T7RNA聚合酶啟動子之后被克隆。這種啟動子的存在可允許用T7RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄，以生成全長度的RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本可在轉(zhuǎn)染進入組織培養(yǎng)細胞后產(chǎn)生脊髓灰質(zhì)炎病毒。質(zhì)粒PLED3.2的樣品用美國型培養(yǎng)物收集器沉淀(12301ParklawnDrive，Pockville，Maryland20852，U.S.A，1991年8月20日)，樣品注冊登記號為ATCC75062。
將外源核酸序列插入具有脊髓灰質(zhì)炎病毒多蛋白開放讀碼的碼中的對策包括使用重疊擴展聚合酶鏈反應(PCR)(Horton，R.M.，等人，Gene，77∶61-68(1989))。這種方法允許在無需引入限制性位點的情況下融合基因序列。該外源基因被連接到具有多蛋白開放讀碼的碼中而不需變更側(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒序列。
這一對策包括兩個PCR周期第一周期將重疊的側(cè)接序列引入到待克隆化的基因上;第二周期使用兩個PCR片段作為模板DNA并導致用重疊序列作為媒介的準確的融合。
表達克隆是使用重疊擴展PCR將一個外源基因融合到脊髓灰質(zhì)炎病毒多蛋白編碼區(qū)域的起始處(堿基743)而構(gòu)成。此外，編碼灰質(zhì)3C蛋白酶識別部位的序列插入3′至外源基因。用于下述實施例中的特定引物列于表2。
表2將外源基因克隆進pLED3.2的引物引物定向序列(5'-3')pLED3.2位置A意義CAGGATTTCAGTGTCACAATGGA(725-745)GAACATCACATCAGGATTTCTAGGACC(SEQ ID #7)B反意義TACTTGAGCTCCTTGAAACAAAG(757-746)CAATGTATACCCAA(SEQ ID#8)C意義ATCTTCGACGCGTTGCGCTC(270-289)(SEQ ID #9)D反意義TGTGACACTGAAATCCTG(SEQ(742-725)ID #10)E意義GCTTTGTTTCAAGGAGCTCAAGT(746-764)ATCATCCCAA(SEQ ID #11)F反意義TCTTCCTAGGTAGTGGTAAT(1258-1239)(SEQ ID #12)G意義GACAGGATTTCAGTGTCACAATG(723-745)GGGCAGAATCTTTCCACCAGCAAT(SEQ ID #13)H反意義TTGTGGAATTCCACTGCATGGCCTGAGGATGAGTGTTTCTC(SEQID #14)I意義GACAGGATTTCAGTGTCACAATG(723-745)CAGTGGAATTCCACAACCTTCCACCA(SEQ ID #15)
表2(續(xù))將外源基因克隆進pLED3.2的引物引物定向序列(5'-3')pLED3.2位置J反意義CTGTGGAAGCGCCTTAATTAAGTTAACGCGGCCGCCCATTGTGACACTGAAATC(SEQ ID #16)K意義ATGGGCGGCCGCGTTAACTTAATTAAGGCGCTTCCACAGGGAGCTCAAGTATCATCC(SEQ ID#17)L意義TCACCTTCGTGGTAACCGCCAAC(2871-2894)T(SEQ ID #18)M反意義CTGTGGAAGCGCCTTAATTAAGTTAACGCGGCCGCCATATGTGGTCAAACCTT(SEQ ID #19)N意義TATGGCGGCCGCGTTAACTTAATTAAGGCGCTTCCACAGGGCTTGGGCATCAGAATAA(SEQ ID#20)O反意義ATCGTGCTGGTCACCATGCTG(3929-3909)(SEQ ID #21)P意義CAGGATTTCAGTGTCACAATGTA(725-745)CGGAATAGAATATACC(SEQID #22)Q反意義GCTCCTTGAAACAAAGCTACTCT(750-746)GTAATAGAACGCTG(SEQ ID#23)
第一周期PCR反應包含近似2ng模板DNA，100pmol每種引物，200μmol每種dNTP，10mM KCl，10mM Tris-鹽酸鹽，pH8.3，3.75mM MgCl2和5單位Ampli Taq DNA聚合酶，Stoffel片段(Perkin-Elmer/Cetus，Norwalk，CT)。反應在用40ml輕礦物油覆蓋的100μl容積中發(fā)生。PCR循環(huán)條件是95℃2分鐘，冰點2分鐘，繼而95℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃2分鐘，進行30次循環(huán)。所得的PCR片段使用Promega公司的MagicPCR藥盒(Promega，Madison，WI)或通過瓊脂糖凝膠電泳提純(Sambrook，J.，等人，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))。
側(cè)接堿基743的pLED3.2區(qū)域也在第一周期PCR反應中放大，提供了形成融合的第二模板DNA。附加的重疊序列不加到這些片段上;這就允許這些片段被用于構(gòu)成許多不同的融合，而每種融合包含不同的外源基因。用于該區(qū)域上游(5′)到堿基743的引物是引物C和D(參看表2)。用于該區(qū)域下游(3′)到基體743的引物是引物E和F(參看表2)。這些反應的模板是用XbaⅠ線性化的pLED3.2。PCR反應如上所述而進行。這些反應分別產(chǎn)生pLED3.25′和3′區(qū)域的472堿基對和524堿基對的片段。所得的PCR片段用0.8%低熔點瓊脂糖(SeaPlaque，F(xiàn)MC(Rockland，ME))提純，然后用作后續(xù)反應的模板。
第二周期的PCR反應包括將上述兩部份PCR片段混合，并在外部引物存在的情況下進行放大，以產(chǎn)生最終的融合產(chǎn)物。在實施例7-11所述的構(gòu)成中，外源基因在分別的PCR反應中與5′或3′片段融合。然后將該融合產(chǎn)物使用存在于該質(zhì)粒中的獨特的限制性位點克隆進pLED3.2。
第二周期的PCR反應包含μl每種模板，100pmol每種引物，200μmol每種dNTP，10mM KCl，10mM Tris-鹽酸鹽，pH8.3，3.75mM MgCl2和5單位Ampli Taq DNA聚合酶，Stoffel片段(Perkin-Elmer/Cetus)。反應在用40μl輕礦物油覆蓋的100μl容積中發(fā)生。第二周期反應的PCR循環(huán)條件為94℃5分鐘，72℃10分鐘，繼而94℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃2分鐘，進行30次循環(huán)。融合的片段在0.8%低熔點瓊脂糖上分離，用適宜的限制性內(nèi)切酶消化并亞克隆進行pLED3.2。
實施例7構(gòu)成攜帶B型肝炎表面抗原的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒將如同實施6所述的由質(zhì)粒pLED3.2所衍生成的脊髓灰質(zhì)炎病毒載體用于構(gòu)成表達B型肝炎病毒的表面(S)抗原的S基因編碼的病毒載體。已發(fā)現(xiàn)該S抗原對B型肝炎病毒是保護性的。該S抗原是一種226氨基酸長度的一種蛋白質(zhì)。在本實例中，B型肝炎的S基因是由人類病毒的亞型ayw，特別是由克隆化基因的DNA衍生的。由亞型ayw衍生的B型肝炎的S基因是長度上為675堿基對(Galiber，F(xiàn).，等人，Nature，281∶646-650(1979))。
引物A和B(參看表2)被用于第一周期的PCR，以放大該S基因并將重疊的pLED3.2序列摻入該PCR產(chǎn)物中。在這兩個引物中的劃線序列對應于pLED3.2中的序列，同時剩余的序列相應于S基因。在引物A中，該S基因序列對應于B型肝炎基因組中堿基對157處S抗原的起始密碼子。反義引物B編碼S抗原加灰質(zhì)3C蛋白酶識別部位的羧基末端。這些引物用作對克隆化B型肝炎DNA的模板，以產(chǎn)生717堿基對的PCR片段。第一周期PCR循環(huán)條件不同于實施6所述的條件并如下述94℃2分鐘，冰點2分鐘，繼而94℃1分鐘，26℃1分鐘，70℃2分鐘，進行10次循環(huán)，94℃1分鐘，45℃1分鐘，70℃2分鐘，進行20次循環(huán)。
第二PCR反應使用如上所述的PCR片段，以便在pLED3.2側(cè)接區(qū)域和該S基因之間產(chǎn)生融合。兩個PCR反應或是用5′LED側(cè)接區(qū)域或是用3′LED側(cè)接區(qū)域加S基因PCR片段作為模板而進行。用于5′融合的意義引物是引物C，它在pLED3.2側(cè)接區(qū)域的5′端處引發(fā)。反意義引物B在S基因的3′端處引發(fā)。對于3′融合，意義引物是S基因意義引物(A)，以及3′LED3.2反意義引物(F)。所得的PCR片段對于5′和3′融合分別是1175和1222堿基對。然后用瓊脂糖凝膠電泳提純?nèi)诤系钠巍?br> 然后用限制性內(nèi)切酶消化由第二周期PCR反應得到的融合片段，最終構(gòu)成含S基因的脊髓灰質(zhì)炎病毒的載體，LED3.2-S基因的融合體用MluⅠ和BstⅪ(S基因中的單一的位點)消化。而3′LED3.2-S基因的融合體用AvrⅡ和BsttXI消化。質(zhì)粒pLED3.2在堿基對278處用MluI消化，并在堿基對1249處用AvrⅡ消化，以除去971堿基對的片段。接在用0.8%瓊脂糖凝膠電泳提純之后，將所得的消化物混合并使用標準方法(Sambrook等人，supra)結(jié)扎在一起以形成pLED3.2/HBV。這一具有全段長的灰質(zhì)-融合構(gòu)成物的DNA序列是使用一套應用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)(FosterCity，CA)370ADNA定序機予以確認。
接著進行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染反應。由T7啟動子產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本被轉(zhuǎn)染進Vero細胞中以產(chǎn)生感染的脊髓灰質(zhì)炎病毒。對于這些實驗而言，為產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本，通過用PvuⅠ消化該質(zhì)粒制備近似為5μgpLED3.2/HBV。PvuⅠ的消化導致兩個片段，含有T7啟動子的較大片段，繼而是含有S基因融合體的全段長的灰質(zhì)基因組。此消化反應用酚萃取并用乙醇沉淀。沉淀的DNA重新懸浮于20μl水中。全段RNA轉(zhuǎn)錄本使用T7RNA聚合酶在體外通過PvuⅠ消化的DNA合成(Moss，E.G.等人，J.Virol.，63∶1884-1890(1989))。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。
將匯合的25cm2Vero細胞單層使用DEAE-轉(zhuǎn)染規(guī)定由轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染(Van der Werf，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，83∶2330-2334(1986))。將近似為25μg RNA與DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后復蓋到Vero細胞上。接在室溫培養(yǎng)30分鐘之后，去除接種物并洗滌細胞。加入新修飾的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷維持液并在33.5℃培養(yǎng)細胞。接在培養(yǎng)5天之后，觀察到總的細胞致病作用(單層中細胞的溶胞作用)，并由培養(yǎng)基中收獲重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。
由構(gòu)成物pLED3.2/HBV產(chǎn)生的含重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的病毒原種通過在Vero細胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重組體病毒中萃取RNA，并使用GeneAmp熱穩(wěn)定的rTth逆轉(zhuǎn)錄酶RNAPCR藥盒(Perkin-Elmer/Cetus)通過逆轉(zhuǎn)錄作用和PCR進行分析。結(jié)果證明，S基因通過培養(yǎng)基中的通道穩(wěn)定地保持在重組體pLED3.2/HBV病毒中。
可用多種方法分析來自脊髓灰質(zhì)炎病毒中的S抗原的表達。已有標準步驟的這些方法包括免疫過氧化酶染色感染細胞，病毒和外部蛋白質(zhì)的免疫沉淀，Westen印跡和點印跡(Coligan，J.E.，等人，eds.，CurrentProtocolsinImmunology，JohnWileyandSons(1992))。
免疫過氧化酶染色定用于檢測病毒感染的Vero細胞中的蛋白質(zhì)。用病毒感染Vero細胞并在各個感染后的時刻用乙醇或甲醇固定。被固定的細胞單層用抗脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)或S抗原的抗血清培養(yǎng)。洗滌平皿，然后用接合到辣根過氧化酶(HRP)上的第二抗體(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白(G)培養(yǎng)。再次洗滌平皿然后加入HRP基質(zhì)，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。表達與抗體交叉反應的蛋白質(zhì)的細胞被染色。
將Vero細胞單層用重組體病毒感染，細胞的溶胞產(chǎn)物可通過對存在的病毒編碼的蛋白質(zhì)作免疫沉淀或Western印跡法而確定。對于免疫沉淀而言，用抗脊髓灰質(zhì)炎病毒或外生蛋白質(zhì)的抗血清培養(yǎng)細胞的溶胞產(chǎn)物。然后將蛋白質(zhì)A瓊脂糖Sepharose(Sigma，St.Louis，MO)加入該混合物并進一步培養(yǎng)。將此瓊脂糖(Sepharose)珠粒離心處理，洗滌并用SDS離解緩沖液洗脫。沉淀的蛋白質(zhì)可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析。對于Western印跡法，用SDS-PAGE分離該細胞溶胞產(chǎn)物，將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素中，并用抗血清培養(yǎng)到關(guān)注的蛋白質(zhì)上。洗滌印跡，用接合到HRP上的第二抗體(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培養(yǎng)。再次洗滌印跡，然后加入HRP基質(zhì)，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)加過氧化氫，以鑒定交叉反應的蛋白質(zhì)。
在本實施例7和以下的實施例中，上述實施例3所述的使用轉(zhuǎn)移基因的小鼠的方法也可用于測定脊髓灰質(zhì)炎病毒和外源多肽重組體的免疫原性。
實施例8構(gòu)成攜帶B型肝炎前-S區(qū)域基因的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒B型肝炎病毒的被膜含有3種全部在B型肝炎基因組的S基因區(qū)域內(nèi)編碼的蛋白質(zhì)。每種抗原都在S基因區(qū)域的開放讀碼中通過不同的起始位點編碼。主要的蛋白質(zhì)是S抗原，它在是226氨基酸長度。其它兩種蛋白質(zhì)是中等的和大的蛋白質(zhì)，它們分別由前-S1和前-S2基因編碼(Tiollais，P.等人，Nature，317∶489-495(1985))。據(jù)信在可進而含有S抗原的菌苗中含有前-S1和/或前-S2抗原可以提高B型肝炎菌苗的效能。
構(gòu)成含前-S1或前-S2基因的脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的對策與實施例7中有關(guān)S基因的敘述相類似。設計引物以放大每種基因并在該基因的每個末端引入脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒的側(cè)接序列。各引物如表2所述，PCR反應和循環(huán)條件如上述。
引物G和H用于放大來自B型肝炎DNA的前-S1區(qū)域。引物G將脊髓灰質(zhì)炎病毒的序列(表2中劃線部份)在前-S1基因的5′末端引入，用前-S1序列在B型肝炎基因組中的堿基2580處開始。反意義引物H被置于來自堿基3152-6的基因組(前-S1和前-S2二者共用)的前-S區(qū)域，并在堿基1處包括一個EcoRⅠ位點。用引物G和H對克隆的B型肝炎基因DNA的PCR放大產(chǎn)生338堿基對的片段。這種片段與5′LED3.2片段(來自實施例6所述的引物C和D)一起，在第2的PCR反應中作為模板DNA。用引物C和H的放大產(chǎn)生了有770堿基對的融合的5′LED3.2-前-S1片段。為了構(gòu)成前-S1基因的3′末端，使用PCR片段3′LED3.2/前-S2(參看下一段)，這是因為這一區(qū)域在兩種前-S構(gòu)成物中是相同的。5′LED3.2-前-S1片段用MluⅠ和EcoRⅠ消化。3′LED3.2-前-S2片段則用EcoRⅠ和AvrⅡ消化。所得的片段用瓊脂糖凝膠電泳提純，并捆扎進已被MluⅡ和AvrⅡ消化的pLED3.2中。所得的構(gòu)成物被定名為pLED3.2/前-S1。
按在實例7的各步驟之后，這一全長度的灰質(zhì)-融合構(gòu)成物的DNA序列使用應用生物系統(tǒng)AppliedBiosystems370ADNA定序機測定。
接著進行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染反應。由T7啟動子產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本被轉(zhuǎn)染進Vero細胞，以產(chǎn)生感染的脊髓灰質(zhì)炎病毒。為進行這些實驗，通過用PvuⅠ消化該質(zhì)粒而制備近似5ug的pLED3.2/前-S1以產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本。PvuⅠ的消化生成兩種片段，即含有T7啟動子的較大片段，繼而是含-S1基因融合體的全段灰質(zhì)基因組。將該消化反應物用酚萃取并用乙醇沉淀。將沉淀的DNA重新懸浮于20μl水中。全段長的RNA轉(zhuǎn)錄本在體外使用T7RNA聚合酶由PvuⅠ消化的DNA合成。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
將匯合的25cm2Vero細胞單層使用DEAE-轉(zhuǎn)染規(guī)定由轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染。將近似為25μg的RNA與DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后覆蓋到Vero細胞上。在室溫下培養(yǎng)30分鐘后，去除接種物并洗滌細胞。加入新修飾的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷維持液，并在33.5℃培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)該培養(yǎng)基直至觀察到全部的細胞致病作用，并由該培養(yǎng)基中收獲重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒。
含有構(gòu)成物pLED3.2/前-S1產(chǎn)生的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的病毒原種通過在Vero細胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重組體病毒中萃取RNA，并使用GeneAmp熱穩(wěn)定的rTth逆轉(zhuǎn)錄酶RNAPCR藥盒(Perkin-Elmer/Cetus)通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR進行分析。結(jié)果證明，前-S1基因通過培養(yǎng)基中的通道穩(wěn)定地保持在重組體pLED3.2/前-S1病毒中。
可用多種方法分析來自脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的前-S1抗原的表達。這些方法包括被感染細胞的免疫過氧化酶染色，病毒和外部蛋白質(zhì)的免疫沉淀，Western印跡和點印跡。
對前-S2的表達克隆使用引物I作為意義引物，使用引物B作為反意義引物(參看表2)。這些引物導致全部的前一S2基因放大，并在5′和3′的末端處引入LED3.2序列。PCR反應產(chǎn)生867堿基對片段。提純之后，這一片段被作為模板與或是5′LED3.2或是3′LED3.2片段一起用于第二周期PCR反應，導致形成定名為5′LED3.2/前-S2和3′LED3.2/前-S2的融合產(chǎn)物。用于第二周期PCR的引物，對于5′融合是C和B，而對于3′融合是I和F。將5′LED3.2/前-S2片段用MluⅠ和XbaⅠ消化，將3′LED3.2/前-S2片段用XbaⅠ和AvrⅡ消化。所得片段用瓊脂糖凝膠電泳提純，并捆扎進已用MluⅠ和AvrⅡ消化的pLED3.2中。所得的構(gòu)成物定名為pLED3.2/前-S2。
接在實施例7的各步驟之后，該全部長度的灰質(zhì)-融合構(gòu)成物的DNA序列使用一套應用生物系統(tǒng)370ADNA定序機測定。
接著，進行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染各反應。由T7啟動子產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本被轉(zhuǎn)染進Vero細胞，以產(chǎn)生感染的脊髓灰質(zhì)炎病毒。為進行這些試驗，通過用PvuⅠ消化此質(zhì)粒制備近似5μgpLED3.2/前-S2，以產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本。PvuⅠ的消化生成兩種片段，即含有T7啟動子的較大片段，繼而是含前-S2基因融合物的全長度的灰質(zhì)基因組。用苯酚萃取該消化的反應物并用乙醇沉淀。將沉淀的DNA重新懸浮于20μl水中。使用T7RNA聚合酶在體外由PvuⅠ消化的DNA中合成全段RNA轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳法進行分析。
將匯合的25cm2Vero細胞單層使用DEAE-轉(zhuǎn)染規(guī)定由轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染。將近似25μg的RNA與DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后覆蓋到Vero細胞上。在室溫下培養(yǎng)30分鐘后，去除接種物并洗滌細胞。加入剛新修飾的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷維持液，并在33.5℃培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)該培養(yǎng)基直至觀察到全部的細胞致病作用，并由該培養(yǎng)基中收獲重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。
含有由構(gòu)成物pLED3.2/前-S1產(chǎn)生的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的病毒原種通過在Vero細胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重組體病毒中萃取RNA，并使用GeneAmp熱穩(wěn)定的rTth逆轉(zhuǎn)錄酶RNAPCR藥盒(Perkin-Elmer/Cetus)通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR進行分析。結(jié)果證明，前-S2基因通過培養(yǎng)基中的通道穩(wěn)定地保持在重組體pLED3.2/前-S2病毒中。
可用多種方法分析來自脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的前-S2抗原的表達。這些方法包括免疫過氧化酶染色被感染細胞，病毒和外部蛋白質(zhì)的免疫沉淀，Western印跡和點印跡。
對于前-S1和前S2，都使用免疫過氧化酶染色法檢測被病毒感染的Vero細胞中的蛋白質(zhì)。Vero細胞被用病毒感染并在各個感染后的時刻用乙醇或甲醇固定。該被固定的細胞單層作為許可的情況使用或是抗脊髓灰質(zhì)炎病毒或是抗前-S1抗原或前-S2抗原的抗血清培養(yǎng)。洗滌平皿，然后用接合到HRP上的第二抗體(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G培養(yǎng)。再洗滌平皿，然后加入HRP培養(yǎng)基，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。表達與抗體交叉反應的蛋白質(zhì)的細胞被染色。
用重組體病毒感染Vero細胞單層。細胞的溶胞產(chǎn)物可通過對存在的病毒編碼蛋白通過免疫沉淀或Western印跡法來測定。對于免疫沉淀法而言，細胞的溶胞產(chǎn)物用抗脊髓灰質(zhì)炎病毒或抗外生蛋白質(zhì)的抗血清培養(yǎng)。然后將蛋白質(zhì)A瓊脂糖(Sigma，St.Louis，MO)加入該混合物并進一步培養(yǎng)。離心處理瓊脂糖珠粒，洗滌并用SDS離解緩沖液洗脫。沉淀的蛋白質(zhì)可通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。對于Western印跡法，細胞的溶胞產(chǎn)物通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素中并用抗血清培養(yǎng)到感興趣的蛋白質(zhì)上。洗滌印跡，用接合到HRP上的第二抗體(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培養(yǎng)。再次洗滌印跡，然后加入HRP基質(zhì)，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)加過氧化氫，以辨別交叉反應的蛋白質(zhì)。
實施例9構(gòu)成攜帶輪狀病毒VP7基因的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒命名為pLED3.2/VP7的表達克隆是這樣構(gòu)成的，其中編碼為輪狀病毒VP7抗原的基因插入脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中。該克隆含有VP7的全段基因，它在段長中近似為1千堿基。該克隆使用重疊擴展PCR和在脊髓灰質(zhì)炎病毒開放讀碼(基743)起始處插入的基因而構(gòu)成。用于第一周期PCR的引物是P和Q(表2)。模板DNA是含有全段輪狀病毒VP7基因的質(zhì)?？寺?。由這種放大得到的PCR產(chǎn)物在段長中有1012堿基對。第一周期反應的PCR循環(huán)條件不同于實施例6所述的標準條件，如下述94℃2分鐘，冰點2分鐘，繼而94℃1分鐘，26℃1分鐘，70℃2分鐘，進行10次循環(huán)，94℃1分鐘，45℃1分鐘，70℃2分鐘，進行20次循環(huán)。
第二周期的PCR反應如上述方式進行。第一周期PCR的片段與或是5′LED3.2或是3′LED3.2混合，并且對于5′融合用引物C和D放大。或?qū)τ?′融合用P和F放大。所得的融合產(chǎn)物對于5′融合用MluⅠ和BgⅡ消化?；?qū)τ?′融合用Bg/Ⅲ和AvrⅡ消化。然后將這些消化產(chǎn)物亞克隆進pLED3.2，以形成pLED3.2/VP7。
這一全段長的灰質(zhì)融合構(gòu)成物的DNA序列是使用一套應用生物系統(tǒng)(FosterCity，CA)370ADNA定序機測定。
接著進行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染反應。由T7啟動子產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本被轉(zhuǎn)染進Vero細胞產(chǎn)生感染的脊髓灰質(zhì)炎病毒。對這些實驗，通過用Pvul消化此質(zhì)粒制備近似5μg的pLED3.2/VP7，用于生成RNA轉(zhuǎn)錄本。PvuⅠ的消化導致兩種片段，含有T7啟動子的較大片段，繼而是含VP7基因融合的全段長灰質(zhì)基因組。該消化反應物用酚萃取并用乙醇沉淀。將沉淀的DNA重新懸浮于20μl水中。全段RNA轉(zhuǎn)錄本在體外使用T7RNA聚合酶(Moss，E.G.等人，J.Virol.，63∶1884-1890(1989))。由PvuⅠ消化的DNA合成。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳法分析。
匯合的25cm2Vero細胞單層使用DEAE-轉(zhuǎn)錄程序由轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染(Van der Werf，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，83∶2330-2334(1986))。將近似為25μg的RNA與DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后覆蓋到Vero細胞上。室溫培養(yǎng)30分鐘后，去除接種物并洗滌細胞。加入新修飾的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷維持液，并在33.5℃培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)該培養(yǎng)物直至觀察到全部的細胞致病作用，并由培養(yǎng)基中收獲重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。
含有從構(gòu)成物pLED3.2/PV7產(chǎn)生的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的病毒原種通過在Vero細胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重組體病毒中萃取RNA，并使用GeneAmp熱穩(wěn)定的rTth逆轉(zhuǎn)錄酶RNAPCR藥盒(Perkin-Elmer/Cetus)通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR進行分析。結(jié)果證明，該VP7基因通過培養(yǎng)基中的通道被穩(wěn)定地保持在重組體pLED3.2/PV7病毒中。
可用多種方法分析來自脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的VP7的表達。作為標準步驟的這些方法包括免疫過氧化酶染色被感染細胞，病毒和外部蛋白質(zhì)的免疫沉淀，Western印跡和點印跡(Coligan，J.E.，等人，eds.，CurrentProtocolsinImmunology，JohnWileyandSons(1992))。
使用免疫過氧化酶染色測定法檢測病毒感染的Vero細胞中的蛋白質(zhì)。Vero細胞被病毒感染并在各次感染后的時刻用乙醇或甲醇固定。該被固定的細胞單層用抗脊髓灰質(zhì)炎病毒的或抗VP7的抗血清培養(yǎng)。洗滌平皿，然后用接合到辣根過氧化酶(HRP)上的第二抗體(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培養(yǎng)。再次洗滌平皿，然后加入HRP培養(yǎng)基質(zhì)，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺的四氫氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。表達與抗體交叉反應的蛋白質(zhì)的細胞被染色。
用重組體病毒感染Vero細胞單層。細胞的溶胞產(chǎn)物可通過對存在病毒編碼的蛋白進行免疫沉淀或Western印跡法確定。對于免疫沉淀法而言，細胞的溶胞產(chǎn)物用抗脊髓灰質(zhì)炎病毒或抗外生蛋白質(zhì)的抗血清培養(yǎng)。然后將蛋白質(zhì)A瓊脂糖Sepharose(Sigma，St.Louis，MO)加入該混合物并進一步培養(yǎng)。離心處理該瓊脂糖珠粒，洗滌并用SDS離解緩沖液洗脫。沉淀的蛋白質(zhì)可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。對于Western印跡法，細胞的溶胞產(chǎn)物通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素中并用抗血清培養(yǎng)到感興趣蛋白質(zhì)上。洗滌印跡，用接合到HRP上的第二抗體(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培養(yǎng)。再次洗滌印跡，然后加入HRP基質(zhì)，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)加過氧化氫，以確認交叉反應的蛋白質(zhì)。
實施例10構(gòu)成脊髓灰質(zhì)炎病毒多聚接頭的密碼盒載體外源基因也可通過構(gòu)成與同性質(zhì)于實施例1-5所述的兩個脊髓灰質(zhì)炎病毒克隆載體而插入脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒的基因組中，其中每個載體摻入到特征的限制性內(nèi)切酶的克隆位點而每個位點又各自在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組內(nèi)的不同位置。這種多聚頭密碼盒載體的研究法提供了比實施例6的方法更簡單的克隆步驟，盡管后者限制加入在原外源多肽中未發(fā)現(xiàn)的附加氨基酸。
第一載體(載體1)含有在讀碼中的多聚接頭的密碼盒，而此讀碼中在緊接堿基743處的起始密碼子之后，具有脊髓灰質(zhì)炎多蛋白的碼。然后引入下列的限制性位點NotⅠ，HpaⅠ和PacⅠ。緊跟著這些的是編碼灰質(zhì)3C蛋白酶的識別位點的序列。然后通過添加或刪去1-2個額外堿基，以保持遍及這個區(qū)域的正確的開放讀碼。
在構(gòu)成這些載體的過程中使用重疊擴展PCR以引入限制性位點。為構(gòu)成載體1，引物J和K(表2)被合成以在堿基743處引入多聚接頭密碼盒。第一周期的PCR反應使用pLED3.2作為模板DNA，對于5′區(qū)域使用引物C和J，而對于3′區(qū)域使用引物K和F。該放大的片段期望的大小對于5′和3′區(qū)域分別是512和551堿基對。這些片段直接由PCR反應使用以供采用引物C和F的第二周期PCR作為模板。所得的片段在段長中有1016堿基對，并含有多聚接頭序列和在中部的片段中含有3C蛋白酶識別位點。將該片段提純，用MluⅠ和AvrⅡ消化，并亞克隆進入已由同一限制性內(nèi)切酶消化的pLED3.2中。
在病毒復制過程中，脊髓灰質(zhì)炎病毒的多蛋白的蛋白水解處理以多級階段的方式發(fā)生。起始的蛋白水解分裂由2A蛋白酶產(chǎn)生，導致生成定名為P1和P2-P3的蛋白質(zhì)而其中的每個蛋白質(zhì)又進一步被3C蛋白酶裂解則產(chǎn)生了各自的病毒蛋白質(zhì)。在多蛋白的蛋白水解過程中，部份分裂產(chǎn)物已顯示出具有來自最終分裂產(chǎn)物的獨特機能(Harris，K.S.等人，Semin.Virol.，1∶323-333(1990))。外源基因在編碼機能前體的區(qū)域插入多蛋白將不會產(chǎn)生可存活的病毒。設計第二密碼盒載體以便在P1和P2之間的接頭處(基3377)處引入限制性位點。
被引入的限制性位點是NotⅠ，HpaⅠ和PacⅠ。對于這些限制性位點，對這些限制性位點有一個2A蛋白酶識別位點5′;而對這些位點3C蛋白酶識別位點被引入3′。第一周期PCR反應使用pLED3.2作為模板DNA，對于5′區(qū)域用引物L和M，而對于3′區(qū)域用引物N和O(表2)。
對放大的片段的期望大小對于5′和3′分別是563和592堿基對(bp)。這些片段可被直接由該PCR反應使用于采用引物L和O的第二周期PCR作為模板所得的片段在段長中有1096bp，并且含有2A蛋白酶識別位點，多聚接頭序列和中部的3C蛋白酶識別位點。然后用BstEⅡ消化該片段并亞克隆進用同種酶消化的pLED3.2中。
密碼盒載體，被用作對外源基因的表達載體。使用已存在的可相容的限制性位點，或通過經(jīng)PCR添加這些限制性位點到基因的末端，將外源基因克隆進密碼盒的載體。在后一情況中，外源基因通過PCR使用相應于該基因5′和3′末端的引物而放大。當這些引物被合成時，一個限制性位點被加到意義引物的5′末端。在標準PCR反應中放大該基因后，所得的PCR片段將具有由兩個限制性位點側(cè)接的基因。此載體和PCR片段均用兩種限制性內(nèi)切酶消化，然后捆扎在一起，生成感興趣的表達克隆。
應當注明的是，可以這樣設計引物，使得它們對應于感興趣的外源基因的任何區(qū)域，使得部份基因能被摻入載體。從而用HpaⅠ消化該載體產(chǎn)生鈍頭末端的片段。因而外源基因的鈍頭片段可以克隆進載體。
實施例11構(gòu)成攜帶B.百日咳的69KD外部膜蛋白的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒將實施例10的脊髓灰質(zhì)炎病毒密碼盒載體用于表達B.百日咳的69kD外部膜蛋白。將該成熟的蛋白在近似1.8kD的基因區(qū)域內(nèi)編碼。這一區(qū)域或開放讀碼的較短區(qū)域可通過PCR使用定序的特定引物被放大。設計該引物以使在意義引物的5′末端含有NotⅠ位點，在反意義引物的5′末端含有PacⅠ位點。還必須調(diào)整該引物，使得開放讀碼和脊髓灰質(zhì)炎病毒的3C蛋白酶識別位點在碼中。經(jīng)PCR放大后，所得的片段通過瓊脂糖凝膠電泳法或用MagicPCR藥盒(Promega)提純。用NotⅠ和PacⅠ消化，并捆扎進用同種酶限制的載體。所得質(zhì)粒命名為pLED3.2/69kD。這一全長的灰質(zhì)-融合構(gòu)成物使用一套應用生物系統(tǒng)(FosterCity，CA)370ADNA定序機檢測。
接著進行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染反應。由T7啟動子產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本被轉(zhuǎn)染進Vero細胞產(chǎn)生感染的脊髓灰質(zhì)炎病毒。為進行這些實驗，通過用PvuⅠ消化此質(zhì)粒制備近似5μgpLED3.2/69kD以產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本。PvuⅠ的消化生成兩個片段，即含有T7啟動子的較大片段，繼而是含有69kD基因融合的全長度的灰質(zhì)基因組。消化的反應物用酚萃取并用乙醇沉淀。將沉淀的DNA重新懸浮于20μl水中。全長度的RNA轉(zhuǎn)錄本在體外使用T7RNA聚合酶從PvuⅠ消化的DNA中合成(Moss，E.G.等人，J.Virol.，63∶1884-1890(1989))。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳法進行分析。
將匯合的25cm2細胞單層使用DEAE-轉(zhuǎn)染程序用轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染(Van der Werf，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，83∶2330-2334(1986))。將近似為25μg的RNA與DEAE-葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后覆蓋到Vero細胞上。室溫培養(yǎng)30分鐘后，去除接種物并洗滌細胞。加入新修飾的Earle呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷維持液，并在33.5℃培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)該培養(yǎng)基直至觀察到全部的細胞致病作用，并由培養(yǎng)基中收獲重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。
含有從構(gòu)成物pLED3.2/69kD中產(chǎn)生的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的病毒原種通過在Vero細胞上的噬斑分析而被滴定。此外，由重組體病毒中萃取RNA，并使用GeneAmp熱穩(wěn)定的rTth逆轉(zhuǎn)錄酶RNAPCR藥盒(Perkin-Elmer/Cetus)通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR進行分析。結(jié)果證明，該69kD基因通過培養(yǎng)基中的通道被穩(wěn)定地保持在重組體pLED3.2/69kD的病毒中。
可用多種方法分析來自脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的69kD外部膜蛋白的表達。作為標準步驟的這些方法包括免疫過氧化酶染色被感染細胞，病毒和外部蛋白的免疫沉淀，Western印跡和點印跡(Coligan，J.E.，等人，eds.，CurrentProtocolsinImmunology，JohnWileyandSons(1992))。
使用免疫過氧化酶染色測定法檢測病毒感染的Vero細胞中的蛋白質(zhì)。Vero細胞被病毒感染并在感染后的各個時刻用乙醇或甲醇固定。被固定的細胞單層用抗脊髓灰質(zhì)炎病毒的或抗69kD外部膜蛋白的抗血清培養(yǎng)。洗滌平皿，然后用接合到辣根過氧化酶(HRP)上的第二抗體(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培養(yǎng)。再次洗滌平皿，然后加入HRP基質(zhì)，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺的四氫氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。表達與抗體交叉反應的蛋白質(zhì)的細胞被染色。
用重組體病毒感染Vero細胞單層。細胞的溶胞產(chǎn)物可通過對存在有病毒編碼的蛋白進行免疫沉淀或Western印跡法測定。對于免疫沉淀法而言，細胞的溶胞產(chǎn)物用抗脊髓灰質(zhì)炎病毒或抗外生蛋白質(zhì)的抗血清培養(yǎng)。然后將蛋白質(zhì)A瓊脂糖Sepharose(Sigma，St.Louis，MO)加入該混合物并進一步培養(yǎng)。離心處理該瓊脂糖珠粒，洗滌并用SDS離解緩沖液洗脫。沉淀的蛋白質(zhì)可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。對于Western印跡法，細胞的溶胞產(chǎn)物通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素中并用對感興趣蛋白質(zhì)的抗血清培養(yǎng)。洗滌印跡，用接合到HRP上的第二抗體(例如山羊的抗家兔免疫球蛋白G)培養(yǎng)。再次洗滌印跡，然后加入HRP基質(zhì)，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)加過氧化氫，以鑒別交叉反應的蛋白質(zhì)。
實施例12攜帶皰疹單糖蛋白D基因的重組體細胞的脊髓灰質(zhì)炎病毒的構(gòu)成采用實施例10中的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因盒載體表達皰疹單病毒的D糖蛋白。該蛋白質(zhì)用一約為1.2kb的基因來編碼。這一開放讀碼區(qū)或較短區(qū)域可通過帶有序列特定引物的PCR放大。這些引物被設計成在意義引物的5′端上含有一NotⅠ位點，在反意義引物的5′端上含有一PacⅠ位點。這些引物也必須調(diào)整，以使該開放讀碼和脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶識別部位落在編碼以內(nèi)。在通過PCR放大以后，產(chǎn)生的片段通過瓊脂凝膠電泳或用Magic公司的PCR藥盒(Promega)進行純化。用NotⅠ和PacⅠ消化，并被捆扎入用相同的酶限制的載體。所產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱為pLED3.2/gD。使用一種AppliedBiosystems(FosterCity，CA)370ADNA定序儀測定整個長度脊髓灰質(zhì)炎病毒融合結(jié)構(gòu)的DNA序列。
隨后，進行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染反應。由T7啟動子產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄子被轉(zhuǎn)染入Vero細胞，以產(chǎn)生傳染性的脊髓灰質(zhì)炎病毒。為了進行這些實驗，通過用PvuⅠ消化質(zhì)粒，制得約5μgpLED3.2/gD以產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本。PvuⅠ的消化產(chǎn)生兩個片段，較大片段含有T7啟動子，隨后是含有g(shù)D基因融合物的整個長度的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組。消化反應用苯酚萃取并用乙醇沉淀。將沉淀下來的DNA再懸浮于20μl水中。采用T7RNA聚合酶，可在試管中經(jīng)PvuⅠ消化處理的DNA中合成整個長度的RNA轉(zhuǎn)錄本(Moss，E.G.etal.，J.Virol.，63∶1884-1890(1989))。通過瓊脂凝膠電泳法分析轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
使用DEAE轉(zhuǎn)染程序?qū)R合的25cm2Vero細胞的單細胞層轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄本(Van der Werf，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，83∶2330-2334(1986))。將約25μgRNA與DEAE葡聚糖(0.5mg/ml)混合，然后敷蓋在Vero細胞上。在室溫下培養(yǎng)30分鐘后，移出接種物并清洗這些細胞。加入新配制的改性Earle′s醛糖內(nèi)酯營養(yǎng)介質(zhì)，并于33.5℃培養(yǎng)這些細胞。將該培養(yǎng)物培養(yǎng)直至能觀察到全部細胞致病作用，并由培養(yǎng)介質(zhì)中收獲重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒。
通過在Vero細胞上的噬斑分析滴定含有由pLED3.2/gD結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的病毒原種。此外，由重組體病毒中萃取RNA并通過使用GeneAmp熱穩(wěn)定rTth逆轉(zhuǎn)錄酶RNAPCR藥盒(Perkin-Elmer/Cetus)的逆轉(zhuǎn)錄和PCR分析。結(jié)果表明，gD基因穩(wěn)定地保持在通過培養(yǎng)的重組體pLED3.2/gD病毒中。
可采用多種方法以分析來自脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的gD的表達。這些標準操作步驟的方法包括感染細胞的免疫過氧化酶染色、病毒蛋白質(zhì)和外源蛋白質(zhì)免疫沉淀、Western印跡分析和點印跡分析(Coligan，J.E.，etal.，eds.，CurrentProtocolsinImmunology，JohnWileyandSons(1992))。
用一種免疫過氧化酶染色分析以檢測病毒感染的Vero細胞中的蛋白質(zhì)。使Vero細胞感染病毒并在感染后不同時刻用乙醇或甲醇固定。用對脊髓灰質(zhì)炎病毒或gD的抗血清培養(yǎng)固定細胞的單細胞層。洗滌平皿，然后用接合HorseRadishPeroxidase(HRP)的一種副抗體(如山羊抗兔IgG)培養(yǎng)。再次洗滌平皿，然后加入一種HRP基質(zhì)，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物(Sigma，St.Louis，MO)。然后將表達與抗體交叉反應的蛋白質(zhì)的細胞染色。
使Vero細胞的單細胞層感染重組體病毒。通過免疫沉淀或Westen印跡分析對細胞的溶胞產(chǎn)物檢測病毒編碼蛋白質(zhì)的存在。對免疫沉淀，細胞的溶胞產(chǎn)物用脊髓灰質(zhì)炎病毒或外源蛋白質(zhì)的抗血清培養(yǎng)。而后向該混合物中加入蛋白質(zhì)A瓊脂糖(Sigma，St.Louis，MO)并進一步培養(yǎng)。該瓊脂糖液滴經(jīng)離心分離，洗滌并用SDS離解緩沖液洗脫。沉淀的蛋白質(zhì)可通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析。對于Western印跡分析，細胞溶胞產(chǎn)物用SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移入硝化纖維素中并用有關(guān)蛋白質(zhì)的抗血清培養(yǎng)。洗滌印跡，用結(jié)合HRP的一種副抗體(如山羊抗免IgG)培養(yǎng)。再次洗滌印跡，然后加入一種HRP基質(zhì)，4-氯-1-萘酚(Bio-Rad，Richmond，CA)和過氧化氫，以確定交叉反應蛋白質(zhì)。
僅采用常規(guī)的實驗方法，現(xiàn)有技術(shù)的普通技術(shù)人員將會認識到，或能確定本文所述的特定具體實施方案的許多等效物。這些等效物被以下權(quán)利要求所包括。
權(quán)利要求
1.一種有復制能力的重組體病毒，其中重組體基因組包含a)一種編碼一種所表達的外源多肽的外源核酸序列；b)一種編碼一種蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，該蛋白酶蛋白水解處理由被修飾的親本病毒所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)前體以制備重組體病毒；以及c)被修飾的以制備重組體病毒的親本病毒基因組，其中，將(a)和(b)插入(c)中親本病毒基因組的一個位置上，使得病毒復制所需的病毒序列不破裂。
2.一種有復制能力的重組體病毒，其中重組體基因組包含a)一種編碼一種所表達的外源多肽的外源核酸序列;b)一種編碼一種蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，該蛋白酶蛋白水解處理由被修飾的親本病毒所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)前體以制備重組體病毒;以及c)被修飾以制備重組體病毒的親本病毒基因組，其中，(a)的外源核酸序列和(b)的編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列以下述次序存在于重組體基因組中親本病毒的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-親本病毒的唯一起始密碼子-(a)的外源核酸序列-(b)的編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-親本病毒的第二個密碼子-親本病毒基因組的剩余部分。
3.權(quán)利要求2的有復制能力的病毒，該病毒選自細小核糖核酸病毒、Togaviruses和Flaviviruses。
4.一種有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中重組體基因組包含a)一種編碼一種所表達的外源多肽的外源核酸序列;b)一種編碼一種脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶或脊髓灰質(zhì)炎病毒2A蛋白酶的蛋白水解分裂位點的核酸序列;以及c)親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中，(a)的外源核酸序列和(b)的編碼脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶或2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列以下述次序存在于重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-唯一的脊髓灰質(zhì)炎病毒起始密碼子-(a)的外源核酸序列-(b)的編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的第二個密碼子-親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的剩余部分。
5.權(quán)利要求4的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎Bpre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原，以及它們的結(jié)合體。
6.權(quán)利要求4的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的外源核酸序列編碼一種多肽抗原，而親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組是一種薩賓(Sabin)脊髓灰質(zhì)炎病毒或其衍生物的基因組。
7.權(quán)利要求6的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，薩賓脊髓灰質(zhì)炎病毒選自薩賓脊髓灰質(zhì)炎病毒1型、2型和3型。
8.權(quán)利要求6的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自細菌多肽抗原、病毒多肽抗原、真菌多肽抗原和寄生蟲多肽抗原。
9.權(quán)利要求8的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
10.權(quán)利要求4的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，而親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組是一種Mahoney脊髓灰質(zhì)炎病毒或其衍生物的基因組。
11.權(quán)利要求10的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自細菌多肽抗原、病毒多肽抗原、真菌多肽抗原和寄生蟲多肽抗原。
12.一種有復制能力的重組體病毒，其中重組體基因組包含a)一種編碼一種所表達的外源多肽的外源核酸序列;b)一種編碼一種蛋白酶蛋白水解分裂位點的核酸序列，該蛋白酶蛋白水解處理由被修飾的親本病毒所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)前體以制備重組體病毒;以及c)被修飾的以制備重組體病毒的親本病毒基因組，其中，(a)的核酸序列和(b)的編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列以下述次序存在于重組體基因組中親本病毒的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-親本病毒的唯一起始密碼子-親本病毒轉(zhuǎn)譯區(qū)的起始密碼子-編碼一種人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-外源核酸序列-編碼一種人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-親本病毒基因組的剩余部分。
13.權(quán)利要求12的一種有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，該病毒選自細小核糖核酸病毒、Togaviruses和Flaviviruses。
14.一種有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中重組體基因組包含a)一種編碼一種所表達的外源多肽的外源核酸序列;b)一種編碼一種脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶或脊髓灰質(zhì)炎病毒2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列;以及c)親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中，(a)的外源核酸序列和(b)的編碼脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶或2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列以下述次序存在于重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-脊髓灰質(zhì)炎病毒唯一起始密碼子-脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼區(qū)-人工3C或2A蛋白酶識別部位-外源核酸序列-人工3C或2A蛋白酶識別部位-脊髓灰質(zhì)炎病毒的剩余部分。
15.權(quán)利要求14的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
16.權(quán)利要求14的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的外源核酸序列編碼一種多肽抗原，而親本脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組是一種薩賓脊髓灰質(zhì)炎病毒或其衍生物的基因組。
17.權(quán)利要求16的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，薩賓脊髓灰質(zhì)炎病毒是選自薩賓脊髓灰質(zhì)炎病毒1型、2型、3型。
18.權(quán)利要求16的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自細菌多肽抗原、病毒多肽抗原、真菌多肽抗原和寄生蟲多肽抗原。
19.權(quán)利要求18的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
20.權(quán)利要求12的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，而親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組是一種Mahoney脊髓灰質(zhì)炎病毒或其一種衍生物的基因組。
21.權(quán)利要求20的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自細菌多肽抗原。病毒多肽抗原、真菌多肽抗原和寄生蟲多肽抗原。
22.一種制備有復制能力的重組體病毒的方法，該方法包括下述步驟a)提供一種能在其自然生活周期內(nèi)產(chǎn)生一種多蛋白前體的病毒，該前體被蛋白水解處理;b)將下述(1)和(2)引入(a)的病毒基因組中(1)一種編碼一種所表達的多肽的處源核酸序列;(2)一種編碼一種蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，該蛋白酶水解處理由(a)所提供的病毒產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)前體，其中，(b)(1)和(b)(2)在一定位置上插入(a)的病毒基因組中，使得病毒復制所需的一種病毒序列不致破裂。
23.權(quán)利要求22的方法，其中(a)所提供的病毒選自細小核糖核酸病毒、Togaviruses和Flaviviruses。
24.權(quán)利要求23的方法，其中細小核糖核酸病毒是一種脊髓灰質(zhì)炎病毒。
25.權(quán)利要求24的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中，(b)(1)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
26.一種制備有復制能力的重組體病毒的方法，該方法包括下述步驟a)提供一種能在其自然生活周期內(nèi)產(chǎn)生一種多肽前體的病毒，該前體被蛋白水解處理;b)向(a)中的病毒基因組引入(1)一種編碼一種所表達的多肽的外源核酸序列;(2)一種編碼一種蛋白酶人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，該蛋白酶蛋白水解處理(a)提供的病毒所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)前體，其中，(b)(a)的外源核酸序列和(b)(2)的編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列以下述次序存在于重組體基因組中病毒基因組的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-病毒的唯一起始密碼子-(b)(1)的外源核酸序列-(b)(2)的編碼一種人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-病毒的第二密碼子-病毒基因組的剩余部分。
27.權(quán)利要求26的方法，其中(a)中所提供的病毒選自細小核糖核酸病毒、Togaviruses和Flaviviruse。
28.權(quán)利要求27的方法，其中細小核糖核酸病毒是一種脊髓灰質(zhì)炎病毒。
29.權(quán)利要求28的方法，其中，(b)(1)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
30.權(quán)利要求28的方法，其中編碼一種人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，編碼一種脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點或一種脊髓灰質(zhì)炎病毒2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點。
31.權(quán)利要求30的方法，其中脊髓灰質(zhì)炎病毒是一種薩賓脊髓灰質(zhì)炎病毒或Mahoney脊髓灰質(zhì)炎病毒。
32.一種制備復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法，該方法包含下述步驟a)提供一種親本脊髓灰質(zhì)炎病毒;b)向(a)的親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中引入(1)一種編碼一種所表達的多肽的外源核酸序列;以及(2)一種編碼一種蛋白酶人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，該蛋白酶蛋白水解處理(a)提供的親本脊髓灰質(zhì)炎病毒所產(chǎn)生的一種多蛋白質(zhì)前體，其中，(b)(1)的外源核酸序列和(b)(2)的一種編碼一種脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶或脊髓灰質(zhì)炎病毒2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列以下述次序存在于重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)-唯一的脊髓灰質(zhì)炎病毒起始密碼子-(b)(1)的外源核酸序列-(b)(2)的編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列-親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的第二密碼子-親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的剩余部分。
33.權(quán)利要求32的方法，其中，(b)(1)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
34.一種制備有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法，該方法包含下述步驟a)提供一種親本脊髓灰質(zhì)炎病毒;b)向(a)的親本脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中引入(1)一種編碼所表達的一種多肽的外源核酸序列;(2)編碼一種蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，該蛋白酶蛋白水解處理(a)中的親本脊髓灰質(zhì)炎病毒所產(chǎn)生的一種多蛋白前體，其中，(b)(1)的外源核酸序列單元和(b)(2)的編碼人工蛋白水解分裂位點的核酸序列位于該脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組范圍內(nèi)的一個位置，該位置選自1)VP1和2A之間的接頭;2)2A和2B之間的接頭;3)2C和3A之間的接頭。
35.權(quán)利要求34的方法，其中，(b)(1)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
36.權(quán)利要求34的方法，其中，編碼一種人工蛋白水解分裂位點的(b)(2)的核酸序列編碼脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點或脊髓灰質(zhì)炎病毒2A蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點。
37.一種使個體對病原免疫的方法，該方法包括給個體服用足以在所述個體中產(chǎn)生免疫應答的劑量的一種權(quán)利要求1的有復制能力的重組體病毒，在該病毒中，(a)的外源核酸序列編碼所述病原的一種抗原。
38.一種使個體對病原免疫的方法，該方法包括給個體服用足以在所述個體中產(chǎn)生免疫應答的劑量的一種權(quán)利要求2的有復制能力的重組體病毒，在該病毒中，(a)的外源核酸序列編碼所述病原的一種抗原。
39.一種使個體對病原免疫的方法，該方法包括給個體服用足以在所述個體中產(chǎn)生免疫應答的劑量的一種權(quán)利要求3的有復制能力的重組體病毒，在該病毒中，(a)的外源核酸序列編碼所述病原的一種抗原。
40.權(quán)利要求39的方法，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
41.一種使個體對病原免疫的方法，該方法包括給個體服用足以在所述個體中產(chǎn)生免疫應答的劑量的一種權(quán)利要求8的有復制能力的重組體病毒，在該病毒中，(a)的外源核酸序列編碼所述病原的一種抗原。
42.權(quán)利要求41的方法，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
43.一種制備蛋白質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟a)將權(quán)利要求1的有復制能力的重組體病毒引入一適當?shù)乃拗骷毎?和b)在適合于權(quán)利要求1有復制能力的病毒復制的條件下保持(a)的產(chǎn)物。
44.權(quán)利要求43的方法，其中的宿主細胞是一種人體細胞。
45.一種制備蛋白質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟a)將權(quán)利要求4的有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒引入一適當?shù)乃拗骷毎?和b)在適合于權(quán)利要求4有復制能力的脊髓灰質(zhì)炎病毒的復制條件下保持(a)的產(chǎn)物。
46.權(quán)利要求45的方法，其中，編碼所表達的一種外源多肽的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
47.一種疫苗組合物，該組合物含有權(quán)利要求1的一種有復制能力的重組體病毒和一種生理上容許的載體。
48.權(quán)利要求47的一種疫苗組合物，其中(a)的外源多肽是一種病原的抗原，該抗原選自細菌、真菌、病毒和寄生蟲。
49.一種疫苗組合物，該組合物含有權(quán)利要求2的一種有復制能力的重組體病毒和一種生理上容許的載體。
50.權(quán)利要求49的一種疫苗組合物，其中(a)的外源多肽是一種病原的抗原，該抗原選自細菌、真菌、病毒和寄生蟲。
51.一種疫苗組合物，該組合物含有權(quán)利要求4的一種有復制能力的重組體病毒和一種生理上容許的載體。
52.權(quán)利要求51的一種疫苗組合物，其中，編碼所表達的一種外源多肽的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自細菌多肽抗原、病毒多肽抗原、真菌多肽抗原和寄生蟲多肽抗原。
53.權(quán)利要求52的一種疫苗組合物，其中，編碼所表達的一種外源多肽的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
54.一種疫苗組合物，該組合物含有權(quán)利要求10的一種有復制能力的重組體病毒和一種生理上容許的載體。
55.權(quán)利要求54的一種疫苗組合物，其中，編碼所表達的一種外源多肽的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自細菌多肽抗原、病毒多肽抗原、真菌多肽抗原和寄生蟲多肽抗原。
56.一種有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中的重組體基因組包括一種編碼一種所表達的外源多肽的外源核酸序列和一種或多種編碼一種人工蛋白水解分裂位點的外源核酸序列，并且該病毒表達編碼的多肽以及誘導在被引入抗體的哺乳動物中產(chǎn)生對外源多肽特殊的抗體。
57.一種用于治療的權(quán)利要求1.2.3和8中任一項的有復制能力的病毒。
58.一種用于使個體對病原免疫的權(quán)利要求1、2、3和8中任一項的有復制能力的病毒，其中(a)的外源核酸序列編碼所述病原的一種抗原。
59.一種權(quán)利要求1、2、3和8中任一項的有復制能力的病毒用于制造使個體對病原免疫的一種藥物的用途，其中，(a)的外源核酸序列編碼所述病原的一種抗原。
60.權(quán)利要求58的一種病毒或權(quán)利要求59的用途，其中，(a)的核酸序列編碼一種多肽抗原，該抗原選自肝炎BS抗原、肝炎B pre-S1抗原、肝炎B pre-S2抗原、B.Pertussis 69kD外膜蛋白質(zhì)、皰疹單糖蛋白D和輪狀病毒VP7抗原以及它們的結(jié)合體。
全文摘要
有復制能力的重組體病毒，特別是有復制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒及其用途，這些病毒包括(1)一種編碼一種外源多肽的外源核酸序列和(2)一種編碼一種病毒或細胞蛋白酶的人工蛋白水解分裂位點的核酸序列，該蛋白酶蛋白水解處理(分裂)由親本病毒所產(chǎn)生的前體蛋白質(zhì)。該重組體前體分裂或通常組成蛋白質(zhì)的列陣并釋放出外源多肽。有復制能力的重組體病毒用作對抗細菌、病毒、真菌和酵母菌感染、寄生蟲疾病、癌和變壓性病的疫苗。
文檔編號C12N15/86GK1075334SQ9211517
公開日1993年8月18日 申請日期1992年12月4日 優(yōu)先權(quán)日1991年12月6日
發(fā)明者M·范伯格, R·安迪諾, C·L·威克斯-萊維, P·A·賴利 申請人:懷特黑德生物制劑研究所, 美國氰胺公司