專利名稱：制備腎病綜合癥出血熱疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備Hanta病毒疫苗的方法，特別是利用正常人的二倍體細(xì)胞系制備腎病綜合癥出血熱Hanta病毒疫苗的方法，以及由此生產(chǎn)的一種疫苗。
自本世細(xì)三十年代以來(lái)，對(duì)流行性出血熱病原已進(jìn)行了廣泛的研究，雖然日本和俄國(guó)研究者推測(cè)是一種病毒，但未能分離出。
1976年，一位韓國(guó)病毒學(xué)家Ho-Wang Lee首次從韓國(guó)京畿道Dongdoochun-Eup Songnae-Ri捕獲的條斑地鼠(Apodemus agrarius)的肺組織中發(fā)現(xiàn)了病毒，同時(shí)他也發(fā)現(xiàn)該病毒與未康復(fù)的出血熱病人血清特異性地結(jié)合著;在這種情況下，就將其初步命名為“韓國(guó)抗原”(參見(jiàn)Lee et al.，The Korean Journal of Internal Medicine，9371-383，1976)。1978年，“韓國(guó)抗原”被證明是流行性出血熱的病原(參見(jiàn)Lee et al.，J.Infect.Dis.，137298-308，1978);并于1980年重新命名為“Hantaan病毒”(參見(jiàn)Information Exchange Sulicommittee，American Committee on Arthropod-borne Viruses(Karabastos，ed.)Ft.Collins，Colo.，80522，1980)，其根據(jù)為它是一種病毒，并且，這種條斑田鼠是由韓國(guó)Hantaan河周圍捕獲的。目前，Hantaan病毒已被收錄在美國(guó)出版的蟲(chóng)媒病毒手冊(cè)(Arbovirus Catalogue)中。
具有類似癥狀的疾病不僅在韓國(guó)，而且在日本、中國(guó)和斯堪迪納維亞國(guó)家出現(xiàn)，從抗原結(jié)構(gòu)看，被鑒出的致病性病毒與所說(shuō)的Hantaan病毒相似(參見(jiàn)Gajdusek，J.Pediatr.，60841-857，1962;Lee and Lee，Lancet，i186-187，1979;Svedmyr et al.，Lancet，i100，1979;Lee et al.，Lancet，i819-820;Lee et al.，Lancet，i1025-1026，1980;Gavrilovskaya.，Lancet，i1050，1981;Kitamura et al.，Jap.J.Med.Sci.Biol.，3617-25，1983;Song et al.，J.Infec.Dis.，150889-894，1984;Sugiyama et al.，J.Infec.Dis.，152126-136，1985)。在這種情況下，世界衛(wèi)生組織(WHO)決定稱所有這類類流行性出血熱為“腎病綜合癥出血熱(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome，HFRS)”(參見(jiàn)WHO Report，1982，Tokyo，WHO/WPR/RPD/WG/82，16)。
腎病綜合癥出血熱的病原已被分類為Bunya病毒科的一個(gè)新病毒屬，即Hanta病毒。Hanta病毒的亞屬包括Hantaan病毒，漢城病毒(Seoul Virus)，景山病毒(Prospect Hill Virus)和Puumala病毒，它們均已按其血清學(xué)特性作了鑒定(參見(jiàn)Schmaljohn，Science，2271041-1044，1985)。
1981年，用一株肺癌細(xì)胞-A549細(xì)胞(ATCC登記號(hào)CCL185)首先將Hantaan病毒繁殖成功(參見(jiàn)French et al.，Science，2111040-1048，1981);1982年用一株非洲綠猴(African Monkey)腎細(xì)胞克隆Vero E6細(xì)胞(ATCC登記號(hào)C1008，CRL1586)，成功地繁殖了該病毒(參見(jiàn)McCormik et al.，Lancet，i765-768，1982)。
另一方面，一些其他Hanta病毒，如漢城病毒、景山病毒和Puumala病毒據(jù)報(bào)道也能感染所說(shuō)的Hantaan病毒的宿主細(xì)胞Vero E6細(xì)胞株(參見(jiàn)Lee et al.，Manual of Hemorrhagic Fever withRenal Syndrome，Ryo Moon Gak Press，1989);1989年也報(bào)告了Hantaan病毒感染了MDCK細(xì)胞(ATCC登記號(hào)CCL34)、一株狗腎細(xì)胞(參見(jiàn)Chung，Sang-In，Choongang J.Med.，Vol.14，Number 2，1989)。
Song Gan等人報(bào)告指出腎病綜合癥出血熱疫苗可通過(guò)滅活金黃倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(GHKC)和蒙古Gerbils腎細(xì)胞(MGKC)而制備得到的(參見(jiàn)Song Gan et al.，J.of Korean Virology Society，Vol.21，Number 2，abstract，222-223，1991)。
為了制備適合于人用的疫苗，從人器官中分離的病毒通常被認(rèn)為是制備疫苗基質(zhì)材料的理想毒種，因?yàn)樗山档陀山臃N外源蛋白而引起的副作用;因而，MRC-5(ATCC登記號(hào)CCL171)和WI-38細(xì)胞(ATCC登記號(hào)CCL75)已被很好地建議用于此目的?？墒牵@些細(xì)胞也已發(fā)現(xiàn)有其不利的一面，即它是已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(肺癌)和/或異源細(xì)胞(即來(lái)源于狗或猴腎細(xì)胞;或倉(cāng)鼠或小鼠腎細(xì)胞)。
因此，一直不斷地存在有各種需求即采用人器官細(xì)胞來(lái)研制出一種增殖Hanta病毒的實(shí)用方法，以滿足所提到的穩(wěn)定性和/或同源性的要求。
根據(jù)本發(fā)明亦已發(fā)現(xiàn)的腎病綜合癥出血熱病原Hanta病毒能在來(lái)自胎兒的正常人二倍體細(xì)胞系上增殖，由此分離出的病毒是疫苗生產(chǎn)最好的基本材料。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主要目的是提供一種使用正常人二倍體細(xì)胞系制備腎病綜合癥出血熱Hanta病毒疫苗的新方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由此而生產(chǎn)出的疫苗。
本發(fā)明人研制出可以使Hantaan病毒增殖的胚源化的正常人二倍體細(xì)胞系;也就是說(shuō)，所述的這些細(xì)胞系源自胎兒的肺、腎、皮膚肌肉和胸腺，并分別命名為“LuMA”(源自肺)，“KiMA”(源自腎)、“SMMA”(源自皮膚肌肉)和“ThyMA”(源自胸腺)。本發(fā)明使用上述細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞用于Hanta病毒培養(yǎng)。這些細(xì)胞中有2株于1992年12月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC NOC92007(LuMA)和CCTCC NOC92006(KiMA)。另一面，來(lái)自肺癌細(xì)胞的MRC-5和WI-38兩株細(xì)胞也已由ATCC分發(fā)供應(yīng)作為對(duì)照細(xì)胞。
本發(fā)明的正常人二倍體細(xì)胞系來(lái)自胎兒器官和組織，具有接觸抑制效應(yīng)，是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。它們均保持各自原有的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特征和染色體數(shù)(2n＝46)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明使用的正常的原代人二倍體細(xì)胞系的染色體數(shù)目，統(tǒng)計(jì)學(xué)上非常近似于2n＝46，這一點(diǎn)不同于MRC-5和WI-38細(xì)胞;所述細(xì)胞系從未受到外源病原的感染(參見(jiàn)Song-Yong Park et al.，J.Kor.Soc.Virol.，Vol.21.No.11-9，1991)。
本發(fā)明使用下列組份的復(fù)合培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)90%(V/V)Eagle培養(yǎng)基和10%(V/V)胎牛血清(FBS)作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基;98%(V/V)Eagle培養(yǎng)基(Gibco.U.S.A.，Cat.No.＃430-2100)和2%(V/V)胎牛血清作為維持培養(yǎng)基;細(xì)胞在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)。用Hanta病毒屬四個(gè)亞屬，即Hantaan病毒，漢城病毒，景山病毒和Puumala病毒，感染正常人二倍體細(xì)胞系，在相同的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)10多天。用間接免疫熒光抗體方法監(jiān)測(cè)病毒對(duì)所說(shuō)細(xì)胞的感染情況(參見(jiàn)J.of Clinical Microbiology，Vol22，No.6，1985)。
在上述情況下，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)Hanta病毒能夠在正常人二倍體細(xì)胞系上大量繁殖;因此，本發(fā)明可用這種培養(yǎng)病毒來(lái)研制一種更為實(shí)用的生產(chǎn)疫苗的方法。按照本發(fā)明，以酶免疫測(cè)定法(enzyme immunoassay-EIA)為基礎(chǔ)，就能從組織培養(yǎng)器(表面積150cm2)培養(yǎng)Hanta病毒后的LuMA細(xì)胞上獲得10，000多抗原滴度。
經(jīng)廣泛的研究，用本發(fā)明培養(yǎng)的病毒生產(chǎn)的Hantaan病毒疫苗，其抗體的產(chǎn)生能力要高于現(xiàn)有技術(shù)所用小鼠或大鼠腦組織繁殖的病毒疫苗。這一點(diǎn)與Lee等人的早期結(jié)果，即Hantaan病毒苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生是不顯著的，正好相反(參見(jiàn)Lee et al.，Arch Virol.，(Suppl.1)35-47.1990)。
本發(fā)明提出制備疫苗的新方法包括以下幾個(gè)步驟在胎兒的正常人二倍體細(xì)胞上增殖Hanta病毒;用胰蛋白酶或EDTA處理細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)收集所述的病毒;凍/融或超聲處理所收集的病毒，然后離心所述的病毒，用含有福爾馬林的溶液或用熱或紫外線滅活病毒，再加入氫氧化鋁佐劑以及按下列配方的穩(wěn)定劑(參見(jiàn)表1)。
表1
在下列條件下，可通過(guò)熱、福爾馬林和紫外線處理以完全滅活Hanta病毒60℃ 20分鐘熱處理，0.05%(V/V)福爾馬林處理7天，或高于5.4×104J/m2(波長(zhǎng)為365nm)的紫外線處理。根據(jù)測(cè)定，在福爾馬林或紫外線處理時(shí)采用低溫(低于4℃)會(huì)更好。
本發(fā)明在下列實(shí)施例中將進(jìn)一步闡明，但這些并不應(yīng)用來(lái)限定本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明在上述或其它的目的和特性將在下面的附圖表的說(shuō)明中表述得十分明顯，即

圖1顯示Hantaan病毒對(duì)不同宿主細(xì)胞的感染性發(fā)展過(guò)程測(cè)定;
圖2A顯示不同時(shí)間的熱處理對(duì)EIA值的影響;
圖2B描述不同時(shí)間的福爾馬林處理對(duì)EIA值的影響;
圖2C顯示不同紫外輻射劑量對(duì)EIA值的影響。
實(shí)施例1確定正常人二倍體細(xì)胞系對(duì)Hanta病毒的敏感性正常人二倍體細(xì)胞系對(duì)Hanta病毒的敏感性確定按下列步驟進(jìn)行胎組織正常人二倍體細(xì)胞和Vero E6細(xì)胞(對(duì)照)培養(yǎng)成單層;以10∶1的比例(V/V)用維持培養(yǎng)基將吮乳小鼠或吮乳大鼠體內(nèi)增殖的Hanta病毒(Hantaan病毒、漢城病毒、景山病毒和Puumala病毒)制成病毒懸液，用濾膜(孔徑0.22μm)過(guò)濾。按上述培養(yǎng)好的細(xì)胞用過(guò)濾后的病毒感染，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-4天用間接免疫熒光抗體方法監(jiān)測(cè)病毒感染情況。
如上述所示那樣，對(duì)Hanta病毒敏感的正常人二倍體細(xì)胞系進(jìn)行了研究。表2和圖1提供了宿主細(xì)胞對(duì)Hantaan病毒的敏感性和按不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行感染性的比較結(jié)果。表3也給出了對(duì)其它Hanta病毒敏感性的測(cè)定結(jié)果。
表2
<p>表3
<p>實(shí)施例2大量細(xì)胞培養(yǎng)按照下列方法中的任何一種就可以進(jìn)行大量病毒培養(yǎng)用Hantaan病毒感染的正常人二倍體細(xì)胞(LuMA，CCTCC NOC92007)和長(zhǎng)好的宿主細(xì)胞以1∶10至1∶50(V/V)比例同時(shí)培養(yǎng);或用Hantaan病毒感染的細(xì)胞直接加入到培養(yǎng)好的單層細(xì)胞上培養(yǎng)。用幾種物理方法(超聲、凍/融)將Hantaan病毒感染的細(xì)胞破碎，該溶液以0.1至0.02M.O.I(感染復(fù)數(shù)-multiplicity of infection)接種到單層細(xì)胞，這樣獲得的接種液置5%CO2中吸收30多分鐘，加入維持培養(yǎng)基后進(jìn)行10天增殖培養(yǎng)。最后，收獲病毒感染的宿主細(xì)胞。
實(shí)施例3病毒的分離病毒分離按如下步驟進(jìn)行在實(shí)施例2中獲得的病毒感染宿主細(xì)胞通過(guò)反復(fù)凍(-70℃)和融(37℃或室溫);或，在20KHz超聲30-90秒來(lái)破碎，含有破碎細(xì)胞的病毒液以3500rpm離心30分鐘，收集上清液為以后使用。按韓國(guó)專利號(hào)39，291公開(kāi)的方法確定上清液和沉淀物的EIA值，在表4已列出結(jié)果。
表4
＊組織培養(yǎng)器的表面積為150cm2實(shí)施例4病毒的滅活用熱、福爾馬林或紫外線輻射處理來(lái)滅活上述獲得的病毒。表5和圖2提供了抗原滴度和滅活比率。
從表5和圖2的結(jié)果可知，可以肯定在下列條件下可達(dá)到完全滅活熱處理(60℃，20分鐘以上)，福爾馬林處理(0.05%(V/V)，七天以上)，紫外輻射(波長(zhǎng)365nm，大于5.4×104J/m2)。
實(shí)施例5Hantaan病毒疫苗的配制通過(guò)給由實(shí)施例4獲得的滅活Hantaan病毒液中加入表1中所列的穩(wěn)定劑來(lái)配制Hantaan病毒疫苗。以0.5ml/大鼠的劑量接種大鼠，用間接免疫熒光抗體法來(lái)確定免疫原性。依照不同的滅活方法在表6中提供了各抗體滴度值的比較。
從表6的結(jié)果來(lái)看，用各種滅活方法制備的疫苗在抗體產(chǎn)生中沒(méi)有明顯的差異。
為了說(shuō)明本發(fā)明的Hantaan病毒疫苗，按實(shí)施例6和7對(duì)藥物特性進(jìn)行了研究。
實(shí)施例6大鼠免疫劑量的確定用實(shí)施例1至5中制備的Hantaan病毒疫苗以不同的抗原滴度接種大鼠以獲得最佳免疫劑量，同時(shí)用間接免疫熒光抗體方法監(jiān)測(cè)抗體產(chǎn)生情況，每10天肌肉內(nèi)注射Hantaan病毒一次，共三次，表7表示三次接種后的抗體效價(jià)。
表7的結(jié)果表明，本發(fā)明的疫苗注射10多個(gè)EIA值的量時(shí)就可監(jiān)測(cè)到抗體的產(chǎn)生力。
實(shí)施例7比較Hantaan病毒的免疫原性來(lái)自正常人二倍體細(xì)胞系和鼠腦的Hantaan病毒疫苗，即，用本發(fā)明生產(chǎn)的和在韓國(guó)專利號(hào)39.291上描述的現(xiàn)有技術(shù)制備的疫苗，它們的免疫原性，在它們以不同抗原滴度接種到大鼠后進(jìn)行了比較。表8提供肌肉內(nèi)接種后確定的抗體滴度值。
如表8所示，已確定用本發(fā)明中的正常人二倍體細(xì)胞系生產(chǎn)的Hantaan病毒疫苗誘導(dǎo)的抗體要比早先鼠腦制造的疫苗誘導(dǎo)的抗體更優(yōu)越。
實(shí)施例8使用來(lái)自腎(KiMA)、皮膚肌肉(SMMA)和胸腺(ThyMA)的細(xì)胞系進(jìn)行疫苗生產(chǎn)來(lái)自腎(KiMA，CCTCC NOC92006)，皮膚肌肉(SMMA)和胸腺(ThyMA)的細(xì)胞系也按實(shí)施例2、3和4中所描述的相同程序參與了病毒培養(yǎng)、分離和滅活過(guò)程;同時(shí)也確定了免疫原性。幾種細(xì)胞系生產(chǎn)的免疫原性分別確定為8，500EIA(KiMA)、6，000EIA(SMMA)和5，200EIA(ThyMA)，它們?cè)趯?shí)際使用中相當(dāng)于在實(shí)施例3中用150cm2組織培養(yǎng)瓶獲得的10，000EIA LuMA(CCTCC NOC92007)。福爾馬林的完全滅活是與實(shí)施例4相同的處理?xiàng)l件下進(jìn)行監(jiān)測(cè)，抗體滴度也幾乎是與LuMA相等水平上進(jìn)行測(cè)定的。
隨著上述清楚的說(shuō)明和討論，已確定本發(fā)明使用正常人二倍體細(xì)胞系，即來(lái)自肺的LuMA細(xì)胞，來(lái)自腎的KiMA細(xì)胞，來(lái)自皮膚肌肉的SMMA細(xì)胞和來(lái)自胸腺的ThyMA細(xì)胞，制備Hanta病毒疫苗的新方法適合于制備針對(duì)腎病綜合癥出血熱的疫苗，以及由此生產(chǎn)的疫苗按抗體產(chǎn)生和免疫原性看也對(duì)預(yù)防所述疾病是高度有效的。
權(quán)利要求
1.一種制備腎病綜合癥出血熱疫苗的方法，該方法包括在胎兒的正常人二倍體細(xì)胞上繁殖Hanta病毒；收集所述的繁殖后的病毒；凍/融或超聲處理所收集的病毒；用熱、福爾馬林或紫外線輻射滅活病毒；以及，加入如Al(OH)3類佐劑及穩(wěn)定劑。
2.如權(quán)利要求1的制備腎病綜合癥出血熱疫苗的方法，其中所說(shuō)的Hanta病毒是選自Hantaan病毒、漢城病毒、景山病毒和Pummala病毒中的一種。
3.如權(quán)利要求1的制備腎病綜合癥出血熱疫苗的方法，其中所說(shuō)的正常人二倍體細(xì)胞系是LuMA(CCTCC NOC92007)。
4.如權(quán)利要求1制備腎病綜合癥出血熱疫苗的方法，其中所說(shuō)的正常人二倍體細(xì)胞系是KiMA(CCTCC NOC92006)。
5.一種由權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)出的腎病綜合癥出血熱疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及了使用正常人二倍體細(xì)胞系制備腎病綜合癥出血熱Hanta病毒疫苗的新方法以及由此生產(chǎn)出的疫苗。本發(fā)明的方法包括在來(lái)自胚胎源的正常人二倍體細(xì)胞上增殖Hanta病毒；收集所述增殖后的病毒；凍/融或超聲處理收集的病毒；用熱、福爾馬林或紫外線處理來(lái)滅活病毒；加入如Al(OH)
文檔編號(hào)C12N7/04GK1076865SQ93102220
公開(kāi)日1993年10月6日 申請(qǐng)日期1993年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月27日
發(fā)明者金惠淑, 黃圭桂, 樸松用, 文洪模 申請(qǐng)人:牧巖生命工學(xué)研究所