專利名稱：表達乙肝病毒表面抗原中蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動物細胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有編碼乙肝病毒表面抗原中蛋白(Pre-S2+S)的DNA的表達質(zhì)粒，用所說表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞系以及培養(yǎng)所說的轉(zhuǎn)化體高效表達乙肝表面抗原中蛋白。
乙型肝炎病毒(HBV)是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常見病因，我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，有50-70%的人群感染過HBV，8-10%的人群(約1億人)為帶毒者，目前還沒有治療乙肝的有效方法，接種乙肝疫苗是預(yù)防肝炎的有效措施。
血源疫苗國內(nèi)外已投入生產(chǎn)使用，但不能滿足普遍的預(yù)防接種，由于血源疫苗存在著一些問題，如血源有限，帶有肯定的潛在性危險(如丙肝，艾滋病毒等，)為此需要急切研制乙肝基因工程疫苗，國內(nèi)外對乙肝基因工程疫苗的研究得到較快的發(fā)展，美國的MSD公司應(yīng)用酵母系統(tǒng)生產(chǎn)乙肝基因工程疫苗已獲準生產(chǎn)許可證，我國用哺乳動物細胞生產(chǎn)的乙肝基因工程疫苗也獲準生產(chǎn)，它們和血源疫苗一樣，是由乙肝表面抗原的主蛋白組成。
近來的研究表明，HBV的Pre-S2(前S2)區(qū)域中蛋白特異性決定簇比S區(qū)更為豐富，中蛋白免疫能激刺T細胞的功能，Pre-S2抗體出現(xiàn)早于S抗體，并具有保護野毒攻擊的作用，這進一步表明中蛋白在免疫中有著重要作用。
1984年M.L.Michel報導(dǎo)[1]，用ay亞型的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)大蛋白構(gòu)建重組質(zhì)粒(PSVSdhfr9.1kb)。
其特點是乙肝表面抗原大蛋白受SV40早期啟動子的調(diào)控，而dhfr(二氫葉酸還原酶)基因受MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)啟動子的調(diào)控。
表達系統(tǒng)，他們采用二氫葉酸還原酶陰性的中國地鼠卵巢細胞(CHO-dhfr-)，作為其表達系統(tǒng)經(jīng)SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳顯出22 kD 26 kD的主蛋白及34kD的中蛋白條帶，未顯出大蛋白條帶。
用AUSRIA 11試劑盒測細胞培液中蛋白表達量＝1ug/106細胞/每天。
T.Lee等人[2]用HBV(adr亞型)2.8kb的Bg1 Ⅱ片段插到PSV2-dhfr載體質(zhì)粒的Bg1 Ⅱ-BamH1位點構(gòu)建質(zhì)粒，其中HBsAg基因的轉(zhuǎn)錄方向與SV40早期啟動子方向相反，用構(gòu)建的重組質(zhì)轉(zhuǎn)化CHO細胞，其表達產(chǎn)物HBsAg表達量一平均為1μg/107Cell/每天。
蛋白印跡實驗用pre-S1及PreS2單克隆抗體時分別測出40kD的Pre-s1及33kd，36kd的PreS2帶。
1989yasuakiItohandyukioFujisaua等人[3]質(zhì)粒構(gòu)建用adr型乙肝表面抗原中蛋白(此中蛋白是經(jīng)修飾即去掉第Ser44-Thr496個氨基酸，同時在氨基端增加了人工合成的三個氨基酸殘基)構(gòu)建成10.8kb的pGLDP31-RC重組質(zhì)粒。
該質(zhì)粒是由GLD啟動子(甘油醛-3-磷酸-脫氫酶啟動子)下游連接乙肝表面抗原修飾后的中蛋白，PBR322片段(含氨芐抗性基因及復(fù)制起點)，酵母菌的arsl(自主復(fù)制系列)、LEU2(亮氨酸基因)及LR(反向重復(fù)序列)所構(gòu)成。
表達系統(tǒng)酵母表達產(chǎn)物的檢測
1)經(jīng)SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳顯示出34kd，37kd的中蛋白條帶。
2)鏡下觀察到20nm顆粒。
1986年P(guān).Dehouxetal等報導(dǎo)[4]質(zhì)粒構(gòu)建將ayw亞型HBV大蛋白1312bp的BglⅡ-BglⅡ片段插到含有PH05啟動子的酵母載體質(zhì)粒PPV2的HindⅢ位點，其下游有URA3基因(轉(zhuǎn)錄終止信號)構(gòu)成PPV2/S55重組質(zhì)粒。
該質(zhì)粒的特點是乙肝表面抗原大蛋白基因在PH05(強的酵母啟動子)調(diào)控下。
表達系統(tǒng)酵母。
表達的蛋白產(chǎn)物，免疫沉淀后，經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠電泳電顯出39kD的帶條。蛋白分泌量為25ug/L(0.1-0.2ug/ml總蛋白)。
T.Yoneyamaetal等報導(dǎo)[5]1.質(zhì)粒構(gòu)建用HBV(adr亞型)表面抗原2.8kbBg1Ⅱ片段(含Pre-S1，S2+S基因)插到PdBpv-MMTneo的BamHⅠ的位點。
該質(zhì)粒含有BPVDNA(牛乳頭瘤病毒)載體，PML2DNA.SV40剪接位點及多聚腺苷位點，小鼠攝金蛋白啟動子和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)。
2.表達系統(tǒng)小鼠C127細胞3.表達產(chǎn)物檢測1)電鏡下觀察到22-27nm顆粒。
2)SDS-PAGE電泳顯示22Kd26kd和35Kd的蛋白帶，無大蛋白帶。
3)細胞的免疫熒光用HBsAg的免血清及Pre-S2單克隆抗體分別測出HBsAg及Pre-S2抗原，用Pre-S1單抗未測出Pre-S1抗原。
L.Kutinova等人報導(dǎo)[6]的質(zhì)粒構(gòu)建包括用完整的前S2+S基因，插到含有痘苗TK的PGS20載體質(zhì)粒P1.4HEP，該質(zhì)粒特點是HBsAg抗原PreS2+S基因在痘苗病毒7.5K啟動子調(diào)控下。
蛋白分泌量的檢測HBsAgElisa滴度為HBsAg24-34;Pre-S2161。
M.W.Yuetal[7]報導(dǎo)用表面抗原Pre-S2+S基因插到大腸桿菌表達載體pTrpLE質(zhì)粒，構(gòu)成PLEPre-S2質(zhì)粒。
表達產(chǎn)物是融合蛋白蛋白。
上述所介紹的含乙肝病毒表面抗原前S基因的重組DNA質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性的研究中，或因表達載體的構(gòu)建不佳或因表達系統(tǒng)的選擇不利，因而都不能高效生產(chǎn)出免疫原性好的抗原，其中表達系統(tǒng)選擇的局限表現(xiàn)為用大腸桿菌為表達系統(tǒng)其得到表達往往是融合蛋白，由于表達水平低，產(chǎn)物不穩(wěn)定，而未獲成功;以痘苗為載體表達乙肝表面抗原，最初是用此載體研制亞單位疫苗，雖然有成功的報導(dǎo)，但由于不適于大規(guī)模的生產(chǎn)，給廣泛使用前景帶來困難，現(xiàn)進一步用此載體來研制含乙肝表面抗原的重組病毒活疫苗;酵母是一個較好的表達系，但有其不足之處。
1)酵母表達的乙肝表面抗原不能分泌，給分離純化帶帶來許多困難。
2)HBsAg中蛋白在酵母系統(tǒng)中過度糖基化而且穩(wěn)定性差，影響其免疫原性;用哺乳動物細胞C127，小鼠LTK-及小鼠3T3細胞用為表達系統(tǒng)，雖有獲得乙肝表面抗原的表達的報導(dǎo)，但上述細胞不是世界衛(wèi)生組織認可的用于基因工程疫苗生產(chǎn)的哺乳動物細胞。
要想獲得更好的基因工程苗需從二方面考慮，一是高效表達質(zhì)粒的構(gòu)建，二是表達系統(tǒng)的選擇，為此我們構(gòu)建了含乙肝表面抗原Pre-S2+S中蛋白質(zhì)粒pSV2DHBWS2S，本質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)明顯地不同于現(xiàn)有報導(dǎo)的Pre-S的質(zhì)粒，并選用哺乳動物細胞作為表達系統(tǒng)，目的是為進一步研制免疫性好，表達量高的乙肝基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
在本發(fā)明的實施方案中，我們采用的是乙肝表面抗原完整的中蛋白結(jié)構(gòu)(2.0kb的Saul-Bg1Ⅱ片段)，乙肝表面抗原中蛋白是具有豐富的抗原決定簇，免疫原性好，能與人多聚白蛋白結(jié)合，又能分泌的區(qū)域，采用的HBV亞型，這是我國南方流行的重要亞型，南方又是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，所采用的啟動子也與上述文獻報道不同，即我們采用二個SV40早期啟動子，SV40早期啟動子是較強的啟動子，SV40的DAN復(fù)制起點和早期啟動子區(qū)域中含有72個核苷酸的重復(fù)序列能強化鄰近的基因的表達[8、9]。
質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中的dhfr基因在前，乙肝表面抗原基因在后，而且我們構(gòu)建的與Michel等所構(gòu)成的質(zhì)粒正好相反。
其優(yōu)點是dhfr基因是一個擴增基因，由于它的擴增而帶動下游的HBsAg基因擴增，從而增強基因HBsAg的表達。
此外用哺乳動物細胞即缺失二氫葉酸還原酶基因的中國地鼠卵巢細胞(CHO-dhfr-)，為表達系統(tǒng)是較理想的細胞系，哺乳動物胞表達的外源基因產(chǎn)物較原核及酵母系統(tǒng)更接近于天然，哺乳動物細胞系具有更適于大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)勢。


圖1說明本發(fā)明的重組質(zhì)粒pSV2DHBWS2S的構(gòu)建方法。
下面將對本發(fā)明進行詳細說明。
(一).含乙肝表面抗原中蛋白重組質(zhì)粒質(zhì)粒構(gòu)建PSVDHBW-1質(zhì)粒(adw亞型)經(jīng)HindⅢ及Saul酶切后回收大片段，Klenow酶補平，T4DNA酶連接構(gòu)成中間質(zhì)粒PSVHBWS2S再用Bg1Ⅱ及PVUⅡ酶切后制取小片段，載體質(zhì)粒PSV2dhfr(美國梁偉材教授贈)的Bg1Ⅱ位點處構(gòu)成PSV2DHBWS2S，該重組質(zhì)粒的特點是HBVPreS2+S基因及二氫葉酸還原酶(dhfr)酶基因分別置于二個SV40早期啟動子調(diào)控下，圖1。
(二).轉(zhuǎn)基因細胞系MX(X1-15)MX細胞系的篩選將重組質(zhì)粒DNA 15ug和等量的鮭魚精子DNA按常規(guī)沉淀技術(shù)[10，11]加到約80%成片的CHO-dhfr-細胞(該細胞是美國哥倫比亞大學(xué)Chasin教授惠贈)瓶中，8小時后第一次換生長液(含次黃嘌呤和胸苷)，2天后消化稀釋(此時生長液不再加次黃嘌呤和胸苷)，于CO2孵箱中培養(yǎng)約2周，待單個細胞集落出現(xiàn)時，挑單細胞集落于96孔板，增殖后依次逐漸轉(zhuǎn)到24孔板及方瓶，逐漸加MTX(氨甲喋呤)其濃度由1X10-7到5X10-6M以此篩出高效分泌HBsAg陽性的克隆細胞系。
(三).表達產(chǎn)物檢測1.HBsAg的表達量反相血凝滴度為64-128;放射免疫(RIA)為2248-2558ng/ml。
Pre-S2表達量反相血凝為128-192酶聯(lián)免疫試驗(Elisa)為160-320。
2.初純品經(jīng)SDS-PAGE電泳，顯出24KD，27KD的主蛋白帶及33KD，36KD中蛋白帶，經(jīng)蛋白印跡試驗證明，中蛋白是特異性條帶。
3.免疫電鏡觀察到22nm大小的顆粒。
4.動物實驗免疫小鼠及家兔后Elisa可測出1∶8Pre-S2抗體，Pre-S2抗體產(chǎn)生比S抗體產(chǎn)生早，而S抗體產(chǎn)生較高持續(xù)時間較長(1∶10稀釋的血清其RIA的P/N值為104-190)。

表2M6細胞分泌乙肝疫苗免疫小鼠后前S2抗體的反應(yīng)Elisa檢測前S2抗體的P/N值鼠種血清稀釋1:11:21:8CBA5.16.22.4C575.95.02.2C3H5.47.02.06155.05.32.2NIH3.82.82.1Balb/c4.02.1未做ICR-未做DBA/C-未做
1.M.L.Micheletal.
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA817708-7712，1984)2.T.Lee，etalArchvirol106151-158，1989.
3.YasuakiItohandyukioFujisawaBiochemicalandBiophysicalResearchCommunications141(3)942-948，19864.P.DehouxetalGene48155-163，19865.T.YoneyamaetalJ.genVirol691931-1939.19886.L.Kutinovaetal.
ArchVirol.112181-193.1990.
7.M.W.YuetalJ.ofMedicalvirology307-13，19908.Fiers.W.R.etal.
Nature273113，1978.
9.BanerjiJ.etal.Cell27299.198110.WiglerM.etalProc.Natl.Acid.SeiUSA761373.197911.WiglerM.etal.Cell16777，1979.
權(quán)利要求
1.一種含有乙肝病毒表面抗原中蛋白Pre-S2+S基因的重組質(zhì)粒，其特征在于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中包括二氫葉酸還原酶(dhfr)基因及乙肝病毒表面抗原Pre-S2+S基因，它們分別在二個SV40早期啟動子的調(diào)控之下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組質(zhì)粒，其特征在于所說質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中dhfr基因在前，Pre-S2+S基因在后。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的重組質(zhì)粒，其特征在于所說的PS2+S基因是乙肝病毒表面抗原的SauⅠ-Bg1 Ⅱ片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任何一個的重組質(zhì)粒，其特征在于所說的乙肝病毒是adw亞型。
5.一種能分泌乙肝表面抗原中蛋白的細胞系MX(X1-15)，其特征在于它是用權(quán)利要求1-4中任何一個權(quán)利要求的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的細胞系，其特征在于所說的哺乳動物細胞是CHO-dhfr-細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了含乙肝病毒表面抗原中蛋白(Pre-S2+S)基因的重組質(zhì)粒PSV2DHBWS2S和含有該質(zhì)粒并能高效分泌乙肝病毒表面抗原中蛋白的哺乳動物細胞系MX，在本發(fā)明的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中，二氫葉酸還原酶基因及乙肝病毒表面抗原Pre-S2+S基因分別受二個SV40早期啟動子的調(diào)控，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的CHO-dhfr
文檔編號C12N15/85GK1078262SQ93102498
公開日1993年11月10日 申請日期1993年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月11日
發(fā)明者田淑芳, 楊安道, 任貴方, 朱既明 申請人:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所