專利名稱：多顆粒抗原傳輸系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顆粒形抗原。特別涉及類病毒顆粒形或類病毒核顆粒形抗原。具體講，本發(fā)明涉及其中的外源抗原決定基存在于類病毒顆?；蝾惒《竞祟w粒上或其內(nèi)的嵌合體抗原。
病毒一般是由許多不同的，連同DNA或RNA有規(guī)律排在一起組裝的蛋白質(zhì)組成的。對(duì)于無(wú)脂質(zhì)包膜的病毒而言，此蛋白質(zhì)同一定的蛋白質(zhì)一起常成層狀或同心狀排列，共形成外表皮或衣殼以及形成所謂的核或內(nèi)衣殼等其它形式。
許多病毒品種，病毒蛋白質(zhì)能在無(wú)核酸的情況下組裝形成所謂的類病毒顆粒或VLPs。同樣，一般同核酸一起共形成病毒核的蛋白質(zhì)能在無(wú)核酸的情況下組裝形成所謂的類核顆粒(CLPs)。正如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“類病毒顆?！焙汀邦惡祟w?！?，用于上述概念中意指在無(wú)病毒基因組核酸情況下的病毒蛋白質(zhì)(或修飾的、或嵌合體病毒蛋白質(zhì))的裝配物。
顆粒形狀實(shí)體中的致免疫抗原決定基的一般原則是極希望構(gòu)成可具體使用的形式，如研制口服或其他粘膜給藥途徑的疫苗。然而，很少有有用的致免疫抗原決定基能容易地制成仍保持其抗原決定基致免疫性的顆粒形式。保存致免疫抗原決定基的顆粒載體的研制工作為傳輸抗原提供了有力的手段。各種類型顆粒業(yè)已用于攜載外來(lái)抗原決定基，這些顆粒有如由乙型肝炎病毒(HBV)表面或核抗原形成的顆粒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和酵母Ty顆粒(1-5)。
VLPs和CLPs就是有致免疫抗原決定基的顆?？乖睦印ｋm然抗原決定基也位于內(nèi)部，但它們常常位于顆粒表面或附近。而且，當(dāng)經(jīng)口、呼吸道或其他粘膜途徑給藥時(shí)，VLPs和CLPs足夠穩(wěn)定和耐降解使之能用作疫苗。后者(粘膜途徑)的特征無(wú)疑與天然形態(tài)的許多病毒是經(jīng)口感染的這一事實(shí)有關(guān)。呼腸孤病毒族的成員即為這類病毒的例子。
然而，下述幾個(gè)因素，使得為并入外來(lái)抗原決定基而對(duì)天然VLPs和CLPs進(jìn)行修飾的種種企圖充滿著困難。首先，經(jīng)常出現(xiàn)的情況是VLPs或CLPs中蛋白質(zhì)片斷的外源蛋白質(zhì)的并入對(duì)顆粒的形成有抑制作用。而且，即使有可能形成顆粒，而所需的外源抗原決定基不一定是致免疫的。例如，它可能位于外源抗原決定基不可能呈現(xiàn)其天然形態(tài)的位點(diǎn)。
據(jù)最近報(bào)導(dǎo)，當(dāng)蘭舌病病毒(bluetongue)(BTV，Orbivirus屬，呼腸孤病毒科)的兩種主要內(nèi)衣殼蛋白(VP3和VP7)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中通過(guò)二元重組桿狀病毒合成時(shí)，形成了類病毒核顆粒(CLPs)(6)，且能用一步蔗糖梯度離心法或鹽沉淀法來(lái)分離這些顆粒。
還發(fā)現(xiàn)用適宜的重組桿狀病毒表達(dá)同VP3和VP7在一起的兩種主要的外衣殼蛋白(VP2和VP5)導(dǎo)致了VPLs的合成。而且，次要的內(nèi)蛋白VP1、VP4和VP6同CLPs(VP3和VP7)的成分或同VLPs(VP2、VP5、VP3、VP7)的成分的不同結(jié)合的表達(dá)，分別得到了VP1、VP4和/或VP6進(jìn)入CLPs或VLPs中的內(nèi)含物。
而且，通過(guò)代表不同的BTV血清型的VP3和VP7種，或其他諸如動(dòng)物流行型出血性病毒(EHDV)VP3和BTV VP7等環(huán)狀病毒屬的共表達(dá)可獲得CLP的合成。而用代表不同BTV血清型的基因可實(shí)現(xiàn)VLPs的合成。
本發(fā)明提供了致免疫的VLPs和CLPs及特別適用于疫苗制劑的VLPs和CLPs。具體講，本發(fā)明提供作為多免疫原的疫苗傳送體系用的遺傳工程的、多成份的類病毒顆粒(VLPs)和類病毒核顆粒(CLPs)，所說(shuō)多免疫原代表能使人致病的病毒，細(xì)菌和細(xì)菌毒素(如乙型肝炎B.HIV.人呼吸道合胞病毒、頑固梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)、牛白血病病毒、Helicobacter Pylori等)的致免疫原。
一方面，本發(fā)明提供顆粒形抗原，該抗原包括能相互合作組裝成類病毒顆粒(VLPs)或類病毒核顆粒(CLPs)的多種蛋白質(zhì)，其中，所說(shuō)顆粒包括第一和第二兩種不同蛋白質(zhì)，而每種蛋白質(zhì)又分別來(lái)自一種挑選的病毒種的第一和第二天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序，其中第一和第二種蛋白質(zhì)中至少有一種是嵌合體，且包括來(lái)自外源蛋白質(zhì)的氨基酸順序(而并非第一或第二種天然蛋白質(zhì))。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種生產(chǎn)嵌合體VLPs或CLPs的方法，該VLPs或CLPs至少包括一種天然蛋白質(zhì)。該方法中VLPs或CLPs使用了包括天然病毒蛋白質(zhì)和非天然蛋白質(zhì)的許多的不同蛋白質(zhì)裝配成。該非天然蛋白質(zhì)包含來(lái)自外源蛋白質(zhì)的氨基順序和來(lái)自天然病毒蛋白質(zhì)的氨基酸順序。
本發(fā)明還提供了一種包括本發(fā)明的有效量的抗原，結(jié)合治療上可以接受的載體或稀釋劑的疫苗組合物。
本發(fā)明也提供了一種給需要治療的宿主誘導(dǎo)保護(hù)性致免疫應(yīng)答的方法，其中包括給寄主施用根據(jù)本發(fā)明的免疫學(xué)上有效量的抗原。根據(jù)本發(fā)明，一方面可將抗原投用給所說(shuō)寄主的粘膜表面，適宜的情況是口服該抗原。
本發(fā)明是基于下述令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即可采用上述技術(shù)來(lái)形成存在外源抗原決定基的CLPs和VLPs。這是根據(jù)本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的下述事實(shí)，VP7蛋白質(zhì)位于CLPs的外表面(帶形成內(nèi)部二十面體亞核的VP3)。當(dāng)與VP7共表達(dá)時(shí)，把代表狂犬病G蛋白質(zhì)的致免疫區(qū)的14氨基順序引入VP3的氨基末端會(huì)導(dǎo)致嵌合體蛋白質(zhì)的表達(dá)和形成CLPs。
進(jìn)一步的研究證明，VLPs和CLPs可作為一種構(gòu)建適用的抗原和致免疫顆粒的手段。這樣，至少包括48個(gè)外源氨基酸的嵌合體BTV VP7蛋白質(zhì)可以并入CLPs和VLPs。具體講，已經(jīng)確定，當(dāng)狂犬病的14氨基酸殘基或乙型肝炎病毒preS2區(qū)的1-48氨基酸殘基并入VP7的氨基末端時(shí)，不僅在感染細(xì)胞中可表達(dá)該嵌合體蛋白質(zhì)，而且它們也可并入CLPs同VP3共表達(dá)。
同樣還確定，當(dāng)代表人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜蛋白質(zhì)V3環(huán)的30氨基酸并入BTV VP7氨基末端時(shí)，合成嵌合VP7且并入CLPs與BTV VP3共表達(dá)。
頑固梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)是人結(jié)腸炎的誘發(fā)劑。毒素A在致發(fā)此種病毒中起著重要的作用。在毒素A中，十肽TIDGKKYYFN重復(fù)了幾次。用編碼VP3和VP7(VP3基因是在多面體啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的，而帶SmaⅠ和SpeⅠ(和XbaⅠ相容的)克隆位點(diǎn)的VP7基因置于多面體啟動(dòng)子控制下)的二元載體在VP7基因氨基末端上克隆編碼頑固梭狀芽孢桿菌十肽毒素A的寡聚核苷酸雙鏈體。用重組桿狀病毒感染的S.frugiperda細(xì)胞表達(dá)VP3和嵌合十肽VP7 CLPs。
置于BTV VP7氨基末端上游和用BTV VP3采用重組桿狀病毒共合成的牛白血病病毒(BLV)抗原決定基并不產(chǎn)生CLPs。然而，當(dāng)未修飾的BTV VP7和融合蛋白質(zhì)與BTV VP3共合成時(shí)，卻產(chǎn)生含融合蛋白質(zhì)的嵌合CLPs。
編碼螺旋桿菌幽脲酶亞基A和B的基因用PCR生產(chǎn)，并在PACUW3載體中克隆。用該質(zhì)粒產(chǎn)生重組桿狀病毒，用該重組桿狀病毒感染的秋粘蟲(chóng)(S.frugiperda)細(xì)胞既產(chǎn)生脲酶亞基A也產(chǎn)生脲酶亞基B。
根據(jù)本發(fā)明的CLPs形的抗原一般含兩種基本蛋白質(zhì)和一種或多種其他任選蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)基本蛋白質(zhì)是病毒主要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)，所說(shuō)任選蛋白質(zhì)則選自次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)。本發(fā)明的CLPs優(yōu)選包含0、1、2或3種其他任選的病毒次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)。
VLPs形的根據(jù)本發(fā)明的抗原，一般含3種基本蛋白質(zhì)和一種或多種其他任選(即可有可無(wú))蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的基本蛋白質(zhì)中的兩種是病毒主要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)，所說(shuō)基本蛋白質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)是病毒主要外衣殼蛋白質(zhì)，所說(shuō)的任選蛋白質(zhì)選自次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)和主要外衣殼蛋白質(zhì)。本發(fā)明的VLPs優(yōu)選包含0或1種其他任選的病毒主要外衣殼蛋白質(zhì)和/或0、1、2或3種其他任選的病毒次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的顆粒性抗原，可包含多種能相互合作共組裝成類病毒核顆粒(CLPs)的蛋白質(zhì)，此抗原包括第一和第二種不同主要結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其中每一種蛋白質(zhì)包括，在三種次要蛋白質(zhì)的任意一種或其結(jié)合物的存在或不存在下，分別由選擇的病毒種或相關(guān)病毒種的第一種和第二種天然蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列，所說(shuō)次要蛋白質(zhì)中的每一種包括由選擇的病毒種或相關(guān)的病毒種的三種次要蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。上述5種蛋白質(zhì)中的至少一種蛋白質(zhì)是嵌合體，并且包含由外源蛋白質(zhì)而非天然蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。
同樣，根據(jù)本發(fā)明的顆粒性抗原，可含多種能相互合作共同組裝成類病毒顆粒(VLPs)的蛋白質(zhì)，其特征在于，此抗原包括第1、第2、第3種和任選的(即可有可無(wú))第4種不同主要結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)中的每一種包括，在3種次要蛋白質(zhì)中的任一種或其結(jié)合物的存在或不存在下，分別從選擇的病毒種或相關(guān)的病毒種的第1、第2、第3和第4種天然蛋白質(zhì)衍生來(lái)的氨基酸序列，所說(shuō)的每一種次要的蛋白質(zhì)包括從選擇的病毒種或相關(guān)的病毒種的3種次要蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。上述8種蛋白質(zhì)中的至少任一種蛋白質(zhì)是嵌合體且包含由外源蛋白質(zhì)而非天然蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。
對(duì)于呼腸孤病毒種的情形，例如BTV等環(huán)狀病毒屬而言，由CLP組成的顆粒性抗原可包括兩種基本的蛋白質(zhì)及一種或多種其他任選的(即可有可無(wú))蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的基本蛋白質(zhì)是病毒主要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)VP3和VP7，所說(shuō)的任選蛋白質(zhì)為從次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)VP1、VP4和VP6中選出的。
蛋白質(zhì)的這些結(jié)合物示于如下
VP3+VP7VP3+VP7+VP1VP3+VP7+VP4VP3+VP7+VP6VP3+VP7+VP1+VP4VP3+VP7+VP4+VP6VP3+VP7+VP1+VP6VP3+VP7+VP1+VP4+VP6同樣，VLPs可包括三種基本蛋白質(zhì)和一種或多種其他任選的(可有可無(wú))蛋白質(zhì)。其中三種基本蛋白有兩種是病毒主要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)VP3和VP7，一種是從VP2和VP5選出的病毒主要外衣殼蛋白質(zhì)，而所說(shuō)的任選蛋白質(zhì)是從次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)VP1、VP4和VP6及主要外衣殼蛋白質(zhì)VP2和VP5中選出的。
這些蛋白質(zhì)的結(jié)合物如下所示VP2+VP3+VP7VP2+VP3+VP7+VP1VP2+VP3+VP7+VP4VP2+VP3+VP7+VP6VP2+VP3+VP7+VP1+VP4VP2+VP3+VP7+VP1+VP6VP2+VP3+VP7+VP4+VP6VP2+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6
VP5+VP3+VP7VP5+VP3+VP7+VP1VP5+VP3+VP7+VP4VP5+VP3+VP7+VP6VP5+VP3+VP7+VP1+VP4VP5+VP3+VP7+VP1+VP6VP5+VP3+VP7+VP4+VP6VP5+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6VP2+VP5+VP3+VP7VP2+VP5+VP3+VP7+VP1VP2+VP5+VP3+VP7+VP4VP2+VP5+VP3+VP7+VP6VP2+VP5+VP3+VP7+VP1+VP4VP2+VP5+VP3+VP7+VP4+VP6VP2+VP5+VP3+VP7+VP1+VP6VP2+VP5+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6本發(fā)明的抗原可用至少一種天然形式的蛋白質(zhì)和同樣的蛋白質(zhì)或其它于嵌合體形式中的蛋白質(zhì)(即并入外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列)制備的?？筛鶕?jù)本發(fā)明的方法來(lái)生產(chǎn)顆粒性嵌合體抗原，其中從所說(shuō)外源蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列包括由外源蛋白質(zhì)抗體識(shí)別的抗原決定基。例如，外源蛋白質(zhì)是一種致病有機(jī)體的蛋白質(zhì)而該顆粒性抗原能在易感受該疾病的生物體中產(chǎn)生保護(hù)性(例如中和作用)抗體或細(xì)胞免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的抗原特別適用于配制疫苗。
嵌合體VLPs或CLPs可包括以嵌合形式摻入的一種或多種主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。在此形式中，CLPs可包括(ⅰ)天然形式的第1種病毒蛋白質(zhì)、(ⅱ)天然形式的第2種病毒蛋白質(zhì)，和(ⅲ)嵌合形式的、包含由天然病毒蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列和由外源蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列的第1種和第2種病毒蛋白質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)。
同樣，根據(jù)本發(fā)明的VLPs可包括(ⅰ)天然形式的第1種病毒蛋白質(zhì);(ⅱ)天然形式的第2種病毒蛋白質(zhì);(ⅲ)天然形式的第3種病毒蛋白質(zhì)，和(ⅳ)包括由天然病毒蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列和由外源蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列的嵌合體形式的第1種和第2種病毒蛋白質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)。
至少包括一種非天然形式的蛋白質(zhì)的嵌合體VLPs或CLPs，可根據(jù)本發(fā)明的方法通過(guò)組裝來(lái)自包括有天然形式的病毒蛋白質(zhì)和非天然形式蛋白質(zhì)的多種不同的蛋白質(zhì)的VLPs或CLPs來(lái)制備。此非天然形式的蛋白質(zhì)包括外源蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列，和天然病毒蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。外源蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列可以位于嵌合體蛋白質(zhì)的N-末端，但可以根據(jù)本發(fā)明來(lái)設(shè)想其它排列法，如將外源蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列插入天然蛋白質(zhì)序列中，或位于其C-末端。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，外源蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列位于嵌合體蛋白質(zhì)N末端，可以使最終的VLPs或CLPs中外源抗原決定基是致免疫的。
為了構(gòu)造能被表達(dá)為包括作為本發(fā)明抗原顆粒成分的嵌合體蛋白質(zhì)的DNA序列，可以使用常規(guī)的定位誘變和基因拼接技術(shù)。同樣，可以各種方式由其組成成分來(lái)組裝所說(shuō)的抗原顆粒。例如，可單獨(dú)制備各成分，然后再于適宜的介質(zhì)中通過(guò)混合各構(gòu)成蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行簡(jiǎn)單結(jié)合即可。然而，優(yōu)選的方案是，共表達(dá)天然和嵌合蛋白質(zhì)，由此能完成抗原顆粒的組裝而不出現(xiàn)表達(dá)降解、修飾或產(chǎn)生其它與它們組裝形成VLPs或CLPs所不相容的多肽這類弊病。更優(yōu)選的方案是共表達(dá)這些構(gòu)成蛋白質(zhì)。
雖然任何適宜的表達(dá)體系均可以使用，但使用包括桿狀病毒表達(dá)載體的表達(dá)體系已獲得了特別滿意的結(jié)果。所以優(yōu)選在昆蟲(chóng)或昆蟲(chóng)的細(xì)胞中表達(dá)其組成蛋白質(zhì)。
下面將參照附圖對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的說(shuō)明附

圖1為含HBV preS2序列上游和與BTV VP7共線性的重組體轉(zhuǎn)移載體;
圖2A-2C為由AcBTV7-preS2產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的SDSPAGE分析結(jié)果;
圖3A-B為由VP3和VP7(泳道1)或VP3，VP7和preS2VP7(泳道2和3)組成的CLPs的SDS-PAGE和Western免疫印跡分析結(jié)果;
圖4A-B為純化的CLPs經(jīng)immunogold-電子顯微鏡所攝照片;
圖5A-C為對(duì)嵌合CLPs的免疫原性所作的SDS-PAEG和Western免疫印跡分析結(jié)果;
圖6是用抗天然的BTV/BTV VP7、嵌合體BTV VP7/HIV-1 V3、由天然的BTV VP3/BTV VP7衍生的CLPs和由BTV VP3/嵌合體BTV VP7/HIV-1 V3衍生的嵌合體CLPs的抗BTV和抗V3(HIV-1)血清所作的Western印跡分析;
圖7表示，頑固梭狀芽孢桿菌毒素A和BTV-10 VP7氨基末端間的連接;
圖8為攜帶頑固梭狀芽孢桿菌毒素A十肽的CLPs和嵌合體CLPs的PAGE圖;
圖9為帶抗十肽抗血清的CLPs和嵌合體CLPs的Western印跡;
圖10為BLV抗原決定基和BTV VP7重組蛋白質(zhì)的構(gòu)建;
圖11A和11B系重組桿狀病毒的表達(dá)Western印跡。把重組感染病毒的sf細(xì)胞溶胞物于膜上進(jìn)行印跡反應(yīng)，分別同(A)抗VP7兔血清和(B)抗pp(142-161)兔血清反應(yīng)。泳道1AcVP3.7，泳道2;AcVP3.B3-7;AcVP3.B1-7;
圖12為用抗VP7兔血清(a)和抗pp(142-161)兔血清(b)對(duì)嵌合體CLPs所作的SDS-PAGE圖(A)和Western印跡分析(B)。泳道1;正常CLPs，泳道2;嵌合體CLPs(B3-7)。
圖13為插入P8/P9和P6/P7寡聚核苷酸雙鍵分子后VP7的DNA和氨基酸的序列，為了以后將其用于外源抗原決定基的克隆，兩種插入體均含有獨(dú)特的PpUMI位點(diǎn)(劃線的);
圖14為原始的VP7基因和帶插入物的該基因的BsXZ圖;
圖15為原始pUC4K-BTVI-VP7的和帶插入物克隆的Bam-HI/BstXI消化物的瓊脂糖凝膠電泳圖。小于350b.p的碎片從凝膠中流走;
圖16為伴隨產(chǎn)生克隆位點(diǎn)的VP7突變;
圖17為伴隨產(chǎn)生BgIII和ScaI位點(diǎn)的突變VP7基因的限制性核酸內(nèi)切酶分析;
圖18系表達(dá)Helicobacter pylori脲酶A和B亞基的重組桿狀病毒感染的S.frugiperda細(xì)胞的溶胞物的PAGE圖;
圖19系表達(dá)Helicobacter pylori脲酶A和B亞基的重組桿狀病毒感染的S.frugiperda細(xì)胞的溶胞物Western印跡圖;
圖20系表明昆蟲(chóng)細(xì)胞中的SIV VP6的表達(dá)的10%SDS-PAGE圖;
圖21為帶SIV VP6的CLPs的SDS-PAGE圖，泳道1僅有CLPs;泳道2、3和4為帶SIV VP6及不同量的CLPs，泳道5僅為SIV VP6。
實(shí)施例1在此實(shí)施例中，將介紹含蘭舌病病毒VP7蛋白質(zhì)(preS2-VP7)氨基末端上游的，及與之共線性的乙型肝炎病毒preS2區(qū)的大部份的嵌合體蛋白質(zhì)的構(gòu)建。
A.質(zhì)粒的構(gòu)建于pAcYM1為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)移載體(PAcBTV10.7)中，通過(guò)把a(bǔ)yw亞型乙型肝炎病毒(HBV)(8，9)衍生的EcoRI-Xhol)片斷轉(zhuǎn)入BTV-10 VP7 DNA氨基末端的辦法來(lái)制備含嵌合體preS2-VP7基因(圖1)的質(zhì)粒，這樣此質(zhì)粒便處于多面體啟動(dòng)子(10，11)的控制下。用順序分析(12)來(lái)證明轉(zhuǎn)移載體中的嵌合體基因的取向。在lipofectin(13，14)存在下，用重組轉(zhuǎn)移載體和AcRP23-1acZDNA使單層S.frugiperda細(xì)胞共轉(zhuǎn)染，來(lái)制備重組病毒，lacZ-陰性表現(xiàn)型的子代病毒是純化的噬斑，回收重組AcBTV-preS2病毒并配制高滴定度的病毒原液。為了引入上游BamHI、SbaI和SmaI位點(diǎn)，借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用寡核苷酸(5′GCGGGATCCCCTCAGACCCGGGGACACTATCGCCGCA)使BTV VP7轉(zhuǎn)移載體(15)的5′編碼區(qū)突變。由于此BTV VP7轉(zhuǎn)移載體也含有下游BamHI位點(diǎn)，所以用BamHI來(lái)消化此修飾的載體并插入pAcYM1(11)。然后用Xbal和SmaⅠ對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行消化，并連接到在兩端用結(jié)合子(劃線的)修飾的HBV(8)的ayw菌株衍生的EcoRⅠ-Xhol片斷上，以提供同經(jīng)切割的Xbal序列互補(bǔ)的5′懸突端和3′平頭末端。衍生的嵌合體基因的氨基末端的序列示于圖1。
B.preS2-VP7的表達(dá)用每個(gè)細(xì)胞AcBTV7-preS2的5個(gè)噬斑形成單位(PFU)感染單層S.frugiperda細(xì)胞來(lái)研究用重組AcBTV7-preS2病毒合成蛋白質(zhì)。感染后48小時(shí)收獲細(xì)胞，并按以前所述的方法溶胞(6)，萃取液用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析。通過(guò)同僅僅表達(dá)38kDa VP7蛋白質(zhì)(15)的野生型AcNPV或AcBTV 10.7比較，HBV-VP7嵌合體(preS2-VP7)所預(yù)期的蛋白質(zhì)大小得到證實(shí)(圖2A)。代表HBV preS2區(qū)的表達(dá)蛋白質(zhì)，同已產(chǎn)生抗HBV preS2肽(氨基酸殘基14-32)的兔抗血清對(duì)其進(jìn)行Western印跡系統(tǒng)分析(圖2B)來(lái)予以證實(shí)。修飾的和未修飾的VP7蛋白質(zhì)同抗血清反應(yīng)產(chǎn)生抗BTV-10病毒顆粒(圖2C)抗性。
以每個(gè)細(xì)胞5PFU的m.o.i，用AcBTVVP-preS2(泳道1)或AcBTV 10.7(泳道2)，或AcNPV(泳道3)或偽感染(泳道4)感染S.frugiperda細(xì)胞。按上述方法制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。用10%SDS-DAGE分離蛋白質(zhì)和(A)用考馬斯蘭染色，或(B)在Immobilon膜上進(jìn)行電印跡并同兔抗preS2反應(yīng)，或(C)用兔BTV-10抗血清作印跡和反應(yīng)。用堿性磷酸酶結(jié)合物檢測(cè)結(jié)合抗體。左手邊的泳道(A)處示出了蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(KD)，指出了AnNPV多面體(P)、preS2-VP7和VP7蛋白質(zhì)的位置。
C.組裝抗原顆粒為了研究所說(shuō)重組蛋白質(zhì)是否因BTV-VP3組裝形成CLPs(6)，用AcBTV-preS2重組病毒和AcBTV 17.3(僅表達(dá)VP3蛋白質(zhì)(16)的重組桿狀病毒)將懸浮S.Frugiperda細(xì)胞培養(yǎng)物共感染，收獲感染的細(xì)胞，溶胞及按以前(6)所述方法進(jìn)行梯度離心分析。盡管兩種蛋白質(zhì)均以高水平表達(dá)，但未回收到形態(tài)學(xué)上的結(jié)構(gòu)(無(wú)數(shù)據(jù)顯示)。用AcBTV 10-7和AcBTV17.3共感染的細(xì)胞產(chǎn)生CLPs(6，無(wú)數(shù)據(jù)顯示)作對(duì)照。
為了測(cè)定嵌合體VP7并入顆粒是否有任何條件，用表達(dá)VP3和VP7(6)的二元重組桿狀病毒(AcBTV17.3-10.7)以每細(xì)胞為2PFU的感染復(fù)制率(m.o.i)和AcBTV7-preS2病毒，以每細(xì)胞為2PFU或8PFU的感染復(fù)制率(m.o.i)對(duì)S.frugiperda細(xì)胞進(jìn)行感染，三天后(p.i)收獲感染的細(xì)胞，溶胞并按以前所述(6)用離心法純化CLPs。
圖3所示的CLPs蛋白質(zhì)剖面指出了兩種VP7形式存在于兩種CLP制劑中。而且，CLPs中嵌合體VP7的量取決于用于共感染的AcBTV7-preS2重組病毒的m.o.i。在m.o.i為2時(shí)，相對(duì)于VP7，preS2-VP7蛋白質(zhì)含量比m.o.i為8時(shí)，用AcBTV7-preS2的情況下要低得多(圖3，A)。在感染復(fù)制率高時(shí)，由染色凝膠所作的估計(jì)，嵌合體VP7的量約為真實(shí)的VP7量的20%?？梢越柚?0%Western印跡分析法、用HBVpreS2肽抗血清來(lái)對(duì)所說(shuō)顆粒中存在嵌合體蛋白質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)(圖3B)。在圖3中，VP3和VP7組成的CLPs(泳道1)，或VP3、VP7和preS2-VP7(泳道2，3)組成的CLPs是在昆蟲(chóng)細(xì)胞中合成的。純化的CLPs用間歇式蔗糖梯度離心法進(jìn)行純化。用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，用考馬斯蘭染色(A)或在Immobilon膜上進(jìn)行電印跡并與兔抗preS2血清反應(yīng)(B)。泳道2和3中，CLPs來(lái)自AcBTV17-3，10-7(m.o.i為2)和AcBTV7-preS2(m.o.i＝δ，泳道2)的共感染，或AcBTV 17-3，10-7(m.o.i＝2)和AcBTV7-preS2(m.o.i＝2，泳道3)的共感染。
用免疫電子顯微鏡、金標(biāo)記的抗HBV preS2血清分析所說(shuō)顆粒上的preS2-VP7蛋白質(zhì)的位置。如圖4A所示，金顆粒在CLPs的外表面(由用AcVP7-preS2共感染昆蟲(chóng)細(xì)胞所得到的經(jīng)純化的CLPs)，這表明preS2序列曝露于此顆粒的表面。在由AcBTV 17.3-10.7衍生的CLPs的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，未檢出有金顆粒(圖4B由僅以AcBTV 17.3-10.7所感染的細(xì)胞得到的純化的CLPs，bar＝100nm)。若用AcBTV17.3-10.7二元重組病毒感染的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物與從AcBTVVP7-preS2感染回收的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物相混合，則回收到CLPs，并用免疫電子顯微鏡，金標(biāo)記的preS2抗血清進(jìn)行類似分析。在CLPs表面未檢測(cè)出有金顆粒。
D.嵌合體CLPs的致免疫性通過(guò)對(duì)這些顆粒進(jìn)行致免疫性評(píng)價(jià)，來(lái)證明此嵌合體CLPs的生物活性。用以前所述的方法(17)從小鼠得到抗純化的嵌合體CLPs的抗血清，檢驗(yàn)對(duì)含preS2區(qū)的表達(dá)的E.coli融合蛋白質(zhì)(18)，該所生成抗血清的反應(yīng)活性(未公開(kāi)GST-preS2數(shù)據(jù))。圖5示出了感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞的考馬斯蘭染色凝膠圖，其中泳道1為用表達(dá)嵌合體preS2-VP7蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞的情況，泳道2和3分別為誘導(dǎo)(泳道2)或非誘導(dǎo)(泳道3)時(shí)用表達(dá)GST-preS2大腸桿菌細(xì)胞感染的情況，該圖還表示對(duì)照組大腸桿菌培養(yǎng)物的GST。
在Western印跡分析中，兩種表達(dá)的蛋白質(zhì)與所得的抗嵌合體顆粒的抗體的反應(yīng)都很激烈。明顯不能染色的非誘導(dǎo)的GST-preS2的融合蛋白質(zhì)帶與抗體(1-4000滴度)的反應(yīng)活性進(jìn)一步證明了致免疫原性極高。
為了證明抗體的確能識(shí)別HBV抗原，用表面抗原陽(yáng)性HBV患者的血清作了類似的Western印跡分析(圖5C)。抗HBV大的(preS1-preS2-S)和中等(preS2-S)的表面抗原的陽(yáng)性信號(hào)證明了本發(fā)明的嵌合體顆粒具有很高的致免疫能力。
圖5表示下述情況的顆粒型的SDS10%PAGE圖(A)和Western免疫印跡(B)1.表達(dá)preS2-VP7的重組桿狀病毒感染的秋粘蟲(chóng)細(xì)胞(Spodoptera frugiperda);
2.在用IPTG誘發(fā)的PGEX-Ⅰ載體中，同谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST-pre-S2)C末端融合的表達(dá)preS2抗原決定基的E.Coli細(xì)胞(18);
3.與泳道2同，無(wú)IPTG誘發(fā)作用;
4.表達(dá)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的E.Coli細(xì)胞和(C)1.用1HBVsAg陽(yáng)性患者血清作Western免疫印跡，L為大的(preS1-preS2-S)HBV表面抗原，M為中等(preS2-S)HBV表面抗原;和2.HBVsAg陰性人血清，抗體按1∶4000的比例稀釋。
另外，由BTV VP3和包含在由HIV-IV3環(huán)衍生的N-末端有30氨基酸序列的BTV VP7的嵌合體蛋白質(zhì)制備嵌合體CLPs。
用抗天然BTV/BTV VP7，嵌合體BTV VP7/HIV-1 V3、由天然BTV VP3/BTV VP7衍生的CLPs和BTV VP3/嵌合體BTV VP7/HIV-1 V3衍生的嵌合體CLPs的抗BTV和抗V3(HIV-1)血清進(jìn)行Western印跡分析。其結(jié)果示于圖6，其中圖片A說(shuō)明抗BTV血清同下述泳道中物質(zhì)相互作用的情況VP7(天然BTV VP3/BTV VP7)、V3-VP7(嵌合體BTV VP7/HIV-1 V3)、CLP(天然BTV VP3/BTV VP7衍生的CLPs)、V3 IN CLP(由BTV VP3和嵌合體BTV VP7/HIV-1 V3衍生的嵌合體CLPs)圖片B說(shuō)明下述泳道中物質(zhì)與抗-HIV-1 V3血清相互作用的情況CLP(天然BTV VP3/BTV VP7衍生的CLPs)、V3 IN CLP(BTV VP3和嵌合體BTV VP7/HIV-1 V3衍生的嵌合體CLPs)。
可以看到嵌合體CLPs同抗BTV和抗HIV-1 V3血清均能相互作用，而天然BTV CLPs不同抗HIV-1 V3血清相互作用。
VLPs也可用下述物質(zhì)來(lái)構(gòu)建(ⅰ)BTV VP3，(ⅱ)包含在其N-末端(從HIV-1 V3環(huán)衍生的)有30氨基酸序列的BTV VP7的嵌合體蛋白質(zhì)，(ⅲ)VP2，和(ⅳ)VP5。
參見(jiàn)圖6，圖片C說(shuō)明下述泳道中物質(zhì)與抗HIV-1 V3血清相互作用的情況V3 IN VLP(從BTV VP2，BTV VP3衍生的嵌合體VLPs，嵌合體BTV VP7/HIV-1 V3和BTV VP5)VLP(從BTV VP2，BTV VP3和BTV VP5衍生的VLPs)。
可以看到嵌合體VLPs能與抗HIV-1 V3血清相互作用，而天然BTV VLPs也表現(xiàn)出與抗HIV-1 V3血清相互作用。然而，嵌合體VP7的遷移率卻比天然VLPs的低。
實(shí)施例2用嵌合體CLPs頑固梭狀芽孢桿菌毒素A十肽的表達(dá)研究如下按以前敘述的方法(25，26)繁殖秋粘蟲(chóng)(sf)細(xì)胞(ILPB-SE21)和重組桿狀病毒，質(zhì)粒DNA的操作采用標(biāo)準(zhǔn)程序(27)。對(duì)于構(gòu)建重組桿狀病毒而言，用Bsu36.1切BacPAK6 DNA對(duì)含外源基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體進(jìn)行脂感染(lipofected)。選取白斑，用兩次連續(xù)噬斑試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行純化，按以前介紹的方法(28)純化嵌合體CLPs，進(jìn)行SDS-PAGE，Western印跡和電子顯微鏡測(cè)試。
參見(jiàn)圖7，在VP7基因的氨基末端上克隆編碼頑固梭狀芽孢桿菌毒素A的寡聚核苷酸雙鏈體。近來(lái)研制的編碼VP3和VP7的二元載體用于此載體中克隆抗原決定基。在多面體啟動(dòng)子控制下表達(dá)VP3基因。而帶Smal和Spel(同XbaⅠ相容的)克隆位點(diǎn)的VP7基因置于多面體啟動(dòng)子控制之下。
用表達(dá)VP3和嵌合體十肽VP7的重組桿狀病毒感染秋粘蟲(chóng)細(xì)胞。制備CLPs并用PAGE，Western印跡和電子顯微鏡對(duì)其進(jìn)行純化和研究。在嵌合體CLPs和CLPs的PAGE圖上，可以看出嵌合體十肽VP7比未修飾的VP7大(見(jiàn)圖8)。
嵌合體VP7(但并非未修飾的VP7)與抗十肽兔抗體進(jìn)行反應(yīng)(見(jiàn)圖9)。利用電子顯微鏡(uranile acetate染料)可以看到嵌合體CLPs似乎不穩(wěn)定，許多VP7突刺消失，一些顆粒看起來(lái)像亞核顆粒。
實(shí)施例3對(duì)用CLPs的BLV(牛白血病病毒)抗原決定基的表達(dá)研究如下把BLV抗原決定基置于VP7氨基末端的上游。用重組桿狀病毒進(jìn)行融合蛋白質(zhì)與BTV VP3的共合成不產(chǎn)生類核顆粒(CLPs)。然而，當(dāng)用未修飾的BTV VP7和所說(shuō)融合蛋白質(zhì)同BTV VP3共合成時(shí)，則產(chǎn)生含融合蛋白質(zhì)的嵌合體CLPs。
用于此研究的三種BLV gp51抗原決定基的序列列于下表1中。把表2中的BLV gp51抗原決定基序列的退火寡聚核苷酸置于PAcBTV10.7(28)或PAcVC3.BTV 10.7BTV17.3(29)質(zhì)粒中的BTV 10 VP7 cDNA的氨基末端來(lái)制備重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)移載體。
表1.用于本研究的BLV gp51中的抗原決定基抗原決定基 BLV gp51氨基酸序列評(píng)估B1 98-117(20個(gè)殘基)合孢體抑制作用B2 169-192(24個(gè)殘基)T輔助抗原決定基和結(jié)合于細(xì)胞受體上的結(jié)合位B3 142-161(20個(gè)殘基)鉸鏈區(qū)和在三聚體中兩個(gè)gp51分子間的接觸。
表2.為置于BTV10 VP7 cDNA中的編碼BLV抗原決定基的寡聚核苷酸的序列抗原決定基 序列B1 5'-CTAGAAAATGAGCCAAGCCGATCAAGGGTCCTTTTATGTCAATCATCAAATTTTATTCCTGCATCTCAAG-3'5'-CTTGAGATGCTGGAATAAAATTTGATGATTGACATAAAAGGACCCTTGATCGGCTTGGCTCATTTT-3'B2 5'-CTAGAAAATGAGTTTAAATCAAACGGCACGGGCCTTCCCAGACTGTGCTATATGTTGGGAACCTTCCCCTCCCTGGGCTCCCGAA-3'5'-TTCGGGAGCCCAGGGAGGGGAGGGTTCCCAACATATAGCACAGTCTGGGAAGGCCCGTGCCGTTTGATTTAAACTCATTTT-3'B3 5'-CTAGAAAATGAGTAAAATTCCTGATCCCCCTCAACCCGACTTCCCTCAGCTGAACAGTGACTGGGTTCCCTCT-3'5'-AGAGGGAACCCAGTCACTGTTCAGCTGAGGGAAGTCGGGTTGAGGGGGATCAGGAATTTTACTCATTTT-3'
同上述三種轉(zhuǎn)移載體的每一種以及前面所述使用Lipofectin的AcRP23-Lac Z DNA一起共轉(zhuǎn)染單層s.f(秋粘蟲(chóng))細(xì)胞以產(chǎn)生重組桿狀病毒。帶Lac Z陰性表現(xiàn)型的子代病毒是純化的斑，并用SDS-PAGE分析及用抗BTV10兔血清和抗BTV10 VP7單克隆抗體(抗VP7 MAb)進(jìn)行IIP實(shí)驗(yàn)(間接免疫過(guò)氧化酶實(shí)驗(yàn))進(jìn)行挑選。用IIP實(shí)驗(yàn)和使用抗BTV10 VP7(抗VP7)及抗BLV gp51合成肽(抗pp)兔血清的Western印跡分析方法，檢驗(yàn)原種重組病毒。
IIP實(shí)驗(yàn)所用IIP實(shí)驗(yàn)類似于已知技術(shù)介紹的方法(Sugiyama等人(1989)Res.Vet.Sci.46∶283-285)。簡(jiǎn)單地講，用甲醇把用重組桿狀病毒感染的sf(秋粘蟲(chóng))細(xì)胞固定于微滴板上，然后用封閉液(5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖鹽水)復(fù)蓋之，再用抗體探測(cè)，接著由過(guò)氧化酶蛋白質(zhì)A(Bio Rad)檢測(cè)。用鄰苯二胺使結(jié)合的過(guò)氧化酶蛋白質(zhì)A顯現(xiàn)出。
經(jīng)SDS-巰基乙醇處理后，用SDS-PAGE對(duì)感染的sf細(xì)胞和CLPs進(jìn)行分析。把蛋白質(zhì)印跡于(Millipore公司產(chǎn))Immunobilon膜后，浸漬于封閉溶液中過(guò)夜，然后用抗VP7或抗pp血清檢測(cè)，接著用過(guò)氧化酶蛋白質(zhì)A檢測(cè)，以及ECL體系(Amersham)檢測(cè)。
用序列分析來(lái)確定在轉(zhuǎn)移載體中的嵌合體基因的取向(圖10)。構(gòu)建表達(dá)BLV B1-BTV 10 VP7嵌合體(AcB1-7)和BLV B3-BTV VP7嵌合體及VP3(AcVP3.B3-7)的重組桿狀病毒業(yè)已完成。進(jìn)一步對(duì)另一重組病毒AcVP3.B2-7的噬斑進(jìn)行純化。如表3所示，所有3種重組病毒蛋白質(zhì)均同抗BTV10兔血清和抗VP7 MAb反應(yīng)。
表3以重組桿狀病毒感染的sf細(xì)胞的抗體的免疫活性(用IIP實(shí)驗(yàn)測(cè)定)重組桿狀病毒抗體 AcNPV AcB1-7 AcVP3.B2-7 AcVP3.B3-7抗BTV10 - + + +抗-VP7 MAb - + + +抗-pp(98-117) - + NT* -抗-pp(142-161) - - NT +＊NT未實(shí)驗(yàn)AcVP3.B3-7感染的sf細(xì)胞也同抗pp(氨基酸殘基142-161)兔血清反應(yīng)，但ACB1-7蛋白質(zhì)不同抗pp(98-117)兔血清反應(yīng)。然而，由于此抗pp(98-117)血清也不同BLVgp51抗原反應(yīng)(表4)，所以由此可以檢驗(yàn)用抗BLV gp51或抗BLV兔血清的BLV B1表達(dá)。
表4.用重組桿狀病毒感染的sf細(xì)胞溶胞物和BLV gp51抗原的抗體的免疫活性(用Western印跡測(cè)定的)重組桿狀病毒抗體 AcVP3-7 AcB1-7 AcVP3.B3-7 BLVgp51抗-VP7 serum + + + NT抗-pp(98-117) - - - -抗-pp(142-161) - - + +
表5 嵌合體CPs的形成重組桿狀病毒 CLP-的形成嵌合體 AcB1-7+AcBTV17.3 未嵌合體 AcB1-7+AcBTV10.7-17.3 形成嵌合體 AcVP3.B3-7 未嵌合體 AcVP3.B3-7+AcBTV10.7 形成嵌合體 AcVP3.B3-7+AcBTV10.7-17.3 形成正如所預(yù)計(jì)的那樣，用Western印跡分析分子量表明，嵌合體蛋白質(zhì)B1-VP7和B3-VP7及BTV VP7為40kd、42kd和38kd(圖11A)。
嵌合體CLPs的形成用AcB1-7和AcBTV17.3共感染或用AcVP3.B3-7感染的sf細(xì)胞中都不形成CLPs，即使兩種情況下蛋白質(zhì)合成水平都很高(表5)。只有當(dāng)用這些重組病毒和表達(dá)真實(shí)VP7的重組病毒共感染的細(xì)胞才能形成嵌合體CLPs。用抗VP7和抗pp(142-161)兔血清的Western印跡分析法即可證實(shí)由AcVP3-7感染的sf細(xì)胞所得到的CLPs中存在嵌合體蛋白質(zhì)(B3-7)(圖12)。
實(shí)施例4按如下方法用修飾和變異的VP7基因表達(dá)肝炎B preS2抗原決定基。
按以前所述的方法(25，28)繁殖sf細(xì)胞(ILPB-sf21)和重組桿狀病毒。將標(biāo)準(zhǔn)程序用于質(zhì)粒DNA操作(27)。
按所述方法(30)進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))隨后進(jìn)行蛋白酶K消化。用BSU36Ⅰ切BacPAK6 DNA脂感染(Lipofected)含外源基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體構(gòu)建重組桿狀病毒，挑選白噬斑并用兩次連續(xù)噬斑分析進(jìn)行純化(31)。按前面所述進(jìn)行嵌合體CLPs純化、SDS-PAGE分析、Western印跡和電子顯微鏡分析(28)。
氨基末端缺失用于本發(fā)明前述研究中的VP7載體用VP7的氨基末端作外源抗原決于基的連接物，雖然50aa這樣大的抗原決定基能在嵌合體CLPs的表面表達(dá)，但此載體體系一般需要用某些未修飾的VD7共感染，否則在大多數(shù)情況下將不形成顆?；虿环€(wěn)定。
因此，為了提高作為載體的VP7的容量，擬構(gòu)建氨基末端缺失的VP7。如果VP7的氨基末端序列不一定為形成CLPs所需，那么它們可以由其他的氨基酸序列(外源抗原決定基)來(lái)代替，并可以插入較大的順序(大于50aa)。
利用PCR技術(shù)，使用反向引物構(gòu)建二種氨基末端缺的VP7GGCGAGATCTTA.AGA.GAC.GTT.TAATG.GGBglⅡ直接引物 M E I L G IMEI GGCAGATCTACCATG.GAA.ATT.TTG.GGG.ATA.G(29aa BglⅡ缺失) M A Q R N E MMAQ GGCAGATCTACCATG.GCA.CAA.AGA.AAT.GAG.ATG.T55aa BglⅡ缺失)
用這些引物經(jīng)PCR反應(yīng)所得的片斷用蛋白酶K處理，苯酚和乙醇沉淀，用BgIII限制性核酸內(nèi)切酶消化后，使PCR片斷克隆于pAcYM1桿狀病毒表達(dá)載體的BamHI位點(diǎn)上(32)。用BacPAK6線性化的桿狀病毒DNA得到重組病毒(31)。用考馬斯蘭染色聚丙烯酰胺凝膠來(lái)證實(shí)平截VP7蛋白質(zhì)氨基末端的表達(dá)。正如預(yù)計(jì)的那樣，平截VP7蛋白質(zhì)具有的分子量為24KD(29aa缺失)和30KD(55aa缺失)。
用表達(dá)VP3的重組桿狀病毒和表達(dá)VP7(29aa缺失)、VP7(55aa缺失)或作為陽(yáng)性對(duì)照的VP7的重組桿狀病毒共感染sf細(xì)胞制備CLPs。感染后溶胞48小時(shí)，按以前所述方法對(duì)CLPs進(jìn)行純化(28)。僅在用未缺失的VP7(而不是其平截變種)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中制備出CLPs，由此得出結(jié)論，VP7的氨基末端部分是形成CLPs所必要的，因此用外源序列來(lái)置換是不可能的。
VP7親水區(qū)的插入物本實(shí)驗(yàn)的目的是測(cè)定VP7分子中的能攜代額外序列的區(qū)域，由于該區(qū)域有利于表達(dá)不同構(gòu)象抗原決定基。研究這樣載體是重要的，因?yàn)榇蟛糠值闹旅庖邲Q定基是有不同構(gòu)象的。
業(yè)已選定VP7親水區(qū)作為該研究對(duì)象，因?yàn)橐话闱闆r下疏水區(qū)為分子間和分子內(nèi)的相互作用所需。
把二個(gè)BstⅪ位點(diǎn)(105位和937bp)用于將氨基酸序列插入VP7。這兩個(gè)位點(diǎn)均位于為VP7親水區(qū)編碼的VP7基因部分。對(duì)于第1位點(diǎn)(105位)來(lái)說(shuō)，此VP7三級(jí)結(jié)構(gòu)是已知的。其內(nèi)的氨基酸插入物應(yīng)位于A和Bβ層間的環(huán)內(nèi)，因此需要進(jìn)行Ⅹ-射線結(jié)晶學(xué)研究。所以，可以預(yù)計(jì)此位點(diǎn)的插入不會(huì)對(duì)VP7的三級(jí)結(jié)構(gòu)有干擾。
為了實(shí)驗(yàn)將這些位點(diǎn)用于表達(dá)外源抗原決定基的可能性，分別合成編碼四種氨基酸的寡聚核苷酸雙鏈鏈體(圖13)。
用BstⅪ限制性核酸內(nèi)切酶消化含于PUC4K載體BamHI位點(diǎn)上克隆的S7基因的PUC4K-BTV-10 S7質(zhì)粒，并將p6/p7和p8/p9寡聚核苷酸雙鏈體分別與之連接。
用BamHI和BsⅪ限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行消化檢驗(yàn)所得克隆(圖14和15)。帶插入物的VP7基因從PUC4K載體上切除后，再克隆于BamHI切割和脫磷酸的pAcYMI載體中(32)，并用BsⅪ消化驗(yàn)證。
按上述方法制備帶插入物的表達(dá)VP7變種的重組桿狀病毒。用表達(dá)VP3的重組桿狀病毒和帶插入物的表達(dá)VP7的重組桿狀病毒對(duì)sf細(xì)胞進(jìn)行共感染。用未修飾的VP7(但不是帶4aa插入物的VP7變種)制備出CLPs。因此可以得出結(jié)論，用于插入物的位點(diǎn)不適合于載體目的。
內(nèi)點(diǎn)突變同時(shí)引入獨(dú)特克隆位點(diǎn)來(lái)制備VP7基因的兩個(gè)不同的點(diǎn)突變，以將其用于克隆外源致免疫的抗原決定基?？寺TV10 VP7基因于pAcCL29質(zhì)粒BamHI位點(diǎn)上(具有單鏈能力的桿狀病毒表達(dá)載體)(8)。該突變示于圖16。突變基因的限制性核酸內(nèi)切酶分析示于圖17。
一次突變把Lys255變?yōu)镾er產(chǎn)生ScaⅠ位點(diǎn)，另一次突變把Gly169變?yōu)镾er產(chǎn)生BgIII克隆位點(diǎn)。第二次突變是特別感興趣的，因?yàn)檫@使VP7的RGE主體發(fā)生突變，它涉及細(xì)胞受體的結(jié)合。因此RGE主體可能在CLPs的表面，且可用于體現(xiàn)外源抗原決定基。
業(yè)已構(gòu)建了表達(dá)突變VP7基因的重組桿狀病毒。幾次用表達(dá)VP3和突變VP7S(各突變體單獨(dú)用)的重組桿狀病毒共感染sf昆蟲(chóng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，均證實(shí)兩種突變均使CLPs形成。然而，在Lys變至Ser的突變中，CLPs似乎不完全且缺乏某些VP7。而在Gly變至Ser的突變中，形成的CLPs是完全的，看不出同用未突變的VP7生產(chǎn)的CLPs有差別。此位點(diǎn)將開(kāi)發(fā)用于克隆外源致免疫抗原決定基。
實(shí)施例5螺桿菌屬(Helicobacter)幽門(mén)脲酶亞基A和B抗原決定基作為CLPs的表達(dá)研究如下。幽門(mén)螺桿菌是胃潰瘍的誘發(fā)劑。生產(chǎn)螺桿菌屬幽門(mén)脲酶有利于研制抗此病的疫苗(33)。
將二元桿狀病毒載體pAcUW3用于使用單桿狀病毒的螺桿菌屬幽門(mén)的A和B兩種亞基的表達(dá)(34)。按所述方法進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(30)。用Bsu36.1切BacPAK6DNA對(duì)含脲酶A和B亞基的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行脂感染(lipofected)以構(gòu)建重組桿狀病毒。收集噬斑，以兩次連續(xù)噬斑試驗(yàn)進(jìn)行純化(31)。按以前所述方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(28)。
用PCR方法，以2.7kb TagⅠ克隆(W.Thomas)作為模板，生產(chǎn)編碼螺桿菌屬幽門(mén)脲酶亞基A和B的基因。在多面體啟動(dòng)子控制下，在pAcUW3載體中，脲酶A亞基于BgHI位點(diǎn)將所說(shuō)含編碼脲酶亞基的結(jié)構(gòu)基因的PCR片斷克隆。用Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶確定pAcUW3A，B.質(zhì)粒中的PCR片斷的取向。
用此質(zhì)粒生產(chǎn)重組桿狀病毒。若用此重組桿狀病毒感染sf細(xì)胞，產(chǎn)生脲酶A和B亞基(圖18)。在Western印跡上可見(jiàn)A和Bv亞基同抗脲酶抗體反應(yīng)(圖19)。亞基A的表達(dá)很好，而亞基B未表達(dá)到這樣高的水平。亞基B似乎十分不穩(wěn)定，在Western印跡上可見(jiàn)脲酶特異性譜帶梯，這可能是有節(jié)制地表達(dá)的原因之一。
實(shí)施例6前面業(yè)已證明，如用桿狀病毒載體表達(dá)，BTV的三種次要蛋白質(zhì)，VP1、VP4和VP6能并入CLPs。本實(shí)施例則介紹是否這些蛋白質(zhì)能促進(jìn)CLPs中的外源抗原決定基的傳送。為此目的，本實(shí)施例介紹通過(guò)缺失突變和其后插入外源抗原決定基體來(lái)開(kāi)發(fā)VP6蛋白質(zhì)所作的種種努力。業(yè)已證明VP6羧基末端的缺失體可包入CLPs衣殼內(nèi)。
構(gòu)建帶7-輔助抗原決定基的嵌合體蛋白質(zhì)，此決定基來(lái)自BTV的VP6蛋白質(zhì)的羧基末端(HindⅢ位，通過(guò)去除23氨基酸)上的SIV(41-62氨基酸)的gag基因。所得蛋白質(zhì)包于類核顆粒(CLPs)衣殼內(nèi)。
借助PCR，使用標(biāo)準(zhǔn)方法合成SIVgag抗原決定基。克隆的SIVgag基因用作模板，下面的核苷酸作引物1.正向引物HindⅢ5′CGCGAAGCTTCGCAAGCACTGTCAGAAGG
2.反向引物5′GCGCAAGCTTGGATCCTATTGATGGTCTCC保持正向引物上的HindⅢ位點(diǎn)和反向引物上的HindⅢ和BamHI位點(diǎn)。
構(gòu)建嵌合體質(zhì)粒用HindⅢ消化含VP6 cDNA的質(zhì)粒pUC19大片段以凝膠提純。把PCR合成的HindⅢ消化片斷克隆于該凝膠純化的大片斷上，通過(guò)定順?lè)治鰜?lái)檢查取向和序列。
構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體用BamHI消化從pUC19切割下嵌合體VP6 SIV基因，并用桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcYM1于BamHI位點(diǎn)克隆。用定序分析來(lái)確定其取向。
用BTV VP6制備表達(dá)SIV抗原決定基的重組桿狀病毒單層sf21細(xì)胞是共轉(zhuǎn)移載體和消化的桿狀病毒bakpac6 DNA的Bsu 361。感染后60小時(shí)收集含子代病毒的上清液。此重組病毒對(duì)野生型(蘭斑)來(lái)說(shuō)是純化的噬斑(白斑)。
SIV VP6于CLPs中包殼用表達(dá)VP3和VP7的二元重組桿狀病毒和SIV VP6重組桿狀病毒共感染所說(shuō)細(xì)胞。感染后48小時(shí)純化此CLPs。
構(gòu)建表達(dá)SIV VP6嵌合體蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒構(gòu)建的此重組體是完全的。此嵌合體蛋白質(zhì)的表達(dá)用35s甲硫氨酸體外標(biāo)記和SDS-PAGE(同天然的VP6蛋白質(zhì)比較)進(jìn)行分析。當(dāng)天然VP6缺失23氨基酸而嵌合體蛋白質(zhì)(gag抗原決定基)加上23個(gè)氨基酸則兩者有同樣的分子量。
SIV VP6于CLPs中包殼在用二元重組病毒進(jìn)行共感染下，把SIV VP6包殼于由VP3和VP7形成的CLPs中。
把已制備的含SIV-VP6的大量的CLPs接種小鼠進(jìn)行嵌合體SIV免疫性(主要是T細(xì)胞應(yīng)答)評(píng)估。進(jìn)一步的計(jì)劃是開(kāi)發(fā)體現(xiàn)外源免疫的T細(xì)胞抗原決定基的VP6蛋白質(zhì)。
用本領(lǐng)域內(nèi)公知方法，如簡(jiǎn)單地混合來(lái)配制本發(fā)明的疫苗。該疫苗的用量是普通技術(shù)人員容易確定的。成人的適宜劑量為10μg-100mg，如50μg-50mg。兒童可以使用類似劑量。人用的載體體系有如腸釋放膠囊等，使本發(fā)明的抗原在胃的酸性環(huán)境下得到保護(hù)。
也可使用佐劑。適宜的粘膜佐劑有霍亂毒素。可以使用的其他佐劑有霍亂毒素的非毒性衍生物。佐劑的用量取決于所用的類型，一般而言，如用霍亂毒素，用量為5μg-50μg左右，如10μg-35μg。適宜的載體有腸溶膠囊和聚丙交酯-乙交酯微粒。0.2NNaHCO3和/或含鹽水是適宜的稀釋劑。
優(yōu)選的給藥方式有口服、鼻、直腸或眼給藥?？诜o藥可傳輸?shù)狡渌鸊.I粘膜，如腸粘膜。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以煙霧劑，懸浮劑，膠囊劑和/或栓劑的形式用于粘膜表面。給藥方法對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
簡(jiǎn)言之，已根據(jù)含廣泛研究的各種外源病毒抗原致免疫區(qū)的VP7構(gòu)建了BTV結(jié)構(gòu)蛋白嵌合體(如狂犬病毒糖蛋白G、乙型肝炎病毒preS2區(qū)、HIV和SIV gag及env蛋白質(zhì))。將代表狂犬病G蛋白質(zhì)致免疫區(qū)的10氨基酸殘基序列引入VP7的氨基末端，用重組桿狀病毒表達(dá)嵌合體蛋白質(zhì)，并經(jīng)與其他BTV蛋白質(zhì)共表達(dá)并入CLPs和VLPs。此兩種顆粒均已用于小鼠引發(fā)免疫應(yīng)答。并用Western印跡分析證明產(chǎn)生了識(shí)別為真正狂犬病G蛋白質(zhì)的血清。同樣，表達(dá)了含大部分乙型肝炎病毒preS2區(qū)(氨基酸殘基1-48)的上游，和同VP7蛋白質(zhì)氨基末端(preS2-VP7)共線性的嵌合體VP7蛋白質(zhì)，并在真實(shí)的VP7和VP3存在下并入所說(shuō)CLPs。兩種VP7蛋白質(zhì)均并入了CLPs。并入CLPs的preS2-VP7的比例受真實(shí)的VP7的表達(dá)水平的影響。對(duì)此嵌合體顆粒所作的免疫電子顯微鏡觀察指出preS2抗原決定基曝露于CLPs的表面。
對(duì)于HIV和SIV gag及env蛋白質(zhì)而言，已實(shí)驗(yàn)了于三個(gè)不同的區(qū)插入嵌合體VP7(如，HIV-1 env的VP3環(huán)、SIV gag的氨基酸殘基41-60、SIV gag蛋白質(zhì)的氨基酸殘基161-180)。這些抗原決定基的每一個(gè)均與BTV VP7蛋白質(zhì)的氨基末端融合，并用重組桿狀病毒表達(dá)。然后將每一重組病毒同表達(dá)BTV VP3蛋白質(zhì)的第二種重組病毒一起用于感染昆蟲(chóng)細(xì)胞以形成CLPs。生物化學(xué)和電子顯微鏡分析均表明形成的嵌合體CLPs同BTV CLPs類似。免疫金-陰性染色電子顯微鏡分析證實(shí)這些抗原決定基曝露于CLPs的表面。也構(gòu)建了這樣的嵌合體VLPs，其中的HIV env蛋白質(zhì)的V3環(huán)插入BTV VP7的氨基末端，且同表達(dá)VP3的重組桿狀病毒及(1)BTV VP2和(2)BTV VP5共表達(dá)。
所得數(shù)據(jù)指出，當(dāng)大的抗原決定基，如HBV preS2的48氨基酸并入BTV VP7的氨基末端時(shí)，在同BTV VP3共表達(dá)時(shí)阻止了CLPs的形成。然而，當(dāng)與制備VP7和VP3的二元基因載體共表達(dá)時(shí)，則并入了嵌合體蛋白質(zhì)。
相反的，如將小的抗原決定基(如代表狂犬病G序列的10氨基酸序列)并入VP7氨基末端，僅用VP3共表達(dá)，則形成CLPs。同樣，業(yè)已發(fā)現(xiàn)使用如由HIV V3環(huán)(30氨基酸殘基)高度可變區(qū)衍生的N-末端序列嵌合體VP7，即可在無(wú)真實(shí)的VP7蛋白質(zhì)存在下形成CLPs。
BTV的VP7以三聚體形式存在于CLPs表面。近來(lái)分析表明，如用合成大量VP3的載體共感染制備不足的VP7，則產(chǎn)生不完全的CLPs，即缺失某些表面VP7排列的CLPs。也可依次把VP7加到VP3亞核中，首先加到穩(wěn)定此結(jié)構(gòu)的位置，然后加到使CLPs表面結(jié)構(gòu)完整的位置。如使用此種辦法不能僅用VP3使嵌合體VP7制備成CLP時(shí)，則補(bǔ)充入未修飾的VP7蛋白質(zhì)，以允許并入嵌合體蛋白質(zhì)中。
本發(fā)明涉及含乙型肝炎病毒(HBV)preSe區(qū)的48個(gè)氨基酸殘基、HIV-1 V3環(huán)30氨基酸殘基和狂犬病毒G蛋白質(zhì)10氨基酸殘基的嵌合體VP7蛋白質(zhì)的表達(dá)。為制備嵌合體CLPs和VLPs，將嵌合體VP7蛋白質(zhì)與天然BTV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)一起在桿狀病毒中來(lái)表達(dá)。
在最大的嵌合體蛋白質(zhì)，VP7/HDV pre-S2情況下，雖然在同VP3表達(dá)時(shí)，此蛋白質(zhì)不能包容于CLPs內(nèi)，但當(dāng)用VP3和VP7共表達(dá)時(shí)，此蛋白質(zhì)能包容入CLPs內(nèi)，這一事實(shí)表明此顆粒可適應(yīng)各種形式的VP7。已對(duì)這些顆粒的生物和免疫特性進(jìn)行了分析。正如免疫電子顯微鏡所證實(shí)的那樣，HBV抗原決定基位于CLPs表面。
只有當(dāng)sf細(xì)胞被該重組病毒和表達(dá)BTV的未修飾的VP7和VP3的重組桿狀病毒共感染時(shí)，嵌合體蛋白質(zhì)才在sf細(xì)胞中形成BTV類核顆粒(CLPs)。并入CLPs中的preS2-VP7的比例受該兩種病毒相對(duì)感染復(fù)制率影響。對(duì)此嵌合體顆粒所作的免疫電子顯微鏡分析指出preS2抗原決定基曝露于此CLPs的表面。如果用preS2-VP7重組病毒和僅合成VP3蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行共感染，則未鑒別出有CLPs。
高水平BTV嵌合體CLPs的合成為生產(chǎn)大抗原決定基提供了新的手段，由這種CLPs產(chǎn)生的外源抗原決定基的免疫原性在小鼠中得到了證實(shí)。
除了存在作為本發(fā)明的VLPs或CLPs嵌合體蛋白質(zhì)一部分的抗原決定基外，一般的VLPs和CLPs結(jié)構(gòu)又能使其他抗原并入，例如在空中心區(qū)。
利用本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的方法，可生產(chǎn)多效價(jià)疫苗。
利用本發(fā)明方法制備的CLPs和VLPs有著超過(guò)其他方法的一些特殊的優(yōu)點(diǎn)。首先，能大量地進(jìn)行生產(chǎn)，特別是該方法用于提高桿狀病毒載體的表達(dá)能力時(shí)更是如此(例如能以每升培養(yǎng)物20-30mg的量進(jìn)行生產(chǎn)，能在無(wú)血清的培養(yǎng)液中生產(chǎn)，能穩(wěn)定地進(jìn)行冷凍干燥)。第2，鑒于本發(fā)明顆粒的物理性質(zhì)，能使用一般的一步法來(lái)純化(細(xì)胞溶胞物梯度離心法)LCPs和VLPs。第3，可以基本上在無(wú)任何可檢測(cè)出量的外源物如昆蟲(chóng)或桿狀病毒蛋白質(zhì)和RNAs或DNAs的形式下來(lái)生產(chǎn)CLPs和VLPs。第4，使用的純化步驟無(wú)損害足以維持所說(shuō)顆粒的天然構(gòu)象的形態(tài)結(jié)構(gòu)。第5，雖然所說(shuō)顆粒能有效地附于細(xì)胞上并為細(xì)胞所吸收，但能使這些顆粒以不復(fù)制的形式制備。第6，CLPs和VLPs(尤其基于BTV的)能耐受很寬范圍的其他的蛋白質(zhì)序列而不破裂，并能包容多種抗原決定基。最后一點(diǎn)，也是最重要一點(diǎn)，生產(chǎn)的VLPs具有固有的性質(zhì)，在脊椎動(dòng)物宿主中既誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，也誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。
簡(jiǎn)言之，所研制的CLPs和VLPs能傳輸代表病毒抗原決定基的多肽成分以產(chǎn)生保護(hù)性免疫作用。此CLPs和VLPs，尤其是BTV的CLPs和VLPs，是大型多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
它們能并入結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的其他蛋白質(zhì)形式(如嵌合體VP7)，其中包括這些蛋白質(zhì)的其他形式(如VP7a和VP7b)。此外，有可能使用多種蛋白質(zhì)類型來(lái)傳輸抗原(如VP2和/或VP5和/或VP7)。此特征具有重要的意義，例如，減少不應(yīng)答的機(jī)會(huì)設(shè)計(jì)產(chǎn)生免疫性的疫苗應(yīng)優(yōu)選不只基于單病毒序列或抗原，而應(yīng)該包括盡可能多的適用的致免疫序列。為了避免初次接種產(chǎn)生抗BTV應(yīng)答，基于其他BTV血清型的VLPs也能用于連續(xù)免疫接種，這是BTV系統(tǒng)特別有用的特點(diǎn)，這是其他抗原傳輸體系目前尚不能采用的(例如牛痘、脊髓灰質(zhì)炎、T型顆?；蛏抽T(mén)氏桿菌媒介)。
由桿狀病毒載體高水平生產(chǎn)CLPs和VLPs，表明此體系適合作為能使多種外來(lái)抗原傳輸給免疫體系以誘發(fā)細(xì)胞和體液免疫性的載體體系。
根據(jù)本發(fā)明，外來(lái)抗原按能使抗原決定基位于CLPs和VLPs中的內(nèi)位點(diǎn)上的方式，表達(dá)為CLPs和VLPs蛋白質(zhì)成分上的抗原決定基。這能使外來(lái)的抗原在抵達(dá)所希望的位置前都受到保護(hù)不至于發(fā)生蛋白水解和/或不受到抗體的攻擊。用其中的VP7是嵌合體形式的嵌合體VLP即可實(shí)現(xiàn)此目的。
同樣，由于VP3同BTV蛋白質(zhì)的已知的相互作用，形成的這種次要蛋白質(zhì)的嵌合體類似物，也提供了在所得的嵌合體VLPs中于保護(hù)位置上的位點(diǎn)處引入外來(lái)基因的機(jī)會(huì)。
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權(quán)利要求
1.一種顆粒形的包括能相互合作組裝成類病毒顆粒(VLPs)或類病毒核顆粒(CLPs)的多種蛋白質(zhì)的抗原，其特征在于所說(shuō)顆粒包括兩種或多種不同的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)中的每一種蛋白質(zhì)包括由選擇的病毒種的天然蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列，以及所說(shuō)蛋白質(zhì)中的至少一種蛋白質(zhì)是嵌合體并包括由外來(lái)的而非天然蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒形抗原，所說(shuō)抗原由包括兩種基本的蛋白質(zhì)和一種或多種任選的(即可有可無(wú))其他蛋白質(zhì)的CLPs所組成的，其中所說(shuō)的基本蛋白質(zhì)選自病毒主要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)，所說(shuō)任選的蛋白質(zhì)選自次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2的顆粒形抗原，所說(shuō)抗原包括0.1.2或3種其他任選的病毒次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒形抗原，由包括3種基本的和1種或多種任選的(即可有可無(wú))蛋白質(zhì)的VLP組成，其中所說(shuō)基本蛋白質(zhì)中的兩種蛋白質(zhì)是病毒主要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)，所說(shuō)基本蛋白質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)是病毒主要外衣殼蛋白質(zhì)，所說(shuō)任選的蛋白質(zhì)選自次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)和主要外衣殼蛋白質(zhì)。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4的顆粒形抗原，包括0或1種任選的病毒主要外衣殼蛋白質(zhì)。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求4或5的顆粒形抗原，包括0.1.2或3種其他任選的病毒次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)。
7.一種根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的顆粒形抗原，其中所說(shuō)由外來(lái)蛋白衍生的氨基酸序列包括由抗所說(shuō)外來(lái)蛋白的抗體識(shí)別的抗原決定基。
8.一種根據(jù)以上任一權(quán)利要求的顆粒形抗原，其中所說(shuō)外來(lái)蛋白質(zhì)是患病生物體的蛋白質(zhì)，所說(shuō)顆粒形抗原能在易感受所說(shuō)疾病的生物體中產(chǎn)生保護(hù)性抗體或細(xì)胞免疫應(yīng)答。
9.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求的顆粒形抗原，包括天然形的所說(shuō)的不同蛋白質(zhì)中的一種。
10.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求的顆粒形抗原，其中所說(shuō)不同的蛋白質(zhì)只有一種是嵌合體。
11.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求的顆粒形抗原，其中所說(shuō)不同的蛋白質(zhì)包括天然形的所說(shuō)第1和第2蛋白質(zhì)，還包括嵌合形的所說(shuō)第1和第2蛋白質(zhì)中的一種。
12.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求的顆粒形抗原，其中所說(shuō)第1和第2蛋白質(zhì)包括由呼腸孤病毒(Reoviridae)科家族的病毒蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求12的顆粒形抗原，其中所說(shuō)第1和第2蛋白質(zhì)包括由環(huán)狀病毒屬、輪狀病毒或呼腸孤病毒屬蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求12至13的顆粒形抗原，其中所說(shuō)蛋白質(zhì)包括由蘭舌(bluetongue)病毒蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。
15.一種根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的顆粒形抗原，該抗原由包括兩種基本蛋白質(zhì)和一種或多種其他任選(即可有可無(wú))蛋白質(zhì)的CLP所組成，其中所說(shuō)基本蛋白質(zhì)是病毒主要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)VP3和VP7，所說(shuō)任選的蛋白質(zhì)選自次要衣殼蛋白質(zhì)VP1、VP4和VP6。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求15的顆粒形抗原，由下述蛋白組合之一種所組成VP3+VP7VP3+VP7+VP1VP3+VP7+VP4VP3+VP7+VP6VP3+VP7+VP1+VP4VP3+VP7+VP4+VP6VP3+VP7+VP1+VP6VP3+VP7+VP1+VP4+VP6
17.一種根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的顆粒形抗原，其中所說(shuō)抗原由包括三種基本蛋白質(zhì)和一種或多種其他任選蛋白質(zhì)的VLP所組成，所說(shuō)基本蛋白質(zhì)中的兩種蛋白質(zhì)是病毒主要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)VP3和VP7，所說(shuō)基本蛋白質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)是選自VP2和VP5的病毒主要外衣殼蛋白質(zhì)，所說(shuō)任選的蛋白質(zhì)選自次要內(nèi)衣殼蛋白質(zhì)VP1、VP4和VP6及主要外衣殼蛋白質(zhì)VP2和VP5。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求17的顆粒形抗原，該抗原由下述蛋白質(zhì)組合中的一種所組成VP2+VP3+VP7VP2+VP3+VP7+VP1VP2+VP3+VP7+VP4VP2+VP3+VP7+VP6VP2+VP3+VP7+VP1+VP4VP2+VP3+VP7+VP1+VP6VP2+VP3+VP7+VP4+VP6VP2+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6VP5+VP3+VP7VP5+VP3+VP7+VP1VP5+VP3+VP7+VP4VP5+VP3+VP7+VP6VP5+VP3+VP7+VP1+VP4VP5+VP3+VP7+VP1+VP6VP5+VP3+VP7+VP4+VP6VP5+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6VP2+VP5+VP3+VP7VP2+VP5+VP3+VP7+VP1VP2+VP5+VP3+VP7+VP4VP2+VP5+VP3+VP7+VP6VP2+VP5+VP3+VP7+VP1+VP4VP2+VP5+VP3+VP7+VP4+VP6VP2+VP5+VP3+VP7+VP1+VP6VP2+VP5+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6
19.一種根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的顆粒形抗原，其中所說(shuō)蛋白質(zhì)是蘭舌病毒蛋白質(zhì)BTV-VP3和BTV-VP7。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求10的顆粒形抗原，其中所說(shuō)蛋白質(zhì)包括嵌合體BTV-VP7，此嵌合體BTV-VP7包括由天然BTV-VP7衍生的氨基酸序列和由外來(lái)蛋白質(zhì)(非BTV-VP7)衍生的氨基酸序列。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求20的顆粒形抗原，其中所說(shuō)的VLPs或CLPs包括(ⅰ)天然BTV-VP3，(ⅱ)天然BTV-VP7和(ⅲ)嵌合體BTV-VP7及由外來(lái)蛋白質(zhì)(非BTV-VP7)衍生的氨基酸序列。
22.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求的顆粒形抗原，其中所說(shuō)外來(lái)蛋白質(zhì)是人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白質(zhì)或人乙型肝炎病毒(HBV)蛋白質(zhì)。
23.一種生產(chǎn)包含至少一種非天然蛋白質(zhì)的VLP或CLP的方法，此方法包括由包含第1和第2天然病毒蛋白質(zhì)和所說(shuō)非天然蛋白質(zhì)的多種不同蛋白質(zhì)組裝成所說(shuō)的VLPs和CLPs，其特征在于所說(shuō)非天然蛋白質(zhì)是嵌合體且包括由外來(lái)蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列和由所說(shuō)的第1和第2天然病毒蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所說(shuō)的第1和第2不同蛋白質(zhì)包括環(huán)狀病毒屬、輪狀病毒或呼腸孤病毒屬的蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所說(shuō)的第1和第2不同蛋白質(zhì)包括由蘭舌病毒蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所說(shuō)蘭舌病毒蛋白質(zhì)是BTV-VP3和BTV-VP7。
27.一種根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)VLPs或CLPs包括嵌合體BTV-VP7，此嵌合體BTV-VP7包括由天然BTV-VP7衍生的氨基酸序列和由外來(lái)蛋白(非BTV-VP7)衍生的氨基酸序列。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)VLPs或CLPs包括(ⅰ)天然BTV-VP3，(ⅱ)天然BTV-VP7和(ⅲ)包含由天然BTV-VP7衍生的氨基酸序列和由外來(lái)蛋白質(zhì)(非BTV-VP7)衍生的氨基酸序列的嵌合體BTV-VP7。
29.一種根據(jù)權(quán)利要求23-28的任一項(xiàng)的方法，其中所說(shuō)的由外來(lái)蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列位于所說(shuō)嵌合體蛋白質(zhì)的N末端。
30.一種根據(jù)權(quán)利要求23-29的任一項(xiàng)的方法，其中構(gòu)成蛋白質(zhì)被共表達(dá)。
31.一種根據(jù)權(quán)利要求23-30任一項(xiàng)的方法，其中所說(shuō)的表達(dá)系統(tǒng)包括桿狀病毒表達(dá)載體。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求24-31任一項(xiàng)的方法，其中所說(shuō)構(gòu)成蛋白質(zhì)在昆蟲(chóng)或昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)。
33.一種包括根據(jù)權(quán)利要求1有效量的抗原和治療上可接受的載體或稀釋劑的疫苗組合物。
34.一種在需治療的宿主中誘導(dǎo)保護(hù)性致免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給宿主使用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的抗原的給藥步驟。
35.一種根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中將所說(shuō)抗原施用于所說(shuō)宿主的粘膜表面。
36.一種根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所說(shuō)方法為經(jīng)口服給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種顆粒形抗原，其中有外來(lái)的抗原決定基的嵌合體抗原存在于類病毒顆粒(VLPS)或類病毒核顆粒(CLPS)之上或之內(nèi)。此VLPS或CLPS是致免疫的且宜于制備疫苗制劑。
文檔編號(hào)C12N9/78GK1084218SQ9311677
公開(kāi)日1994年3月23日 申請(qǐng)日期1993年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月16日
發(fā)明者P·羅伊 申請(qǐng)人:牛津大學(xué)