專利名稱：新型組織型纖溶酶原激活劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程藥物，特別是涉及基因工程重組的新型組織型纖溶酶原激活劑。
基因工程重組的組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator簡稱t-PA，下同)，可作為溶血栓藥物，但有如下缺陷1、在血中半衰期甚短;2、血漿中存在t-PA的天然抑制劑-I型纖溶酶原激活劑抑制劑(plasminogen activator inhibitor-1，簡稱PAI-1，下同)可快速抑制t-PA活性。因此，延長t-PA半衰期、引入PAI-1抗性及進一步提高特異性活性是t-PA改構(gòu)研究的重要內(nèi)容。
延長t-PA半衰期的改構(gòu)研究近年來主要集中在t-PA的F區(qū)，F(xiàn)區(qū)的去除可顯著延長半衰期，但F區(qū)是介導t-PA與血栓基質(zhì)纖維蛋白特異親和的區(qū)域，F(xiàn)區(qū)的去除也使t-PA喪失了溶栓特異性。1990年Ahern等提出t-PA的F區(qū)中F區(qū)與E區(qū)的連接序列(42-49位氨基酸殘基)改變可使t-PA半衰期延長，而對其與纖維蛋白的親和力的影響較小，但未報道影響程序(Ahern TJ，et al.J Biol Chem 1990;2655540)。1992年有人證實P47G/K49N在中國倉鼠血中半衰期延長了10倍，但與纖維蛋白親和力大大下降(Nelles L，Li X.-K.Thromb Haemosta(in press))。
已有人證明，去除t-PA結(jié)構(gòu)中296-302位7個氨基酸殘基可使t-PA抗其抑制劑PAI-1的能力大大提高(Madison EL，et al.Nature1989;339，721 X.-K.Li，et al.Blood 1992;79417)。有人研究證明，消除t-PA K1、K2區(qū)糖基化位點可提高其特異性活性、延長其半衰期(Haigwood NL，et al.Protein Engineering 1989;2611 Hotchkiss A，et al.Thromb Haemostas 1988;60255)。
目前尚未見半衰期延長、特異性活性提高、抗PAI-1等多種特性均有改善的t-PA突變體的報道。t-PA F與E區(qū)連接序列的改變雖可顯著延長t-PA半衰期，但同時與纖維蛋白親和力亦有一定程度損失。
本發(fā)明的目的是構(gòu)建出半衰期延長、抗PAI-1、特異活性提高，同時與纖維蛋白親和力不受損害的t-PA組合突變體。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是1、以纖粘蛋白I型F區(qū)間的連接序列及人凝血因子Ⅻ間I型F區(qū)間的連接序列作為t-PAF與E區(qū)間連接序列(44-50位的HSVPVKS)替換物，用DNA定位突變技術(shù)構(gòu)建出置換突變體FR，以期在不影響t-PA與纖維蛋白親和力的同時延長半衰期。
2、用DNA定點突變技術(shù)去除t-PAI-1結(jié)合位點(K296-G302)，構(gòu)建出PAI-1結(jié)合位點缺失突變體△(296-302)，作為抗PAI-1的手段。
3、將K1、K2區(qū)的糖基化位點Asn117和Asn184同時突變?yōu)镚ln117和Gln184，構(gòu)建去糖基化的突變體N117Q/N184Q，以提高t-PA的特異活性。
4、為了將內(nèi)容1、2、3、中的三個單突變體的特性融于一身，用分子剪裁技術(shù)進一步構(gòu)建了三者的組合突變體-FR/N117Q/N184Q/△(296-302)。
本發(fā)明得到了能夠顯著延長半衰期、提高特異活性、具有PAI-1抗性同時與纖維蛋白親和力不受影響的組合突變體，從而得到了多種特性均有改善的新型t-PA溶栓劑候選株。


圖1的說明1、圖1為野生t-PA一級結(jié)構(gòu)及功能區(qū)示意圖。
t-PA是由F區(qū)(1-50)、E區(qū)(51-87)、K1區(qū)(88-176)、K2區(qū)(177-275)及蛋白酶功能區(qū)P(276-527)組成。
2、本發(fā)明所構(gòu)建的t-PA組合突變體-FR/N117Q/N184Q/△(296-302)與野生t-PA比有如下改變A t-PAF區(qū)與E區(qū)的連接序列(H44-S50)被置換成人纖粘蛋白I型F區(qū)間的連接序列及人凝血因子Ⅻ間I型F區(qū)間的連接序列，如ESKPEAEE，在不影響與纖維蛋白親和力的同時延長半衰期。
B K1及K2區(qū)中的糖基化位點N117及N184同時被突變?yōu)镼117及Q184，以消除糖基化位點，增強特異活性。
C 缺失了296-302位共7個氨基酸殘基，以引入PAI-1抗性。
實施例利用定位突變技術(shù)及分子剪裁技術(shù)等構(gòu)建了t-PA F與E區(qū)連接序列H44SVPVKS50突變成纖粘蛋白I型F區(qū)間的連接序列ESKPEAEE的置換突變體FR1、PAI-1結(jié)合位點K296-G302 7個氨基酸殘基缺失的突變體△(296-302)、K1、K2區(qū)去糖基化的突變體N117Q/N184Q。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了三者的組合突變體FR1/N117Q/N184Q/△(296-302)。將此組合突變體的cDNA序列組入了真核細胞表達載體，并在COS-7細胞及CHO細胞中成功地進行了表達，并對表達出的突變體蛋白的特性進行了研究。
結(jié)果如下1、以大白鼠為藥代動力學模型，經(jīng)尾靜脈注入5000IU的此組合突變體，在給藥0-30分鐘內(nèi)7次從頸靜脈插管中抽取血樣，以間接顯色法測血中t-PA變化，并繪制藥一時曲線，從曲線中得知，此突變體的半衰期為28.0分鐘(3只動物的結(jié)果)。同樣方法測得的野生t-PA半衰期為1.7分鐘(2只動物的結(jié)果)?？梢姲胨テ谘娱L了15倍。
2、此突變體的酶活性(12IU/ml)不被PAI-1(12AU/ml)抑制，而等量的野生t-PA活性卻被PAI-1完全抑制，可見此組合突變體獲得了PAI-1抗性。
3、以纖維蛋白瓊脂糖平板法測得的t-PA活性值(IU)與用ELISA法測得含量值(μg)的比值(IU/μg)作為t-PA特異活性值，三次測定結(jié)果平均值為野生t-PA 250IU/μg，組合突變體364IU/μg，可見組合突變體的特異活性提高了46%。
3、根據(jù)文獻Hitoshi Yahara，et al.Thrombosis Haemostasis 1992;68672提供的方法測定了此組合突變體及野生t-PA與纖維蛋白的親和力，此組合突變體與纖維蛋白的親和力略高于野生t-PA。
根據(jù)以上結(jié)果可以認為t-PA突變體FR1/N117Q/N184Q/△(296-302)顯著延長了半衰期、具有PAI-1抗性、特異活性提高了46%，同時與纖維蛋白親和力未受影響且略有升高，是一株新型t-PA溶栓劑候選株。
權(quán)利要求
1.一種基因工程重組的新型組織型纖溶酶原激活劑。其特征是將天然組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator即t-PA)的F與E區(qū)的連接序列為44-50位的HSVPVKS共7個氨基酸殘基置換、改變t-PA結(jié)構(gòu)中296-302位7個氨基酸殘基、并將其結(jié)構(gòu)中K1、K2區(qū)去糖基化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織型纖溶酶原激活劑。其特征是F與E區(qū)的連接序列為44-50位的HSVPVKS共7個氨基酸殘基被下述替換物所置換，其序列為ESKPEAEE;TIANR;KPIAEK;TSRNR;ERHTSVQT;YAYSQLRDQ;DPVDQ;QPLQTYPSS;DSSRW;DPHEAT;DNCRRPG;QRLASQA。
全文摘要
本發(fā)明構(gòu)建了一種基因工程重組的新型組織型纖溶酶原激活劑。將天然組織型纖溶酶原激活劑(tis-sue plasminogen activator即t-PA)的F與E區(qū)的連接序列為44—50位的HSVPVKS共7個氨基酸殘基置換、去除t-PA結(jié)構(gòu)中296—302位7個氨基酸殘基，并將其結(jié)構(gòu)中K1、K2區(qū)去糖基化。得到了能夠顯著延長半衰期、提高特異活性、具有PAI-1抗性，同時與纖維蛋白親和力不受影響的組合突變體，以得到多種特性均有改善的新型t-PA溶栓劑候選株。
文檔編號C12N15/58GK1082111SQ9310923
公開日1994年2月16日 申請日期1993年8月6日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月6日
發(fā)明者劉士輝, 黃培堂, 黃翠芬 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所