專利名稱：用微生物方法對含氮雜環(huán)羧酸進行羥基化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從相應(yīng)的含氮雜環(huán)-羧酸來生產(chǎn)具有通式Ⅰ的羥基-含氮雜環(huán)-羧酸或它的可溶性鹽的新微生物方法以及該方法所用的適當(dāng)微生物。
下面我們將闡明含氮雜環(huán)-羧酸的羥基化或非羥基化，以及它的可溶性鹽，例如堿金屬鹽或銨鹽。
2-羥基-含氮雜環(huán)-羧酸是活性物質(zhì)合成中的重要中間產(chǎn)物，例如在生產(chǎn)2-氯代煙酸可用2-羥基煙酸作為起始原料(US-PS4081451)，以及在制藥時作為重要的中間產(chǎn)物。(Ann.Pharm、Er.，1980，3803)，第243-252頁)。
迄今為止，還沒有用微生物來生產(chǎn)羥基-含氮雜環(huán)-羧酸的方法。
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種生產(chǎn)在化學(xué)上難于接觸的2-羥基-含氮雜環(huán)-羧酸的簡單的、符合環(huán)境要求的微生物方法。
本發(fā)明的任務(wù)根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求1所述的方法和權(quán)利要求6所述的新的微生物來解決。
本發(fā)明的方法是這樣的把通式Ⅱ的含氮雜環(huán)-羧酸
作為基質(zhì)，借助于含有特定羥化酶的可利用6-甲基煙酸的微生物把該物經(jīng)羥基化成式Ⅰ表示的羥基-含氮雜環(huán)-羧酸。在式Ⅱ中，R1、R2可以相同，也可不同，表示氫原子、鹵原子或C1-C4烷基，X表示氮原子或CR3-官能團，其中R3表示氫或鹵原子;式Ⅰ中R1、R2和X具有上述同樣的含義。
對“含特定羥基化酶應(yīng)用于6-甲基煙酸的微生物”概念的理解如下用例如污水過濾后的淤泥作培養(yǎng)基來把6-甲基煙酸生物物質(zhì)接種物培養(yǎng)成能利用6-甲基煙酸的微生物，該微生物利用6-甲基煙酸作為唯一碳源、氮源和能源。這時用現(xiàn)有的技術(shù)方法來選擇微生物，把6-甲基煙酸完全分解，通過中間產(chǎn)物2-羥基-6-甲基煙酸得到含特定羥化酶的微生物，即該種微生物特定地能在酸官能團與氮原子之間的碳原子上羥基化。
原則上所有的微生物都適于本發(fā)明，按此規(guī)律例如可從污水過濾下的污泥或土壤樣品進行挑選菌種，本文本中對微生物不作規(guī)定，是本發(fā)明的一部分。
適當(dāng)?shù)兀痉椒ㄖ械奈⑸镆约八暮蟠屯蛔凅w定名KilolCDSM6920。這在1992年10月2日德文“微生物和細(xì)胞培養(yǎng)有限公司匯編”(SammlungfiirMikroorganismenandZellkulturenGmbH)Mascheroderweg1bD-3300Braunschweig中有記載。
Ki101(DSM6920)的科學(xué)描寫;
細(xì)胞形狀極小的棍狀寬μm0.4-0.5
長μm1.0-1.5可流動性-Geisseln-革蘭氏反應(yīng)-(陰性)3%KOH中溶化情況+氨基肽酶(Gerny)+孢子-氧化酶+過氧化氫酶+關(guān)于16SrRNA序分析的類型還未被確定。
采用6-甲基煙酸進行微生物的篩選和培養(yǎng)按照專業(yè)上常用的方法進行。
選種時的“篩選”(Screening)系根據(jù)微生物在需氧條件下合適地進行，較好地在“篩選”時，微生物是靜止培養(yǎng)的(不是搖瓶)。
在選種和培養(yǎng)時6-甲基煙酸的合適量為達1%重量，優(yōu)選為0.5%重量。
選樣和培養(yǎng)合適地在5-9pH值，較好在6-8pH值下實施。
選樣和培養(yǎng)合適地在15-50℃，較好在25-40℃溫度下進行。
通常選樣和培養(yǎng)在礦物鹽介質(zhì)中進行，較好的在具有表1所描述的組成的礦物鹽介質(zhì)中進行。
適當(dāng)微生物的光學(xué)密度在650nm(OD650)為0.5-100，可用專業(yè)常用的方法得到，或者可把作基體的含氮雜環(huán)-羧酸直接加入到微生物中，以測得適當(dāng)轉(zhuǎn)化的組成(生物轉(zhuǎn)化)。
在細(xì)胞不生長的情況下用專業(yè)常用的方法來進行適當(dāng)?shù)纳镛D(zhuǎn)化。
用作通式Ⅱ的基質(zhì)物質(zhì)可以是例如煙酸，吡嗪羧酸或它的鹵化物或C1-C4-烷基衍生物。
鹵代的煙酸或吡嗪酸衍生物中較好的是用6-氯代煙酸，5，6-二氯煙酸和5-氯吡嗪羧酸來進行羥基化。
較好的是用5-甲基吡嗪-羧酸羥基化來得到C1-C4-吡嗪羧酸衍生物。
為了生物轉(zhuǎn)化可連續(xù)或一次地加入基質(zhì)，適當(dāng)?shù)幕|(zhì)的加入應(yīng)使培養(yǎng)介質(zhì)中的基質(zhì)濃度不超過10%重量，較好的不超過7%重量。
生物轉(zhuǎn)化的介質(zhì)可用技術(shù)上常用的，較好的，生物轉(zhuǎn)化應(yīng)在-低摩爾磷酸-緩沖劑中進行。
通常生物轉(zhuǎn)化在微生物懸浮液中進行，650nm(OD650)的光學(xué)密度為0.5-100，較好為5-50。
該生物轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)卦?5-50℃溫度，較好在25-35℃溫度，5-9pH值，較好在6.5-7.5pH值下進行。
在通常的反應(yīng)持續(xù)5小時-3天以后，通式Ⅰ的羥化產(chǎn)品可用專業(yè)常用的方法，例如，通過酸化無細(xì)胞的上清液使之分離出來。
按本方法生產(chǎn)的通式Ⅰ的羥基含氮-雜環(huán)-羧酸，式Ⅰ中，當(dāng)X表示氮原子時，R1和R2可相同或不同地表示氫原子，鹵原子或C1-C4-烷基，例外的是當(dāng)X表示CH-官能團，R1和R2表示一個鹵原子時，R1、R2不能都是氫原子，這在本文中未作限制。
本發(fā)明中新穎化合物的較好代表是5，6-二氯-2-羥基煙酸、3-羥基-5-甲基吡嗪羧酸和3-羥基-5-氯吡嗪羧酸。
實施例1可利用6-甲基-煙酸的微生物的分離。
在300ml的錐形燒瓶中加入含1mmol 6-甲基煙酸(表1)的100ml礦物鹽培養(yǎng)基，并摻入10ml污水過濾的淤泥，該淤泥來自瑞士Visp的隆薩公司生產(chǎn)的污水處理設(shè)備，或摻入來自Visp的隆薩工廠的泥土試樣，在30℃靜置培養(yǎng)10天后，可用分光光度計來證明有2-羥基-6-甲基煙酸的沉淀。隨后在新鮮的礦物鹽介質(zhì)中接種培養(yǎng)多次，然后把能生成2-羥基-6-甲基煙酸的細(xì)胞懸浮液從含1.6%(w/v)瓊脂培養(yǎng)基的同樣介質(zhì)上劃線培養(yǎng)，接著，瓊脂培養(yǎng)碟在含4%O2和96%N2的氣氛中在30℃培養(yǎng)，把單細(xì)胞菌落逐個地移入液體介質(zhì)并靜止培養(yǎng)，定名為Kilol(DSM6920)的菌族即在6-甲基煙酸-2-羥基-6-甲基煙酸上生長、形成。
實施例2將煙酸經(jīng)微生物氧化成2-羥基煙酸在1l Fernbach-燒瓶中，向800ml礦物鹽培養(yǎng)基(表1)中的名稱為Kilol(DSM 6920)的微生物中加入8毫摩爾6-甲基煙酸，在一搖瓶機上、在30℃、保溫(每分鐘100轉(zhuǎn)下培養(yǎng)，接種量為達5%(v/v)，5天后OD650達到約0.5。隨后把收得的細(xì)胞用50毫摩爾磷酸鹽緩沖劑洗滌一次，接著把細(xì)胞再放于含200mg(1.38mmol)的煙酸-鈉鹽的20ml、50mM、pH為7.0的磷酸鹽緩沖劑中懸浮，OD650達20。在搖瓶機上、30℃下培養(yǎng)6小時后，借助薄層色譜法證明不再有煙酸。然后離心分離生物物質(zhì)并把上清液酸化至pH2.5，使2-羥基煙酸可沉淀下來。
借助1H-NMR(DMSO)分析可證明有分離出來的產(chǎn)品中沒有污染，被分離出來的2-羥基煙酸為140mg(1mmol)，產(chǎn)率對煙酸來說為72%。
表1礦物鹽介質(zhì)儲存液NaH2PO4·2H2O 156.0g
NH4Cl 10.0gK2SO41.2g用KOH調(diào)節(jié)pH值到7.0蒸餾水500.0ml儲存液2:
對氨基苯甲酸8.0mgD-生物素2.0mg煙酸20.0mgD-泛酸鈣10.0mg鹽酸吡哆醛30.0mg二氯化硫胺20.0mg氰鈷胺素(維生素B12) 10.0mg蒸餾水100.0ml消毒過濾儲存液3HCl(37%)7.0mlFeCl2·4H2O 1.5gZnCl20.07gMnCl2·4H2O 0.1gH3BO30.006gCoCl2·6H2O 0.19gCuCl2·7H2O 0.002gNiCl2·6H2O 0.024gNa2MoO4·2H2O 0.036g
蒸餾水1000.0ml,121°壓力釜蒸煮,20分鐘。
儲存液4NaOH0.5gNa2SeO3·5H2O 0.003gNa2WO4·2H2O 0.004g蒸餾水1000.0ml,121°壓力釜蒸煮20分鐘。
儲存液5MgCl2·6H2O 40.0gCaCl2·2H2O 5.0g蒸餾水200.0ml,121°壓力釜蒸煮20分鐘。
6-甲基煙酸(500mM)6-甲基煙酸-鈉鹽80.0g蒸餾水1000.0ml,121°壓力釜蒸煮20分鐘。
生長培養(yǎng)基10mM6-甲基煙酸溶液125.0ml6-甲基煙酸20.0ml蒸餾水1000.0ml,121°壓力釜蒸煮20分鐘。
消毒后加入溶液20.5ml溶液31.0ml溶液41.0ml溶液50.5ml表2實施例3-7
實施例3-7按實施例2來實施，結(jié)果概括于表2。
實施例初始原料濃度 OD650時間產(chǎn)品產(chǎn)率(w/v)nm[h]36-氯代煙酸1%20166-氯-2-羥基-70%(分離)45,6-二氯煙1%20165,6二氯-2-羥20%(分析)酸鈉鹽基煙酸5吡嗪羧酸鈉0.3%5243-羥基吡嗪羧70%(分析)鹽酸65-甲基-吡0.3%5243-羥基-5-甲80%(分析)嗪羧酸鈉鹽基-吡嗪羧酸75-氯-吡嗪0.3%5243-羥基-5-氯-50%(分析)羧酸鈉鹽吡嗪羧酸實施例6分析的數(shù)據(jù)(3-羥基-5-甲基-吡嗪碳酸)1H-NMR(DMSO，400MHz)δ以ppm表示2，4，s;2，6，s;3，8，s;7，8，s。
13H-NMR(DMSO，100，5MHz)δ以ppm表示20，t;40，m;130，s;134，s;155，s，164，s;170，s。
實施例7的分析數(shù)據(jù)(3-羥基-5-氯-吡嗪羧酸)1H-NMR(D2O和二噁烷，400MHz)δ以ppm表示3，8，s;4，7，s;8，0，s。
13C-NMR(D2O和二噁烷100，5MHz)δ以ppm表示132，s;133，s;145，s;149，s，164，s;172，s。
權(quán)利要求
1.一種用微生物生產(chǎn)具有通式Ⅰ的羥基含氮雜環(huán)-羧酸或它的可溶性鹽的方法，
式Ⅰ中，R1和R2可相同或不同地表示氫原子、鹵原子或C1-C4-烷基，X表示氮原子或CR3-官能基團，其中R3表示氫原子或鹵原子，其特征在于是在含特定羥化酶的利用6-甲基煙酸的微生物幫助下，把作為基質(zhì)物質(zhì)的通式Ⅱ的含氮雜環(huán)-羧酸或它的可溶性鹽轉(zhuǎn)化成式Ⅱ的產(chǎn)品，
式Ⅱ中，R1、R2和X具有上述的含義。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，把通式Ⅱ的含氮雜環(huán)-羧酸用作基質(zhì)，
式中，R1和R2可相同或不同的表示氫原子、氯原子或甲基，X表示氮原子或CH-官能團。
3.如權(quán)利要求1和2的至少一項所述的方法，其特征在于反應(yīng)是與名稱為Kilol(DSM 6920)的微生物或它的后代和突變體進行。
4.如權(quán)利要求1-3的至少一項所述的方法，其特征在于，在反應(yīng)進行時，一次性或連續(xù)地加入基質(zhì)物質(zhì)，使在培養(yǎng)介質(zhì)中的基質(zhì)濃度不超過10%重量。
5.如權(quán)利要求1-4的至少一項所述的方法，其特征在于，反應(yīng)在15-50℃溫度、5-9pH值下進行。
6.一種微生物，是這樣被選出的，即利用6-甲基煙酸用作唯一的碳源、氮源或能源，以制成2-羥基-6-甲基煙酸。
7.如權(quán)利要求6所述的微生物，具有Kilol(DSM 6920)的名稱，以及它的后代和突變體。
8.一種通式為
的羥基含氮雜環(huán)-羧酸，式中X表示氮原子，R1和R2可相同或不同的表示氫原子、鹵原子或C1-C4-烷基，有一例外，即當(dāng)X表示CH-官能團，R1和R2表示一個氯原子時，R1及R2不能都是氫。
9.5，6-二氯-2-羥基煙酸。
10.3-羥基-5-甲基吡嗪羧酸。
11.3-羥基-5-氯吡嗪羧酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及從相應(yīng)的含氮雜環(huán)-羧酸生產(chǎn)具有通式I的羥基含氮雜環(huán)-羧酸或它的可溶性鹽的新微生物方法，以及與此方法相適應(yīng)的新的微生物。
文檔編號C12P7/02GK1077748SQ9310266
公開日1993年10月27日 申請日期1993年3月3日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月4日
發(fā)明者安德烈亞斯·基內(nèi)亞, 安德烈亞斯·切希, 安德烈亞斯·廷舍特, 克勞斯·海因策爾曼 申請人:瑞士隆薩股份公司