專利名稱：：低分子量肝細胞生長素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生長激素的制備方法，特別是一種低分子量肝細胞生長素的制備工藝。早在本世紀三十年代，英國學者Higgins等人發(fā)現(xiàn)了肝臟再生現(xiàn)象，推測肝臟本身可能能產(chǎn)生一種使肝臟再生的特異物質(zhì)，在特定條件下(胚胎發(fā)育期或肝損傷時)，表現(xiàn)活性，促進正常肝細胞增殖。但是，一直未能成功地找到該物質(zhì)。進入七十年代后，各國學者相繼從不同種屬動物的肝臟、血小板和血漿中分離得到能刺激肝細胞生長的活性物質(zhì)-肝細胞生長因子。八十年代初期，我國有人開始在臨床中用從人胎肝細胞懸液中制取的肝細胞生長因子治療重型肝炎，并取得較為顯著的療效?？墒侨颂ジ蝸碓从邢蓿覂Υ娌槐?，使其應用受到很大限制，為了推廣其應用，使眾多肝病患者受益，各國學者致力于研究該類物質(zhì)的制備方法。目前已知肝細胞生長因子大多為耐熱的蛋白質(zhì)，主要存在于各種幼稚動物肝臟中，只具器官特異性，不具有種屬特異性，因而人們選擇了活性接近于人胎肝的乳豬肝為原料，尋找一條周期短、成本低、簡便實用的制備肝細胞生長因子的途徑。CN1041949A公開的“采用負壓透析法制備肝細胞生長素的方法”，它采用乳豬肝為原料，經(jīng)勻漿，離心沉淀后，取上清透析濃縮，凍干后即得肝細胞生長素。此法因無特異性分離純化手段，產(chǎn)量雖多但純度較差采用負壓透析，不僅費時，而且截留分子的準確性較差，雖經(jīng)分子量為12000透析膜透析，得到的很可能仍是分子量較大的肝細胞生長素，注入人體后，易引起嚴重的免疫排異反應。CN1068036A公開的“一種乳豬肝臟刺激生長因子的制備工藝”同樣采用乳豬肝臟為原料，所不同的是勻漿后通過95℃加熱處理除去雜蛋白，過濾，取出濾液，加入乙醇沉淀和離子交換進一步純化，所得制品純度雖高，但因分子量較大，臨床使用產(chǎn)生免疫排異反應的機率仍較高，并且實驗也證明乙醇沉淀并不能有效地提高產(chǎn)品活性，相反會損失大部分活性。本發(fā)明的目的是提供一種以乳豬肝臟為原料制備出的活性高、分子量低的肝細胞生長素的方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的取經(jīng)檢疫的1-2月齡乳豬肝臟，絞碎后，加入生理鹽水勻漿，加熱至80℃-100℃保持15分鐘，以除雜蛋白，然后在27000g離心力作用下離心15-30分鐘進行分離，取出上清液棄沉淀，測出該上清液即95℃上清液中所含蛋白質(zhì)的量。根據(jù)測出值再加入一定量的生理鹽水使蛋白質(zhì)含量為4-8mg/ml，然后按胰蛋白酶與上清液的蛋白含量比例為1∶50(重量比)加入胰蛋白酶，滴加1mol/LNaOH至PH7.5，在反應溫度為30℃-40℃的情況下作用0.5-7小時，這樣得到的酶解液為小分子活性多肽，可以減低免疫原性，阻止過敏反應的發(fā)生。將得到的酶解液先經(jīng)G3(10um)過濾除去大顆粒，再用截留分子量10KD的Millipore膜超濾，收集濾出液，在濾出液中加入附形劑和保護劑一起凍干即得低分子量肝細胞生長素。這種制備方法的特征是采用胰蛋白酶降解大分子蛋白為小分子活性肽，最后采用超濾純化小分子活性多肽。采用上述制備工藝，其方法簡便實用、周期短、成本低，且經(jīng)胰蛋白酶降解制得的肝細胞生長素是分子量小于1萬的活性多肽，純度高，比活平均可達96.5u/10ug蛋白。下表1將列出生產(chǎn)工藝各階段肝細胞刺激活性狀況。表1生產(chǎn)工藝各階段肝細胞刺激活性狀況<tablesid="table1"num="001"><tablealign="center">工序比活(u/10ug蛋白)純化倍數(shù)肝勻漿1.2195℃上清液32.827胰蛋白酶降解32.727超濾處理98.682凍干成品96.580</table></tables>這種低分子量肝細胞生長素在鴨乙型肝炎肝壞死模型及大白鼠內(nèi)毒素休克模型上證實具有明顯保護作用1、低分子量肝細胞生長素具有對抗腫瘤壞死因子(TNF)、保護肝臟的作用。取20只重慶麻鴨按實驗要求隨機分為5組，設1對照組，4個實驗組(表2)表2實驗鴨分組情況檢測各組鴨血清TNF水平及肝壞死程度，結(jié)果見表3。表3各組鴨血清TNF水平及肝壞死程度注“-”正常;“+”小葉性壞死，少于肝小葉的1/3;“++”亞大塊壞死，壞死范圍1/3-1/2;“+++”廣泛大塊肝壞死;“±”局灶性壞死，肝細胞氣球樣變。從表3中可看出在鴨乙型肝炎壞死模型中，加用內(nèi)毒素和鴨乙肝病毒后，TNF細胞毒性指數(shù)增高，肝壞死程度嚴重，加用TNF單抗和肝細胞生長素后，TNF活性水平和肝壞死程度都明顯減低，因此證明肝生長素同TNF單抗相似，具有對抗腫瘤壞死因子，保護肝臟的作用。2、低分子量肝細胞生長素具有對抗內(nèi)毒素休克的作用。取19只大白鼠按實驗要求隨機分為3組，設兩對照組，一個實驗組。麻醉大白鼠，待頸總動脈導管插入頸總動脈后，測定其初始血壓，靜脈注射內(nèi)毒素的同時腹腔注射肝細胞生長素(4mg/kg)，對照組用生理鹽水、正常成人肝組織提取物腹腔注射，1小時后檢測血壓與TNF細胞毒性指數(shù)變化情況，結(jié)果如下表4HSS保護內(nèi)毒素休克動物模型的血壓及TNF細胞毒性指數(shù)的變化情況注E內(nèi)毒素;NS生理鹽水;HSS肝細胞生長素AHSS正常成人肝組織提取物血壓單位mmHg從表4可看出，加用內(nèi)毒素后，血壓降低和TNF細胞毒性增高明顯，注入肝生長素，血壓降低幅度和TNF細胞毒性增高水平都顯著減低，因此HSS具有對抗內(nèi)毒素休克的作用，成人肝生長素則無此效應。這種低分子量肝細胞生長素在臨床上試用觀察，療效顯著，目前已作為治療重型肝炎的首選藥物。該發(fā)明人在國家“七.五”、“八.五”攻關(guān)期間采用低分子量肝細胞生長素治療重型肝炎，死亡率由攻關(guān)前85%降至36%。它包括25例亞急性重型肝炎、16例慢性重型肝炎，共41例，治療方法為每天靜脈或肌注8萬單位(約8mg)低分子量肝細胞生長素;療程平均為30天;臨床診斷參照1984年(南寧)全國病毒性肝炎學術(shù)會議制訂的標準;療效采用血清總膽紅素下降程度、肝昏迷治愈率、存活率等指標進行考核，結(jié)果如下表5治愈者總膽紅素下降速度(單位mg)從上述3個表的結(jié)果可看出，采用肝細胞生長素治療重型肝炎，具有較為明顯的療效，可退黃，促進肝功能恢復，幫助肝昏迷病人清醒，提高重肝患者的存活率，其中亞重肝患者的療效更佳。下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳述1.95℃上清液的制備取經(jīng)檢疫的1-2月齡乳豬肝臟1187g，絞碎后加生理鹽水2500ml勻漿，加熱勻漿至95℃，保持15分鐘，然后以離心力27000g進行離心分離20分鐘，棄沉淀，取其上清液即95℃上清液，測定蛋白含量為10.8mg/ml。2.胰蛋白酶降解根據(jù)測出的蛋白含量值，加生理鹽水至2700ml，使95℃上清液蛋白含量為6mg/ml，然后加入胰蛋白酶324mg，滴加1Mol/LNaOH至PH7.5，加熱至35℃，作用2小時。3.超濾純化將上述酶解液先經(jīng)G3(10um)過濾，再用截留分子量10KD的Millipore膜超濾。4.凍干處理在濾出液中加入甘露醇80g和人體白蛋白300mg一起凍干，凍干條件10℃，24小時，即得低分子量肝細胞生長素5克。上述制品經(jīng)檢測蛋白含量2.5mg/ml和肝細胞刺激活性為6000cpm/10ug蛋白，澄明度、無菌試驗、PH值、熱原試驗均合格。權(quán)利要求1.一種低分子量肝細胞生長素的制備方法，包括取經(jīng)檢疫的1-2月齡乳豬肝臟，絞碎后，用生理鹽水勻漿、加熱、離心沉淀、凍干的工藝，其特征在于離心沉淀后，取出上清液即95℃上清液，用稀釋劑稀釋，再加入胰蛋白酶進行反應，反應后得到的酶解液還需過濾，超濾后再凍干。2.如權(quán)利要求1所述的低分子量肝細胞生長素的制備方法，其特征在于所用稀釋劑是生理鹽水，將上清液稀釋至4-8mg蛋白質(zhì)/ml。3.如權(quán)利要求1或2所述的低分子量肝細胞生長素的制備方法，其特征在于按胰蛋白酶與95℃上清液的蛋白含量比為1∶50(重量比)加入胰蛋白酶反應，反應條件是滴加1mol/LNaOH至PH7.5加熱至30℃-40℃，保持0.5-7小時。4.如權(quán)利要求3所述的低分子量肝細胞生長素的制備方法，其特征在于反應后得到的酶解液經(jīng)G3(10um)過濾，再用截留分子量10KD的Millipoere膜超濾。5.如權(quán)利要求1所述的低分子量肝細胞生長素的制備方法，其特征在于超濾后得到的濾液中加入附形劑和保護劑一起凍干，凍干條件為10℃，24小時。全文摘要本發(fā)明涉及一種低分子量肝細胞生長素的制備方法。它以乳豬肝臟為原料，采用勻漿、加熱、離心沉淀、降解、純化、凍干等步驟制備。其特征在于用胰蛋白酶降解，用超濾進行純化。這種物質(zhì)分子量低，活性高。經(jīng)動物及臨床研究和試驗，本產(chǎn)品具有對抗腫瘤壞死因子和內(nèi)毒素休克的作用，用于治療重型肝炎時，可退黃，促進肝功能恢復，幫助肝昏迷病人清醒，提高重肝患者的存活率。文檔編號C12P21/00GK1096053SQ9311542公開日1994年12月7日申請日期1993年12月16日優(yōu)先權(quán)日1993年12月16日發(fā)明者張定鳳,黃愛龍申請人:重慶醫(yī)科大學病毒性肝炎研究所