專利名稱：編碼可提高耐熱性的脫氨基甲酰酶的dna及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于DNA片段，更詳細(xì)地說(shuō)是關(guān)于編碼可提高耐熱性的、把D-N-氨基甲酰-α-氨基酸轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的D-α-氨基酸的酶(以下稱脫氨基甲酰酶)DNA片段。另外，本發(fā)明還是關(guān)于該DNA片段的制備方法、含有該DNA片段的載體、用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體、耐熱性提高的脫氨基甲酰酶及其制備方法、及使用該脫氨基甲酰酶的氨基酸的改良和制備方法。進(jìn)而，本發(fā)明是關(guān)于將參與脫氨基甲酰酶的耐熱性的氨基酸的突變數(shù)增加1個(gè)以上的方法。
旋光性的D-α-氨基酸類是醫(yī)藥中間體中的重要化合物，特別可以舉出的半合成青霉素類和半合成先鋒霉素類的制備中間體的甘氨酸、D-對(duì)羥基苯基甘氨酸等在工業(yè)上有用的化合物。作為這樣的D-α-氨基酸類的制備方法已經(jīng)知道的是將對(duì)應(yīng)的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸類的氨基甲?；ズ?，而得到D-α-氨基酸類的方法，此時(shí)，氨基甲?；某ィ赏ㄟ^化學(xué)的方法(特公昭58-4707號(hào)說(shuō)明書)和利用微生物酶反應(yīng)的方法(特公昭57-18793號(hào)說(shuō)明書、特公昭63-20520號(hào)說(shuō)明書、特公平1-48758號(hào)說(shuō)明書及特申平2-407922號(hào)說(shuō)明書)來(lái)進(jìn)行的。
可是，為了除去此氨基甲?；捎玫幕瘜W(xué)方法由于使用了大量的硫酸等無(wú)機(jī)酸，在其處理等方面存在著環(huán)境上的問題。另外，利用酶反應(yīng)的方法，存在著酶的生產(chǎn)量尚不充足，即使可能大量生產(chǎn)，其性質(zhì)上有某些不足處，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)基質(zhì)的反應(yīng)性和酶的穩(wěn)定性二者兼顧的酶。
一般，酶的穩(wěn)定性大多不好，所以通常在配制時(shí)，采用了加入穩(wěn)定劑、在低溫下處理等的防止失活手段。因此，在常溫或高溫下將酶實(shí)際上應(yīng)用于反應(yīng)時(shí)，酶的穩(wěn)定性將成為問題，特別是用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，其穩(wěn)定性會(huì)直接影響的產(chǎn)品的成本。另外，特別是用于工業(yè)上時(shí)，作為有利地進(jìn)行酶反應(yīng)的手段，反復(fù)地將固定化酶和固定化菌體等所謂的生物反應(yīng)劑用于反應(yīng)中，但是由于酶的穩(wěn)定性，使用的次數(shù)受到了限制，對(duì)產(chǎn)物成本的影響很大。
因此，本發(fā)明中，作為酶的穩(wěn)定性之一的指標(biāo)，著眼于其耐熱性，通過使用遺傳工程的手段，提高酶的耐熱性，來(lái)增加酶的穩(wěn)定性，制作工業(yè)利用上有利的穩(wěn)定性酶。
本發(fā)明的目的在于為了解決這樣的課題，改良現(xiàn)在所使用的脫氨基甲酰酶，制備成對(duì)基質(zhì)D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的反應(yīng)性高、而且穩(wěn)定性優(yōu)良的脫氨基甲酰酶，使用此酶可高效地生產(chǎn)D-α-氨基酸。
也就是本發(fā)明提供了把含有脫氨基甲酰酶的基因的DNA片段進(jìn)行化學(xué)或酶的誘變處理，使結(jié)合了此DNA片段和載體DNA的重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，篩選耐熱性提高了的生產(chǎn)株，用此基因轉(zhuǎn)化由屬于埃希式屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、桿菌屬、沙雷式菌屬、棒狀桿菌屬或短頸細(xì)菌屬微生物中選出來(lái)的宿主菌體，由于得到的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的酶作用，把D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，在水性介質(zhì)中變換成D-α-氨基酸，收集生成的D-α-氨基酸的D-α-氨基酸的改良制備方法。
因此，本發(fā)明也提供了為了實(shí)施本發(fā)明的、改良了的制備D-α-氨基酸的DNA片段、其制法以及含有該片段的表達(dá)載體、用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化微生物及耐熱性提高的脫氨基甲酰酶及其制備方法。進(jìn)而，本發(fā)明也提供了將參與脫氨基甲酰酶耐熱性的氨基酸的突變數(shù)增加1個(gè)以上的方法。
圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明以下，一邊參照附圖一邊說(shuō)明本發(fā)明。


圖1表示了使用本發(fā)明得到的耐熱性提高了的脫氨基甲酰酶的生產(chǎn)株，經(jīng)熱處理后的脫氨基甲酰酶的耐熱活性圖。
圖2表示了對(duì)于本發(fā)明得到的耐熱性提高了的脫氨基甲酰酶用固定的樹脂對(duì)其耐熱性反復(fù)連續(xù)試驗(yàn)的穩(wěn)定性結(jié)果圖。
圖3表示質(zhì)粒PKK233-2及pKK NE的限制圖。
圖4表示質(zhì)粒pAD108及pAD1086的限制圖。
圖5表示質(zhì)粒pAD402及pAD4021的限制圖。
圖6表示質(zhì)粒pAD429及pAD455的限制圖。
圖7表示E.coli JM109 pAB108及E·coli JM 109pAD455產(chǎn)生脫氨基甲酰酶的反應(yīng)溫度和活性的關(guān)系圖。
圖8表示E.coli JM109 pAD416及E.coli JM109 pAD455對(duì)于產(chǎn)生的脫氨基甲酰酶的pH穩(wěn)定性的圖。
圖9表示引入外來(lái)基因的載體pUC NT及耐熱性提高了的脫氨基甲酰酶表達(dá)載體pNT4553的制備方法。
圖10表示質(zhì)粒pUC NT及pNT4553的限制圖。
一般認(rèn)為酶的耐熱性和穩(wěn)定性是相關(guān)的，嗜熱菌生產(chǎn)的酶是耐熱性高的酶，這些酶幾乎無(wú)有例外的穩(wěn)定性高，以及通過基因的重組技術(shù)，置換氨基酸，得到的耐熱化酶，其穩(wěn)定性也是優(yōu)良的(香川等、細(xì)胞工學(xué)、7卷、509～571(1988))。
作為酶的耐熱化方法，認(rèn)為有改變酶蛋白的氨基酸序列的方法和化學(xué)處理和通過酶反應(yīng)修飾酶的方法。作為通過改變酶蛋白的氨基酸序列提高耐熱性方法有將菌體用亞硝基胍(NTG)等化學(xué)誘變劑和紫外線等進(jìn)行誘變，通過篩選方法和基因重組技術(shù)后，取出目的基因，進(jìn)行化學(xué)的或酶的誘變，而后使該基因回到菌中后進(jìn)行篩選的方法等。取出基因使其誘變時(shí)，供給編碼突變的脫氨基甲酰酶蛋白的DNA片段，用單鏈狀態(tài)進(jìn)行更有效果。制成單鏈狀態(tài)時(shí)，例如可使用引入到噬菌體中的方法等。作為單鏈DNA，即使含有對(duì)應(yīng)脫氨基甲酰酶蛋白的氨基酸序列密碼的DNA鏈，其互補(bǔ)鏈的任何一個(gè)也都可以使用。另外，對(duì)于突變的部位，可認(rèn)為有隨機(jī)導(dǎo)入突變的方法，和把突變導(dǎo)入特異部位的導(dǎo)入方法。
通過化學(xué)反應(yīng)，作為將基因隨機(jī)的誘變、使酶蛋白的氨基酸序列突變的誘變劑有鹽酸羥基胺、亞硝酸鈉、甲酸、肼等。
例如，在使用鹽酸羥基胺誘變時(shí)，若先在M13噬菌體、例如M13 mp19等的雙鏈DNA上連接脫氨基甲酰酶基因，使其感染E.coli JM109等感染，培養(yǎng)后，制備噬菌體，將其用于突變。誘變反應(yīng)使用0.1M到2M、最好是0.25M的鹽酸羥基胺，其pH使用6.0到8.0，最好6.0，反應(yīng)溫度為37℃下，通過1小時(shí)到24小時(shí)的反應(yīng)來(lái)得到。將進(jìn)行此誘變反應(yīng)的噬菌體感染E.Coli，作為雙鏈重組DNA回收，通過轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒中可以制備突變的脫氨基甲酰酶的基因。
另外，在使用亞硝酸鈉、甲酸、肼等的誘變中，基本上可以使用Myers，R、M等所指示的方法(Science229、242～247(1985))。此方法是將由含有脫氨基甲酰酶基因的重組M13噬菌體制成單鏈DNA，并對(duì)其進(jìn)行誘變處理。用亞硝酸鈉誘變時(shí)，使用濃度為0.5M到2M，較好1M，其pH為酸性，較好地是pH為4.3的硝酸鈉，在反應(yīng)溫度為4℃～37℃，較好地25℃，從1分鐘～5小時(shí)，較好30分鐘條件下進(jìn)行反應(yīng)。用甲酸進(jìn)行誘變時(shí)，可通過使用12M甲酸，在4℃～37℃、較好15℃下反應(yīng)2分～10分鐘的條件來(lái)進(jìn)行。另外，用肼誘變時(shí)，可通過使用20%～60%濃度的肼，在25℃下處理3至10分鐘來(lái)完成的。這些突變的單鏈DNA，可通過使用大腸菌DNA多聚酶Klenow片段和SequenaseR等進(jìn)行雙鏈化，通過引入質(zhì)粒制成突變的脫氨基甲酰酶基因。
另外，作為使用酶反應(yīng)的隨機(jī)誘變方法，可舉出使用PCR反應(yīng)(多聚酶鏈反應(yīng))的方法(Leung D、W等、A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology，1，11-15(1989))等。這是使用Taq DNA多聚酶，是從基因的兩端具有序列的合成DNA(DNA引物)分別合成基因，此時(shí)的反應(yīng)條件要使用比通常反應(yīng)高的Mgcl2濃度和基質(zhì)(dNTPs)的濃度，4種基質(zhì)中只有1種的濃度是極低的反應(yīng)條件、通過在用Taq DNA多聚酶基因合成時(shí)發(fā)生的錯(cuò)誤，可以制成具有突變的氨基甲酰酶基因。
作為將基因的突變導(dǎo)入酶蛋白特異部位的方法，可以舉出使用寡聚核苷酸的體外部位特異的突變導(dǎo)入法、突變部位的插入(Cassette)置換法、使用PCR反應(yīng)的方法等。使用寡聚核苷酸的體外部位特異的突變導(dǎo)入法是由插入脫氨基甲酰酶基因的M13重組噬菌體制成單鏈DNA、使用含有突變部分的突變序列合成DNA引物和使用DNA多聚酶Klenow片段樣的酶，使之雙鏈化，通過導(dǎo)入E.coli來(lái)制作的，這些反應(yīng)若使用市售的試劑盒，例如，寶酒造(株)的“MutanTH-K”和“MutanTH-G”、Ama Sham·Japanc的“寡聚核苷酸的部位特異的體外突變體制作系統(tǒng)Version2.0”等時(shí)可以簡(jiǎn)單地進(jìn)行。突變部位的插入式(Cassette)置換法，是用含有突變的合成DNA完全地置換含有想要突變部位的限制酶片段來(lái)進(jìn)行的。使用PCR反應(yīng)的方法，可按照伊藤等(Ito.W.etal)Gene 102，67～70(1991)的方法等來(lái)進(jìn)行。此法是將含有合成DNA引物與基因末端的合成DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，將其與基因全長(zhǎng)DNA雜交后，通過酶使之延伸，通過再次進(jìn)行合成全長(zhǎng)的PCR反應(yīng)來(lái)得到。
在本發(fā)明中，將用以上方法制作的突變脫氨基甲酰酶基因連接在pUC 19和pKK-233-2等的質(zhì)粒載體上，導(dǎo)入E.Coli，例如JM109等中，在含有抗生素等的瓊脂平板培養(yǎng)基上獲得菌落。接著在滅菌的濾紙上復(fù)制此菌落后，保存于平板培養(yǎng)基。干燥后，通過將此濾紙浸在含有溶菌酶和Triton X-100的液體中或者是反復(fù)地從丙酮-干冰法存入和取出(解溶凍結(jié))使之溶菌。接著，將此濾紙，在設(shè)定為65℃、70℃等溫度浴中浸漬一定時(shí)間，例如5分鐘，干燥后，將其浸漬在由于脫氨基甲酰酶活性而引起顯色的反應(yīng)液中。此反應(yīng)液含有氨基甲酰-D-氨基酸的基質(zhì)，也可以使用含有苯酚、4-氨基安替比林、D-氨基酸氧化酶及過氧化酶的物質(zhì)等。顯色的菌落可以耐熱性獲得株分離出。
首先，作為表示酶耐熱性的指標(biāo)，定義其耐熱溫度。所謂的耐熱溫度是指在10分鐘熱處理時(shí)，當(dāng)活性有50%失活時(shí)的處理溫度。作為脫氨基甲酰酶基因的獲取源可以使用通常具有脫氨基甲酰酶的公知微生物。(例如，國(guó)際
發(fā)明者池中康裕, 難波弘憲, 高野昌行, 矢島麗嘉, 山田勇喜雄, 高橋里美 申請(qǐng)人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社