專利名稱：基因檢測法和基因檢測儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高靈敏度基因或DNA檢測法和檢測儀。
DNA診斷或基因診斷是通過分辨基因上特殊堿基序列來診斷疾病的一種方法，目前非常盛行。通常，作為檢測目標(biāo)的DNA拷貝數(shù)量很少，因此需要有高靈敏度的檢測方法。為了檢測痕量的DNA，使用了以放射性同位素標(biāo)記的DNA探針。即，作為樣品的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳處理，按顆粒大小予以分離，分離后的DNA圖案被轉(zhuǎn)移并固定在纖維素濾器上。隨后，放射性同位素標(biāo)記性DNA探針被散點在DNA圖案上，同具有互補序列的DNA進行雜合。把濾器與膠片等牢固地粘接起來，在DNA探針雜合位點上就散射出β-射線等，其結(jié)果是位點被轉(zhuǎn)移到膠片上使DNA得到檢測。這種使用放射性同位素標(biāo)記的檢測法靈敏度很高，但問題是操作有些麻煩。由于這個原因，就開發(fā)和運用了一種技術(shù)，即對含有要檢測序列的DNA區(qū)域中的拷貝數(shù)量進行擴增的酶反應(yīng)，也就是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR法)(文獻科學(xué)242，229(1988))。該方法包括互補鏈合成引物與具有預(yù)定區(qū)域的雙鏈DNA兩端之間的雜合，還包括用DNA聚合酶來重復(fù)互補鏈的合成。這種方法可以擴增105-106倍，這使得DNA的充分檢測即使用熒光標(biāo)記物等進行也成為可能。在聚合酶鏈反應(yīng)中，互補鏈合成、雙鏈DNA的分離和引物的雜合是靠一種耐熱性酶和用于反復(fù)升降溫度的熱循環(huán)儀來反復(fù)進行的，因而擴增DNA互補鏈的兩種引物是必不可少的。
在聚合酶鏈反應(yīng)擴增法中，DNA拷貝首先是由作為模板的預(yù)定DNA所產(chǎn)生的，但幾個周期之后，所合成的拷貝就變成了模板。因此，拷貝數(shù)量以幾何級數(shù)增加。為此，如果存在著即便是少量的用于擴增引物以與之雜合的位點，DNA的擴增就可自動開始并隨之發(fā)展。因而這個方法也具有一個缺陷，即其容易受到污染物等的影響。這種方法還有一些問題，即進行擴增必須準(zhǔn)備兩種引物;在檢測變異較大的病毒時，很難找到一個用于檢測病毒的便利的擴增區(qū)域。由于這個原因，需要開發(fā)一種檢測預(yù)定DNA區(qū)域的高靈敏度的方法，以取代聚合酶鏈反應(yīng)擴增法。鑒于上面所描述的情況，本發(fā)明的目的在于提供一種用于擴增攜帶著樣品信息的DNA探針的方法，以取代聚合酶鏈反應(yīng)擴增法，并實現(xiàn)一種高靈敏度基因檢測法和基因檢測儀。
上述目的可通過下列做法達到使用酶來分解DNA或RNA的雙鏈部分，即從DNA或RNA末端上切掉雙鏈部分，使熒光標(biāo)記性寡聚物探針在樣品DNA上雜合;在存在樣品DNA或RNA的條件下縮短DNA或RNA探針;并檢測縮短的DNA或RNA探針。由于酶從末端分解了上述雙鏈部分，可以使用具有核酸外切酶活性的酶，例如核酸外切酶Ⅲ、λ核酸外切酶、外切酶Bal31等等。簡單說來，本發(fā)明的特點就是使用一種酶，這種酶具有從末端分解雙鏈DNA或RNA或DNA-RNA雜合物的核酸外切酶活性，所說的末端含有DNA探針，DNA探針包括一個具有弱雜合力的部分，以熒光體或染料加以標(biāo)記，還包括有一個強雜合力的部分，其中具有與樣品互補的序列。
更具體地說，本發(fā)明的基因檢測法包括以下步驟DNA或RNA探針分別與樣品DNA或樣品RNA雜合;使用具有核酸外切酶活性的酶逐次從雙鏈末端分解核苷酸;檢測縮短的DNA或RNA探針。在這種方法中，可以使用以熒光或染料標(biāo)記的DNA或RNA探針。
再者，本發(fā)明的基因檢測方法還包括大量DNA或RNA探針與樣品DNA或樣品RNA分別雜合，這些探針從末端到熒光標(biāo)記堿基位置之間的長度都各不相同;通過使用具有核酸外切酶活性的酶來逐次從雙鏈末端分解核苷酸;由此改變了縮短的DNA或RNA探針的分子量，使每一種DNA或RNA探針的電泳遷移率都有所變化;通過具有核酸外切酶活性的酶的作用來縮短樣品DNA或樣品RNA中的DNA或RNA探針，對探針加以區(qū)分;從而分別檢測具有不同堿基序列的樣品DNA或樣品RNA的多個位點。本發(fā)明的特點在于，在每一個DNA或RNA探針中，應(yīng)使由具有核酸外切酶活性的酶所進行的分解不在上述DNA或RNA探針預(yù)定位置的堿基上進行。
進一步說，本發(fā)明的基因檢測法包括大量DNA或RNA探針與多種類型的樣品DNA和RNA分別雜合，這些探針從末端到熒光標(biāo)記堿基位置之間的長度都各不相同;通過使用具有核酸外切酶活性的酶來逐次從雙鏈末端分解核苷酸，從而改變縮短的DNA或RNA探針的分子量，對每一種DNA或RNA探針來說遷移速率也有所變化;通過具有核酸外切酶活性的酶的作用來縮短多種類型樣品DNA或RNA中的DNA或RNA探針，對探針加以區(qū)分;從而分別檢測多種類型的樣品DNA或RNA。本發(fā)明的特點在于，在每一個DNA或RNA探針中，DNA或RNA探針上預(yù)定位置的堿基得到了化學(xué)修飾或雜合作用的穩(wěn)定程度得到控制，因而由具有核酸外切酶活性的酶進行的分解作用并不發(fā)生在該位置的堿基上。
再者，本發(fā)明的基因檢測方法包括大量DNA或RNA探針與多種類型的樣品DNA或RNA分別雜合，這些探針在熒光標(biāo)記類型上各不相同;通過使用具有核酸外切酶活性的酶，逐次從雙鏈末端分解核苷酸;區(qū)分縮短的DNA或RNA探針;檢測多種類型的樣品DNA或RNA?；蛘弑痉椒òň哂胁煌瑝A基序列和以大量不同熒光標(biāo)記物所標(biāo)記的DNA或RNA探針與具有不同堿基序列部分的樣品DNA或RNA的多個位點分別進行雜合;用具有核酸外切酶活性的酶來縮短雜合物;對具有不同堿基序列部分的樣品DNA或RNA的多個位點分別進行檢測。
在如上闡述的基因檢測法中，DNA或RNA探針的長度不短于8個和不超過100個堿基。
本發(fā)明的基因檢測儀是這樣一種儀器應(yīng)用如上所述的基因檢測法;具有區(qū)分縮短的DNA或RNA探針的裝置;能檢測一種或多種類型的樣品DNA或RNA。
通過使用本發(fā)明的上述方法和儀器，DNA診斷和DNA檢測儀就具有了可能性。
以熒光標(biāo)記的DNA探針與樣品雜合，形成了一個具有雙鏈的雜合物。當(dāng)具有切除雙鏈DNA末端堿基的活性的酶(也就是具有核酸外切酶活性的酶，如核酸外切酶Ⅲ、λ核酸外切酶、核酸外切酶Bal31等等)得以作用于這個雜合物時，雙鏈部分的3′末端和5′末端的核苷酸就逐次被切除掉。為了使DNA探針雜合并以雙鏈的形式穩(wěn)定存在，DNA探針必須具有一定的長度。不過，當(dāng)經(jīng)過逐次從鏈末端切除核苷酸使探針長度縮短時，縮短的DNA探針(在某些情況下，只有熒光標(biāo)記的部分保留下來)就離開了樣品DNA。新生成的過量DNA探針分子隨后與殘存的樣品DNA雜合而形成雙鏈，該雙鏈再次被具有核酸外切酶活性的酶(即一種核酸外切酶)所分解。這樣，在存在著樣品DNA和核酸外切酸的條件下，DNA探針的長度就變短了。這樣，反應(yīng)不可逆地進行，因而經(jīng)過一定時間之后，就形成了大大超過樣品DNA拷貝數(shù)量的縮短的熒光標(biāo)記性DNA探針。通過對縮短的熒光標(biāo)記性DNA探針進行電泳處理，按照長度來加以分離并對分離出的部分進行檢測，樣品DNA的存在與否就能得到高靈敏度的檢測。為了能提高檢測的精確性，使具有不同堿基序列的熒光標(biāo)記性DNA探針與樣品DNA的多個位點雜合，縮短所生成的雜合物，并分別檢測具有不同堿基序列的樣品DNA的多個位點，這些做法也都是可能的。換句話說，通過改變標(biāo)記這些探針的熒光體的類型或者改變以熒光體或染料標(biāo)記的具有弱雜合力的部分的長度使DNA探針的大小在其縮短后有所變化，由電泳路徑長短來分離這些探針而分別檢測這些分離出的探針也是可能的。
簡言之，隨著使熒光標(biāo)記的DNA探針與樣品雜合形成雙鏈而擴增，通過使用特異分解雙鏈的酶來重復(fù)DNA探針的分解和分離，可以生產(chǎn)所預(yù)期的縮短的DNA探針，因而可高速分解與樣品DNA單獨雜合的DNA探針。
按照本發(fā)明，如上所述，通過使樣品DNA與具有與樣品DNA互補的序列的DNA探針互補性地鍵合，可以有選擇地縮短互補鍵合的DNA探針。這個反應(yīng)由酶催化，所產(chǎn)生的縮短的DNA探針數(shù)量要比樣品DNA拷貝數(shù)量大得多。通過將生成的縮短的DNA探針從未反應(yīng)的DNA探針中分離出來，樣品DNA就可得到高靈敏度的檢測。這樣，高靈敏度的基因檢測就成為可能。本發(fā)明的反應(yīng)可以產(chǎn)生縮短的DNA探針，在不需升降溫度的條件下，幾分鐘內(nèi)探針數(shù)量要超出樣品DNA量的2-3位數(shù)。因此，本發(fā)明的方法和儀器在迅速檢測樣品DNA方面是有效的。


圖1A到1F是用來說明本發(fā)明實例中所使用的各種類型的熒光標(biāo)記DNA探針結(jié)構(gòu)實例的視圖。
圖2A到2F是用來說明本發(fā)明方法的典型視圖，其中因酶反應(yīng)而縮短的DNA探針的數(shù)量得到擴增。
圖3是用來說明通過本發(fā)明的擴增反應(yīng)而得到的產(chǎn)物的電泳圖案的一個實例。
圖4A和4B表明在使用大量的DNA探針使縮短的DNA探針數(shù)量擴增的情況下雜合物的實例。
本發(fā)明將參考附圖加以說明，作為所使用樣品的一個例子，噬菌體M31是一種易于得到的單鏈DNA。這里，單鏈DNA將作為例子，但如果樣品也是單鏈DNA(如病毒等)，也可同樣進行檢測。首先，生產(chǎn)一種其序列與樣品具互補性的DNA探針。對于表面出較大變異的病毒，可通過選擇出一個具有保存完好堿基序列的區(qū)域來生產(chǎn)DNA探針。在本實例中，可以使用如圖1A到1E中所示的各種類型的熒光標(biāo)記性DNA探針。本實例中所使用的熒光標(biāo)記性DNA探針(如圖1A到圖1E所示)包括一個雜合區(qū)6，這是一個可與樣品DNA完全雜合的區(qū)域;一個標(biāo)記區(qū)5，該區(qū)域具有弱雜合力，以染料或熒光標(biāo)記物2進行標(biāo)記。在圖1A到圖1E中，X和Y分別代表堿基A、C、G和T，Z則代表與染料或熒光標(biāo)記物鍵合的有機物分子鏈。圖1A中的DNA探針11在5′末端具有一個熒光標(biāo)記2;圖1B中的DNA探針12在5′末端的第5個堿基處有一個熒光標(biāo)記2;圖1C中的DNA探針13在5′末端和5′末端第5個堿基處各有一個熒光標(biāo)記2;圖1D中的DNA探針14在5′末端第5個堿基處具有來自熒光標(biāo)記2的熒光。在圖1A、圖1B和圖1D中，標(biāo)記區(qū)域5可進一步被一種或多種熒光標(biāo)記物2或3加以標(biāo)記。另外，在圖1A到圖1D中，標(biāo)記區(qū)5可能含有具有弱雜合力的次黃嘌呤核苷。圖1E中的DNA探針15是一個例子，其中與熒光標(biāo)記物鍵合的有機物分子鏈Z已被鍵合在雜合區(qū)6的5′末端上。鍵合于有機物分子鏈Z上的熒光標(biāo)記物可以是這樣的標(biāo)記物，其中，一個或多個相同類型的熒光標(biāo)記物已被鍵合在一起，或者一個或多個不同類型的熒光標(biāo)記物已被鍵合在一起。
本發(fā)明的第一個實例可參考使用圖1A中DNA探針11的情況來予以說明。在圖2A到圖2F中，典型視圖表明了這樣一個過程，其中，通過使熒光標(biāo)記的DNA探針與樣品雜合形成雙鏈，通過使用特異分解雙鏈的酶來重復(fù)DNA探針的分解和分離，由此高速分解單獨與樣品DNA雜合的DNA探針，縮短的DNA探針就這樣被擴增性地產(chǎn)生了。發(fā)生在這個過程中的反應(yīng)可用圖2A到圖2F來說明。如圖2A所示，單鏈樣品7和圖1A中的DNA探針11(僅有一個熒光標(biāo)記2被鍵合在5′末端上)相混合;當(dāng)在預(yù)定條件下保持生成的混合物時，雜合反應(yīng)開始。如圖2B所示，結(jié)果，通過這個反應(yīng)就產(chǎn)生了DNA探針11與樣品7雜合成的雜合物8以及未反應(yīng)的DNA探針21。由于樣品7的數(shù)量很少而且使用了大大超過樣品7數(shù)量的DNA探針11，未反應(yīng)的DNA探針21就保持著過剩狀態(tài)。在這個條件下，加入能從DNA3′末端切除核苷酸的核酸外切酶Ⅲ。通過核酸外切酶Ⅲ的催化作用，構(gòu)成雜合物8雙鏈部分的DNA探針11的核苷酸被逐次地從DNA3′末端處切除掉(由于熒光標(biāo)記2的存在，末端分解反應(yīng)并不發(fā)生在構(gòu)成雜合物8雙鏈部分的樣品DNA的3′末端)。如圖2C所示，DNA探針11的長度被縮短，變成縮短的DNA探針21。當(dāng)縮短的DNA探針20與樣品7生成的雜合物9的雜合力變?nèi)跚译s合物9在給定條件下不能穩(wěn)定存在時，以熒光標(biāo)記物2標(biāo)記的縮短的DNA探針20就從雜合物9中分離而成為游離性的。當(dāng)縮短的DNA探針20的雜合堿基對的數(shù)量變小時，探針20與樣品DNA的雜合能力就變?nèi)?也會有一種情況，即縮短的DNA探針20與其5′末端單獨以熒光標(biāo)記物2所標(biāo)記的單鏈樣品7相雜合)。結(jié)果是，如圖2D所示，雜合物9裂解，變成了包括單鏈樣品7、多余的未反應(yīng)的DNA探針21和游離性縮短的DNA探針20的混合狀態(tài)(也存在一種情況，即探針20包括單獨以熒光標(biāo)記物2所標(biāo)記的5′末端)。除了存在著游離性縮短的DNA探針20以外，這種混合狀態(tài)基本上與圖2A中的狀態(tài)是一樣的。因此，如圖2E所示，單鏈樣品7再次形成了雜合物8，在核酸外切酶Ⅲ的催化作用下，構(gòu)成雜合物8雙鏈部分的DNA探針11的核苷酸被逐次從3′末端處切除掉。如同圖2C的方式一樣，DNA探針11的長度被縮短，形成了一個縮短的DNA探針20，該探針與樣品7分離而成為游離性的。這樣，縮短的DNA探針20的數(shù)量就象圖2F中所示得到擴增。當(dāng)還存在著未反應(yīng)的DNA探針21且核酸外切酶Ⅲ還保持著酶活性時，這種擴增繼續(xù)進行。
本發(fā)明的第二個實例將參考使用圖1F中DNA探針16的情況來加以說明。在這個實例中，使用了DNA探針16，即28-基體(鏈節(jié))的DNA探針，其具有圖1F所示的結(jié)構(gòu)。熒光標(biāo)記物2被放置在5′末端和5′末端的第5個堿基上。該熒光標(biāo)記物也可以只放置在5′末端上或者放置在第5個堿基之外的堿基上。熒光標(biāo)記分子2已經(jīng)被連接在5′末端和5′末端的第5個堿基上，這樣該部分與樣品DNA的雜合力就弱了。這個部分叫做標(biāo)記區(qū)。通過改變這個標(biāo)記區(qū)部分的長度，可以將大量的DNA探針彼此區(qū)分開。另外，這個標(biāo)記區(qū)5在用核酸外切酶進行末端分解之后，通過引入對該區(qū)具有弱雜合力的次黃嘌呤核苷，或者通過形成帶有有機物分子鏈的這種區(qū)域(有機物分子鏈由于其長度會造成電泳遷移率上的差別，但絕對沒有雜合力，而且熒光標(biāo)記物與之鍵合)，可以容易地與樣品DNA分離開。DNA探針具有互補性DNA，互補性DNA在其3′末端一側(cè)含有23個基體(鏈節(jié))，而且該區(qū)是一個可與樣品DNA完全雜合的部分。這個區(qū)域以下稱為雜合區(qū)。該雜合區(qū)和熒光標(biāo)記區(qū)的總長度(即DNA探針的長度)最好不要短于8-10個基體(鏈節(jié))，且不多于100個基體(鏈節(jié))，以保持室溫條件下DNA探針與樣品DNA的穩(wěn)定雜合。其原因在于，總長度的進一步增加提高了引起DNA探針自身自我雜合反應(yīng)的概率。當(dāng)在較高溫度下進行雜合反應(yīng)時，長度需要加長。在這個實例中，為了形成一個足夠穩(wěn)定的雙鏈，長度要達到23個基體(鏈節(jié))。反應(yīng)溫度的選擇是很重要的，溫度最好設(shè)置為如果DNA探針雜合區(qū)完全符合樣品DNA的互補鏈，雜合作用就能發(fā)生;但是當(dāng)上述區(qū)域與上述鏈不相符合或DNA探針已轉(zhuǎn)變成僅含有標(biāo)記區(qū)的短探針時，鍵合作用就根本不能發(fā)生。從這種觀點來看，反應(yīng)溫度最好略高，因而最好使用具有耐熱性的核酸外切酶。
將含有數(shù)百樣品拷貝的四溴乙烷(TBE)緩沖溶液和0.5μl含有0.1微微摩爾DNA探針的溶液混合，在預(yù)定的條件下進行雜合反應(yīng)。此后，將1單位的核酸外切酶Ⅲ注入溶液中，然后使反應(yīng)進行10分鐘。1單位的核酸外切酶Ⅲ具有作用于雙鏈DNA3′末端的能力，因而在30分鐘內(nèi)可解離約1毫微摩爾的核酸分子?？s短的DNA探針數(shù)量的擴增完全遵循以上在第一個實例中所解釋的相同原理。通過諸如液相色譜、凝膠電泳、毛細管電泳等分離手段使反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的DNA探針分離，然后用熒光檢測儀加以檢測。當(dāng)使用凝膠電泳時，也可使用快速熒光型DNA順序測定儀等設(shè)備，但有4-6厘米的遷移路徑長度就足夠了。在這個實例中，使用了含6%丙烯酰胺凝膠的電泳。也就是說，將短遷移路徑長度的凝膠板連接在DNA順序測定儀上，再把1μl反應(yīng)產(chǎn)物注入電泳池中。所分離的探針的遷移路徑長度就被確定為6厘米。圖3示出了檢測結(jié)果。由于縮短的DNA探針20和未反應(yīng)的DNA探針21的原因，檢測到電泳峰值分別為30和31。由于縮短的DNA探針20的電泳遷移率與未反應(yīng)的DNA探針21的電泳遷移率有所不同，因此未反應(yīng)的DNA探針過量存在并不妨礙縮短的DNA探針的檢測。再者，當(dāng)使DNA探針的原始長度變長時，分離就容易進行。如上所述，通過保持同雜合作用中幾乎一樣的穩(wěn)定程度和控制經(jīng)區(qū)域至次黃嘌呤核苷或熒光分子中連接子部分長度的標(biāo)記區(qū)長度，或者改變標(biāo)記區(qū)長度或標(biāo)記物的類型(如熒光體的類型)而改變縮短的DNA探針的分子量，其結(jié)果是改變了每一DNA探針的遷移速率，或改變了每一DNA探針的標(biāo)記信號類型(如熒光光波長度)，這樣就有可能區(qū)分出哪些DNA探針被樣品和酶所縮短，從而可同時檢測出各種類型的樣品。當(dāng)然，同一類型的樣品可使用相同探針進行多種測試項目的檢測。圖4A顯示出處于圖2B或2E條件下的雜合物，其中DNA探針50、51及52分別用不同的熒光標(biāo)記物2，3和40加以標(biāo)記，然后分別與樣品59的多個部分相雜合，同時進行多種測試項目的檢測。在圖4A中，如上所述，通過改變每一個探針標(biāo)記區(qū)的長度以改變每一個縮短的探針的分子量，其結(jié)果是每一個DNA探針的遷移速率有所變化，就可以區(qū)分出哪些DNA探針被樣品和酶縮短了。圖4B顯示出處于圖2B或圖2E條件下的雜合物，其中對各種不同的樣品60、61、62和63同時進行檢測。DNA探針70、71、72和73分別以不同的熒光標(biāo)志物2、3、40和41進行標(biāo)記，樣品與這些標(biāo)記的DNA探針形成了雜合物。圖4A或圖4B所示的雜合物通過核酸外切酶Ⅲ的催化作用進行如下處理如圖2A至圖2F所述，每一個雜合物的DNA探針的核苷酸被逐次從3′末端處切除掉，形成了一個與雜合物分離而成為游離性的縮短的DNA探針，這樣縮短的DNA探針的數(shù)量就得到了擴增。
經(jīng)核酸外切酶而形成縮短的DNA探針的速率與樣品DNA拷貝的數(shù)量成比例，這樣就易于進行定量估測。例如，當(dāng)樣品DNA的量為0.1微微摩爾時，在數(shù)分鐘后縮短的DNA探針產(chǎn)生的量會比樣品DNA量高出2-3位數(shù)。
由于核酸外切酶Ⅲ對單鏈DNA或RNA并不發(fā)生作用，因此只有雜合的DNA探針才能成為分解作用的靶物。
可通過使用耐熱性酶，提高反應(yīng)溫度和使用較長的探針，如有必要還可升降溫度來促進分解和分離。在上述實例的描述中，核酸外切酶Ⅲ被用于催化過程，在這個過程中核苷酸被逐次從DNA分子末端處切除掉，該酶的作用是把核苷酸從3′末端處切除掉。然而，使用λ核酸外切酶也可能產(chǎn)生如上的效果，這種酶可以將核苷酸從DNA的5′末端處切除掉;或者也可使用核酸外切酶Bal31，該酶從DNA3′末端及5′末端兩處都可以分解掉核苷酸?？梢允褂玫纳鲜鰺晒鈽?biāo)記物包括異硫氰酸熒光素(FITC)、硫氰酸胺101、堿性蕊香紅衍生物、四甲基蕊香紅異硫氰酸(TRITC)等等。
權(quán)利要求
1.一種基因檢測方法，該方法包括使用酶的步驟，該酶可從末端分解DNA或RNA的雙鏈部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因檢測方法，其中所述的酶具有核酸外切酶活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的基因檢測方法，其中DNA或RNA雙鏈部分中的至少一個成鏈部分是以熒光或染料所標(biāo)記的DNA或RNA寡聚物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的基因檢測方法，其中所說的酶具有核酸外切酶活性。
5.一種基因檢測方法，該方法包括以下步驟在存在樣品DNA或RNA的條件下，從末端處分別縮短DNA或RNA探針;并檢測縮短的DNA或RNA探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的基因檢測方法，其中所說的DNA或RNA探針是通過使用了具有核酸外切酶活性的酶而縮短的。
7.一種基因檢測方法，該方法包括以下步驟DNA或RNA探針分別與樣品DNA或RNA雜合;通過使用具有核酸外切酶活性的酶從雙鏈末端逐次分解核苷酸;檢測縮短的DNA或RNA探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的基因檢測方法，其中所說的DNA或RNA探針的長度不少于8個堿基且不多于100個堿基。
9.一種基因檢測方法，該方法包括以下步驟以熒光或染料標(biāo)記的DNA或RNA探針分別與樣品DNA或RNA雜合;通過使用具有核酸外切酶活性的酶從雙鏈末端逐次分解核苷酸;檢測由雙鏈末端核酸分解作用而縮短的DNA或RNA探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的基因檢測方法，其中所述DNA或RNA探針的長度不少于8個堿基且不多于100個堿基。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的基因檢測方法，其中所述用熒光或染料標(biāo)記并縮短的DNA或RNA探針分別用電泳加以檢測。
12.一種基因檢測方法，該方法包括以下步驟大量的DNA或RNA探針(它們從末端到熒光標(biāo)記堿基部位的長度都互不相同)分別與樣品DNA或RNA雜合得到雜合物;通過使用具有核酸外切酶活性的酶從雙鏈末端逐次分解核苷酸;依據(jù)電泳遷移率，將通過具有核酸外切酶活性的酶的作用而縮短的熒光標(biāo)記的DNA或RNA探針與樣品DNA或RNA區(qū)分開來;分別檢測樣品DNA或RNA的多個位點，這些位點都具有不同的堿基序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的基因檢測方法，其中，在每一個所述的DNA或RNA探針中，其預(yù)定位置上的堿基得到了化學(xué)修飾，使得由具有核酸外切酶活性的酶引起的分解作用并不在該位置的堿基上發(fā)生。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的基因檢測方法，其中所述的DNA或RNA探針的長度不少于8個堿基且不多于100個堿基。
15.一種基因檢測方法，該方法包括以下步驟大量的DNA或RNA探針(它們從末端到熒光標(biāo)記堿基部位之間的長度各不相同)分別與多種類型的樣品DNA或RNA雜合得到雜合物;通過使用具有核酸外切酶活性的酶，從雙鏈末端分解核苷酸，依據(jù)電泳遷移率，將通過具有核酸外切酶活性的酶的作用而縮短的熒光標(biāo)記的DNA或RNA探針與樣品DNA或RNA區(qū)分開來;由此分別檢測大量的樣品DNA或RNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的基因檢測方法，其中在每一種所述的DNA或RNA探針中，DNA或RNA探針預(yù)定位置上的堿基得到了化學(xué)修飾，使得由具有核酸外切酶活性的酶引起的分解作用并不在該位置的堿基上發(fā)生。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的基因檢測方法，其中DNA或RNA探針的長度不短于8個堿基且不多于100個堿基。
18.一種基因檢測方法，該方法包括以下步驟大量的DNA或RNA探針(其熒光標(biāo)記類型各不相同)與多種類型的樣品DNA或RNA雜合得到雜合物;使用具有核酸外切酶活性的酶，逐次從雙鏈末端分解核苷酸;區(qū)分縮短及熒光標(biāo)記的DNA或RNA探針，由此檢測多種類型的樣品DNA或RNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的基因檢測方法，其中DNA或RNA探針的長度不少于8個堿基且不多于100個堿基。
20.一種基因檢測方法，該方法包括以下步驟具有不同堿基序列并以許多不同熒光標(biāo)記物所標(biāo)記的DNA或RNA探針與具有不同堿基序列部分的樣品DNA或RNA雜合得到雜合物;通過具有核酸外切酶活性的酶的作用來縮短雜合物;分別檢測具有不同堿基序列部分的樣品DNA或RNA的多個位點。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的基因檢測方法，其中DNA或RNA探針的長度不少于8個堿基且不多于100個堿基。
全文摘要
熒光標(biāo)記性DAN探針11與樣品7雜合生成雙鏈雜合物8；借助于特異分解雙鏈雜合物8的酶重復(fù)進行雜合的DNA探針的逐次分解和分離，達到高速分解單獨雜合在樣品DNA上的DNA探針；在縮短的DNA探針以這種方式擴增性產(chǎn)生之后，將縮短的DNA探針20和未反應(yīng)的DNA探針21區(qū)分開并檢測，以高靈敏地檢測出樣品DNA7?？s短的DNA探針可以大量產(chǎn)生，在不需升降反應(yīng)溫度的條件下，數(shù)分鐘后其數(shù)量可超過樣品DNA量的數(shù)位數(shù)，這樣樣品DNA就可得到迅速的檢測。
文檔編號C12M1/00GK1081719SQ9310857
公開日1994年2月9日 申請日期1993年7月10日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月10日
發(fā)明者神原秀記, 岡野和宣, 村川克二 申請人:株式會社日立制作所